このプロトコルは、ラットの同所性左肺移植のための改善された技術を説明し、操作の難しさを軽減し、生存率を改善することに焦点を当てています。
このプロトコルは、ラットの同所性左肺移植のための改善された技術を説明し、操作の難しさを軽減し、生存率を改善することに焦点を当てています。
ラット左肺同所性移植モデルは、肺移植研究に不可欠なツールです。肺移植は複雑な手順ですが、カフ技術の導入により、その複雑さは大幅に軽減されます。ほとんどの外科医はトレーニング後にこの技術を習得できますが、学習曲線が長く、モデルの生存率が低いため、その応用は限られています。これらの問題に対処するために、ドナーの肺の採取、改変、移植など、再現性の高い改良された技術を提案します。従来の方法と比較して、私たちの改善は主にドナー肺の摘出、ドナー肺の改変、およびドナー肺の移植に焦点を当てています。この変更により、手順が簡素化され、操作の難しさが軽減され、再現性が向上します。また、施術中の冷虚血や温虚血の時間が短縮され、移植の成功率がさらに向上しました。私たちの研究は、ラット肺移植モデルに、より効率的で再現性のある技術基盤を提供し、将来の肺移植研究をサポートします。
肺移植は、近年急速に発展している末期肺疾患に対する有効な治療法として、現在唯一の治療法です。現在、世界中で10万件以上の肺移植手術が完了していますが1、肺移植後の5年生存率は54年生存率と10年生存率はそれぞれ32%に過ぎません2。他の固形臓器移植と比較して、肺移植後の生存率を向上させる必要があります3。肺移植後のさまざまな重篤な合併症は、一次移植片機能障害、急性拒絶反応、慢性肺同種移植片機能障害、肺感染症など、レシピエントの生存率に影響を与える主要な要因です4,5。ラット肺移植モデルは、これらの問題を研究するための貴重なツールですが、技術的な問題により、その広範な採用が妨げられてきました。この手順はいくつかの研究所によって報告されていますが、学習曲線が急で、術後合併症率が高く、生存率が低いため、研究者へのアクセスが制限されています。
この研究では、これらの課題を克服するために設計された改良された同所性肺移植技術を紹介します。私たちの方法は既存のプロトコルに基づいていますが、カフの準備、肺門構造の解剖、ドナーの肺固定、最適化された吻合技術など、主要な改良を導入しています。これらの改善により、最小限の機器で1人の外科医が手術を行うことができ、吻合の困難さを軽減し、冷たくて暖かい虚血の時間を短縮し、最終的にはモデルの成功率を高めることができます。このアプローチは、肺移植におけるより堅牢で再現性の高い基礎研究を支援することを目的としています。
すべての動物実験は、Guangzhou Lai'an Technology Co., Ltd.の動物倫理委員会によって承認されています(承認番号G2024129)。実験は、6〜8週齢、体重250〜300gの雄のルイスラットで行われました。ラットは12時間の明暗サイクル(明暗:25ルクス)で飼育され、餌と水に無料でアクセスできました。
1.袖口を準備します(図1)
2. ドナーの肺摘出(図2)
3. ドナーの肺修飾(図3)
4. ドナー肺移植(図4)
肺移植の過程における各ステップの操作時間を30匹のラットに記録しました。カフ調製の時間、ドナー肺の採取時間、冷虚血、および温性虚血を表1に示します。改良した方法により、事前研修後、移植手術の成功率は100%に達しました。この技術は、肺移植後の合併症に関するその後の研究を支援することができます。私たちはこの技術を2年以上使用しています。次の図は、カフ作成(図1)、ドナー肺抽出(図2C)、ドナー肺修飾(図3)、ドナー肺移植(図4)、手術結果の評価(図5)までのプロセスを示しています.同系移植から6ヶ月後に、レシピエントに対してCTイメージングと病理評価を行いました。移植された肺の換気は、CT画像で良好であり、偽手術群(肺移植を伴わない開胸術のみ)と同様であることがわかりました。偽手術群と自家右肺の間でex vivo肺の肉眼的外観に有意差はなく、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色結果に明らかな病理学的変化は見られませんでした。要約すると、私たちのラット左肺同所性肺移植は成功し、この技術の成熟は、肺移植後の他の疾患モデルの構築の基礎を築きました。

図1:カフの準備 (A)IVカニューレとカフカッティングブレードのサイズの違い。(B)倍率5倍。顕微鏡でカフをカットします。スケールバー= 1 mm.(C)PA(16 G)、PV(16 G)、およびBr(14 G)用の袖口。略語:IV =静脈内;PA = 肺動脈;PV = 肺静脈;Br =気管支。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ドナーの肺摘出。 (A)ドナーの気管内挿管。(B)ドナー肺灌流。(C)きれいな灌流ドナー肺を氷の上に置きます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ドナーの肺修飾 (A)PAを空けます。(B) Brをフリーにしてライゲート (C) PVをフリーにする (D-F) PA、Br、PVを連続してカフに固定します。すべての顕微鏡画像は、5倍の倍率で撮影されました。スケールバー= 1 mm。略語:PA =肺動脈;PV = 肺静脈;Br =気管支。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ドナーの肺移植 (A) レシピエントはサーモスタット手術台に固定された。胸壁が開かれました。そして、左肺を引っ込めて切開部に固定しました。(B)肺門構造を解放し、ブロックします。(C)事前に結ばれた外科用結び目。(D)PA、Br、およびPVの遠位端に小さな切開を行います。(E)ヘパリン化生理食塩水で洗い流します。(F,G)PA、Br、および PV の順番の吻合。(H)止血クリップを開いて、換気と血液循環を可能にします。(I) レシピエントの左肺の切除。(J) ドナーの肺を胸腔に戻します。(K)チェストを閉じます。(L)受信者が目を覚ますのを待っています。すべての顕微鏡画像は、5倍の倍率で撮影されました。スケールバー= 1 mm。略語:PA =肺動脈;PV = 肺静脈;Br =気管支。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:移植後の評価。 偽手術群は、移植を行わずに開胸術のみを受けました。CT画像検査とサンプルの病理学的評価は、6か月後に実施されました。移植群は同系移植を受け、6か月後にCT画像検査と病理評価を受けました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| プロシージャ | 動作時間(分) |
| カフの準備 | 3.2±0.38 |
| ドナー肺収穫 | 9.85±0.60 |
| 寒冷虚血 | 296±277日 |
| 温かい虚血 | 12.62±2.35 |
表1:各手順の操作時間。 カフの準備:3つのカフ(PA、PV、およびBrのカフを含む)を作成するのにかかった合計時間、ドナー肺収穫:ドナーからドナー肺を取り外すのにかかった時間。冷性虚血:ドナーの肺が氷上に保持される期間。温性虚血:ドナーの肺を氷から取り除いてから再灌流するまでにかかる時間。略語:PA =肺動脈;PV = 肺静脈;Br =気管支。
ラット肺移植モデルは、肺移植の基礎研究の分野で一般的に使用されるモデルです。それはよく人間の肺移植の病態生理学的プロセスをシミュレートすることができます。ラットには、繁殖が速く、コストが安いという利点もあります。水田ら6 は、1989年に初めてカフ技術を使用して、このモデルの難易度を大幅に下げました。しかし、操作が複雑なため、多くの研究者はまだ躊躇しています。
カフの準備の過程で、ほとんどの研究者は同様の形状のカフスを作りました。Wu et al.7 は、吻合過程で結び目が滑るのを防ぐために、袖口の中央にくぼみを作りましたが、吻合を行うには2人が必要であり、これにより人件費と材料費が確実に増加するでしょう。一部の研究者はまた、カフの尾部を滑らかにするために修正しましたが、彼らはカフをレシピエントに埋め込む前にカフの尾部を取り除かなかったため、カフがレシピエント内で血管や気道をねじったり折りたたんだりしやすかったのです。
カフサイズの選択に関しては、以前の研究では、レシピエントの体重が270g未満の場合はPAに18Gカフを使用し、レシピエントの体重が270gを超える場合は16Gカフを使用すべきであることが示唆されています9。一部の研究者はまた、18Gカフ7,10を均一に使用しています。ドナーの肺の修飾に関しては、Tian et al.8 は、ドナーの肺を自己設計の培養皿に入れて肺血管と Br を固定し、カフへの固定を促進しました。ただし、この方法では特別な血管クランプが必要であり、ドナー肺の冷虚血時間を短縮する利点はありません。レシピエントの吻合プロセスでは、最近の研究では振り子吻合法が報告されています8。ただし、この方法には、機器や機器に対する厳しい要件があります。初心者は、いくつかの主要な機器を入手するのが難しく、吻合プロセス中の高張力による長い吻合時間や血管の裂傷のリスクに直面することがよくあります。
一部の研究者は、吻合プロセス中に最初にPV吻合を行います。彼らは、PV吻合が最も難しいステップであると信じています。最初にPVを吻合することで、ドナーの肺が動くのに十分なスペースを確保できます。ただし、PVはBrやPAよりも硬いため、BrとPA10を吻合するときにPVカフが脱落したり、静脈が裂けたりするリスクがあります。一部の研究者は、右半仰臥位8,11または仰臥位を使用して、吻合中の緊張を緩和しようと試みました。しかし、右胸部にパッドを入れる方法は、気管内チューブの角度を変えて気道圧を上昇させる7。上記の研究者は、カフの製造、ドナー肺の改変、およびドナーの肺移植において革新を遂げました。このモデルは多くの研究者によって改良されてきましたが、広く推進され、適用されていません。
私たちの研究では、研究者がこのモデルをより迅速に習得できることを期待して、カフの生成、ドナーの肺の修正、およびドナーの肺の移植を改善しました。PAカフとして16G静脈留置針カニューレを選んだのは、16Gカフはより強靭な動脈に容易に吻合でき、カフ内に十分なスペースがあり、良好な血流を確保するためです。18GカフはレシピエントPAの内径よりも大幅に小さいため、これはスムーズな血流を助長せず、吻合プロセス中にカフが小さすぎてレシピエントのPA壁との間の十分な摩擦が不足しているため、吻合が難しくなり、カフが滑りやすくなります。
BrカフとPVカフのサイズの選択に関して、ほとんどの研究者は比較的一貫した意見を持っています。Br吻合部閉塞の発生を最小限に抑えるために、選択されるBrカフはできるだけ大きくする必要があることは注目に値します。カフの処理では、Hiroaki et al.6はカフの表面にいくつかの切り込みを入れて摩擦を増大させ、一部の研究者はテールのないカフを使用した12,13。私たちの研究では、止血鉗子による固定を容易にするために、尾付きのカフが使用されました。PA、Br、PVを固定した後、尾翼を取り外した。この方法により、PA、Br、PVをカフに固定する手間を省くことができ、吻合後のレシピエントのカフテールの動きによる血管やドナーの肺の損傷を防ぐことができます。
ドナー肺の修飾中、複雑な解剖学的構造は、ドナー肺の冷虚血時間を増加させます。この研究では、ドナー肺の表面と底部を事前にトリミングされた滅菌レンズペーパーで覆い、ドナー肺を滅菌培養皿に載せた後、氷上に置いて改変しました。ドナーの肺の表面を覆う滅菌レンズペーパーを、予冷した生理食塩水でわずかに浸しました。これにより、ドナー肺の湿潤が確保され、ドナー肺が鉗子によって損傷を受けるのを防ぐだけでなく、肺門構造を分離する際に左右の肺の位置を調整するための十分な摩擦を提供し、肺門の解剖学的構造を完全に露出させ、PA、Br、およびPVをドナー肺の背側から迅速に分離します。以前の研究では、ガーゼはドナーの肺の表面に置かれました7,10,14。ガーゼの中央に大きな隙間があるため、分離プロセス中にドナーの肺が鉗子によって簡単に損傷を受け、最終的には気胸につながりました。私たちの方法は、PA、Br、PV、およびその他の構造を迅速に解放し、ドナー肺の冷虚血時間を短縮することができます。
ドナーの肺移植段階では、レシピエントの左肺を胸部前部に固定すると、レシピエントの解剖学的構造により密接に整列します。ドナーの肺とレシピエントの血管および気管支との間の吻合部の緊張を大幅に軽減し、手術の困難さと術後合併症のリスクを軽減しました。さらに、後胸部空間は比較的大きいため、手術器具の操作やドナー肺の移植が容易になります。対照的に、以前のほとんどの研究では、レシピエントの左肺を背側に固定していました7,8,12。このアプローチでは、吻合プロセス中により大きな緊張が発生し、手術の困難さと術後合併症のリスクが高まります。さらに、前胸腔内の手術スペースが限られているため、手術器具の柔軟性が制限される可能性があります。
最後に、このアプローチでは、レシピエントの肺を広範囲に収縮させる必要があり、機械的損傷のリスクが高まる可能性があります。さらに、吻合前のレシピエントの左肺を保持し、その上にプラットフォームをトリミングしました。これにより、ドナー肺のより良い配置と吻合中のその位置の調整が容易になりました。以前の研究では、レシピエントの肺断端は吻合前に完全に除去され、PA、PV、およびBrは固定用の器具で固定されていました15、これは血管の裂傷を簡単に引き起こす可能性があります。吻合の前に、血栓を除去し、血栓塞栓性合併症を予防するために、血管洗浄にヘパリン化生理食塩水を使用する必要があります。これは、多くの先行研究で報告されています7,10,16。しかし、多くの研究者は、吻合プロセス中に気泡が容易に導入され、空気塞栓症につながる可能性があるという事実に注意を払っていません。当院では、細い綿棒を使用して、レシピエントの血管やドナーカフから大きな気泡を取り除き、空気塞栓症を効果的に予防します。小さな気泡は吸収でき、大きな問題を引き起こすことはありません。
吻合術では、肺動脈(PA)が最初に対処され、次に気管支(Br)が対処され、肺静脈で終わります。このシーケンシャルアプローチは、PAの優れた弾力性により戦略的に採用され、その後の静脈吻合中の過度の張力によって引き起こされる血管損傷やカフの変位のリスクを最小限に抑えます。PVまたはBrのいずれかの一次吻合は、血管または気管支の裂傷、および緊張関連の合併症によるカフの移動の素因となる可能性があります。体系的なトレーニングプロトコルと反復的な練習を通じて、この最適化されたシーケンスは、技術的な複雑さを軽減し、手術の成功率を向上させる上で大きな利点を示しています。特に、私たちのアプローチは100%の吻合成功率を達成し、同等の研究で報告された結果を上回っています。移植手順中、オペレーターは片手で切開部の端を引っ込め、ドナーカフをレシピエント内腔に挿入し、片手で結び目で固定するだけです。この技術は、片手で固定と結び目を作ることができるため、人員を大幅に削減し、手術の効率を高めます。したがって、私たちの研究は、ラット左肺同所性移植の方法を改善し、外科手術の時間と困難を減らし、このモデルの再現性を改善しました。
この研究は、中国国家自然科学基金会(助成金第82470103号)、呉傑平医学基金会特別研究助成金(第320.6750.2025-01-1号)、中国医学教育協会(助成金番号)の支援を受けました。ZJWYH-2023-YIZHI-003)、呼吸器疾患の州重点研究所の臨床疫学研究プロジェクト(助成金番号。SKLRD-L-202504)、広州臨床特性技術プロジェクト(Grant No. 2023C-TS10)、および広州医科大学の研究能力強化プログラムに基づく主要な臨床研究プロジェクト(Grant No.GMUCR2024-01007)。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9%生理食塩水 | ホープバイオ | HBPP008-100 | |
| 10cm滅菌ペトリ皿 | ベックマン | 10cmプラスチック製ペトリ皿 | |
| 16 G 気管挿管ガイドワイヤー | ベガ | - | |
| デュモン細い鉗子 #7-カーブ/11.5 cm | F.S.T.の | 11271-30 | |
| アイハサミ 10cmストレートシャープ | ジンジョン | Y00030 | |
| 止血(湾曲した全歯)鉗子 | ジンジョン | J31180 | |
| ヘパリンナトリウム溶液 | Leagene | R10119 | |
| イントロカン針 14 G バタフライ針 | B.ブラウン | 4254210B | |
| イントロカン針 16 G バタフライ針 | B.ブラウン | 4254171B | |
| LEDデュアルファイバー冷光源ランプ | RWDの | 76312 | |
| レンズクリーニングペーパー | キンバリー | 34155 | |
| ルイスラット | Guangzhou Dean Gene Technology Co., LTD. (中国・広州) | ||
| 医療用綿棒 | 受賞者/ウェンジアン | 10cm×50個 | |
| 医療用ニードルホルダー | 成河 | - | |
| 医療用滅菌シリンジ | 受賞者/ウェンジアン | 20ミリットル | |
| 医療用外科用ハサミ 12.5 cm ストレートシャープ | プールン | PL1251 | |
| 医療用テープ | ウェンシェン | 1527 | |
| 医療用組織鉗子 | RWDの | J30607 | |
| 医療用チタン製まぶたレトラクター | ユディカン | - | |
| マイクロカーブ鉗子 | ジンジョン | JzCrWA3050 0.3/140 mm | |
| 微小血管止血鉗子 12.5 cm 湾曲 | ジンジョン | W40350 | |
| 微小血管止血鉗子 12.5 cm ストレート | ジンジョン | W40340 | |
| マイクロCT | ピンセン | SNC-100 | |
| ミニチュア血管クリップ | F.S.T.の | 18055-06 | |
| マルチチャンネル小動物麻酔機 | RWDの | R550 | |
| 脳神経外科用凝固キット、凝固キット | F.S.T.の | 18010-00 | |
| ペントバルビタールナトリウム | シグマ | P3761 | |
| 尖った綿棒 | 他 | 1000個 | |
| ラット/マウス挿管プラットフォーム | プシン | - | |
| ラット/マウスウォーターバスシステム(術中)10-65度;C温度制御、310 x 290 MM、220 V | 華陽 | 36-0041 | |
| 上海ゴールデンベル医療用顕微鏡鉗子 顕微鏡細い鉗子 ストレートベンドマイクロハンド手術器具 顕微鏡器具 | ジンジョン | WA1020 | |
| 上海浦東Jinhuan医療吸収性外科用縫合糸針移植リフト付き滅菌縫合糸(4-0) | 上海浦東金環 | 473445 | |
| 小動物用人工呼吸器 | ケント・サイエンティフィック | ローベントJr | |
| 小動物用ウォーターバス断熱システム | 華陽 | TG-TP-BLの | |
| スプリングハサミ(大) | ジン・ジョン | JZCrWA1020 | |
| ステンレス製医療用蚊取り鉗子 | ジアテ | LZ1021 | |
| スチールフラットハンドル湾曲無歯0.3歯 | Zhenbang(医療) | 結ぶためのフック/プラットフォーム付き歯付き | |
| スチールフラットハンドルストレート無歯0.3歯 | Zhenbang(医療) | 結ぶためのフック/プラットフォーム付き歯付き | |
| 滅菌コットンボール | ボシェンティアナイ | 小さいサイズ | |
| 滅菌ガーゼ | ヒザーン | 6cm×8cm | |
| 針付き縫合糸 | 霊橋 | 8-0 | |
| 針付き縫合糸 | 霊橋 | 6-0 | |
| ピンセット Dumont #5 鉗子、ストレート | F.S.T.の | 11254-20 | |
| 超軽量粘土 | ボキー | CQNT-24 | |
| 血管クランプホルダー | RWDの | R34001-14 |