酵素破壊中のエマルジョン液滴間のリアルタイム力測定

サマリー

このプロトコルでは、デュアルトラップ光ピンセットを使用して、エマルジョンの酵素消化中に液滴間の力をリアルタイムで測定します。エマルジョンの安定性と液滴ダイナミクスの研究を容易にし、食品科学や医薬品への応用が可能です。

要約

このプロトコールは、デュアルトラップ光ピンセットを使用して、エマルジョンの安定性と酵素消化中のエマルジョン液滴の動的崩壊を調査するための独自の方法論を導入しています。このプロセスには、エマルジョンの調製、酵素の導入、および液滴間の力をリアルタイムで監視するための力測定システムの構成が含まれます。デュアルトラップ光ピンセットを用いることで、エマルジョン液滴の精密な操作と観察が可能となり、酵素崩壊時の液滴間の力測定が容易になります。この実験手法は、消化中のエマルジョンの相互作用と安定性に関する重要な洞察を提供し、特に食品科学、製薬、および有機エマルジョンを含むその他の業界の研究に関連しています。この方法は、さまざまな光ピンセットのセットアップやさまざまな種類のエマルジョンや酵素に適応し、適用可能であり、さまざまな分野で機械的特性や崩壊プロセスを探求するための汎用性の高いツールとして機能します。さらに、この視覚的アプローチは、力のダイナミクスをリアルタイムで監視できるという利点を提供し、さまざまなアプリケーションでのエマルジョンの挙動を研究するための新しい道を開きます。

概要

エマルジョンは、2つの非混和性液体からなる不均一系であり、一方の液体が他方の液体内に液滴として分散します。これらのシステムは、食品、医薬品¹、化粧品、石油化学など、さまざまな業界で広く普及しています。エマルジョンの安定性と機能性は、液滴間の相互作用に大きく依存しており、液滴は表面化学、環境条件、酵素の存在などのさまざまな要因の影響を受ける可能性があります²。

多くのアプリケーション、特に食品科学や薬物送達において、エマルジョンは酵素環境にさらされます^3,4。例えば、ヒトの消化器系では、摂取したエマルジョンベースの食品や医薬品は、その構造や機能を変化させる可能性のあるさまざまな酵素に遭遇します。酵素消化中の液滴相互作用のダイナミクスを理解することは、安定した効果的なエマルジョンベースの製品を設計するために重要です^5,6。

光散乱やレオロジー測定など、エマルジョンの安定性を研究する従来の方法^2,7は、貴重なバルク情報を提供しますが、個々の液滴⁸間の相互作用を直接観察および定量化することはできません。この制限は、エマルジョンの酵素消化中に発生するマイクロスケールのプロセスの理解を妨げてきました。

光ピンセットは、微視的な物体を操作し、マイクロスケールおよびナノスケールで力を測定するための強力なツールとして登場しました⁹。光の勢いを利用することで、光ピンセットは個々の液滴を非常に高い精度で捕捉し、移動させることができます。この能力は、複雑な環境における液滴間相互作用を研究するための新たな可能性を開く^10,11。

このプロトコルは、デュアル光ピンセットとリアルタイムの力測定を組み合わせて、酵素消化中のエマルジョン液滴間の相互作用を調査する独自の方法を提供します。代表例として、この方法は、菜種油またはホエイタンパク質によって安定化された1つの脂肪滴からなるエマルジョンシステムを使用して実証され、トリプシンによる消化を受けます。このモデルシステムは、一般的な食品エマルジョンとその消化管での挙動を模倣しているため、食品科学と栄養学に特に関連性があります¹²。

このアプローチにより、個々の液滴が酵素分解を受ける際の個々の液滴間の力を直接観察および定量化することができ、消化条件下でのエマルジョン安定性のダイナミクスに関する前例のない洞察が得られます。この方法では、最先端のデュアルトラップ光ピンセットのセットアップである光ピンセットシステムを使用して、エマルジョン液滴を操作し、液滴間の力を高精度で測定します¹³。

この実験技術は、バルクエマルジョン研究と分子レベルの研究との間のギャップを埋め、酵素消化中のエマルジョンの挙動に関する独自の視点を提供します。この手法から得られる知見は、食品工学、医薬品製剤、基礎コロイド科学など、さまざまな分野に広範な影響を及ぼします。例として特定の油-タンパク質-酵素系が使用されていますが、ここで紹介する方法論は、さまざまな産業の有機エマルジョン系や消化酵素の研究に応用することができます。

プロトコル

図1 は、デュアルトラップ光ピンセットの液滴トラップの概略図を示しています。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. ホエイプロテインディスパージョンの調製

1. 脱イオン水に5%(w / v)ホエイタンパク質分散液を調製します。
   1. 電子天びんを使用して、2.5gのホエイプロテインパウダーを正確に計量します。
   2. メスシリンダーを使用して、47.5mLの脱イオン水を測定します。
2. 材料を組み合わせます。
   1. 秤量したプロテインパウダーと計量した水をビーカーに移します。
   2. ビーカーにマグネチックスターバーを追加します。
3. ビーカーを密封します。
   1. ビーカーをシーリングフィルムで覆い、蒸発や汚染を防ぎます。
4. 分散液を混ぜます。
   1. ビーカーをマグネチックスターラーに置きます。タンパク質粉末が完全に溶解し、溶液が均一に分散するまで、攪拌速度を1500rpm(図2A)に設定します。
5. タンパク質を水和する
   1. ホエイプロテインの完全な水和を確保し、泡立ちを最小限に抑えるには、エマルジョン調製の1日前に分散液を調製してください。
   2. 5%ホエイプロテイン分散液を室温で一晩混合します。
      注意: タンパク質の分散に影響を与えないように、すべてのガラス器具と調理器具が清潔で汚染物質がないことを確認してください。
      注:一晩の水分補給ステップは、最適なタンパク質機能とエマルジョンの安定性にとって重要です。この手順を省略すると、乳化効率が低下する可能性があります。このプロトコールセクションでは、その後のエマルジョン調製で菜種油滴を安定化するために使用されるホエイタンパク質分散液を調製するための最初のステップを概説します。次のステップには、通常、水中油型エマルジョンの調製、光ピンセット実験のセットアップ、および消化研究のためのトリプシンの導入が含まれます。

2. 水中油型エマルジョンの調製

1. 処方を最適化します。
   1. 15%の油と85体積のタンパク質溶液を混合してエマルジョンを調製し、タンパク質と脂質の質量比が0.3になるようにします。
2. 脂質相を準備します。
   1. 菜種油は室温で液体です。後で使用するために、30 mLの菜種油を遠心分離チューブに加えます。
   2. 乳脂肪は室温で固体です。乳脂肪を約5スクープ取り、遠心分離管に入れます。
   3. チューブをビーカーに入れ、ビーカーに約40mLの脱イオン水を加えます。
   4. デジタル加熱プレートを使用してビーカーを42°Cに加熱し、この温度を30分間維持して、完全に溶融するようにします(図2B)。
      注:乳脂肪の融点は約30°C〜40°Cです。 実験室の温度は26°Cに維持されています。 溶けた乳脂肪は一定期間液体のままでいることができますが、放置すると室温で徐々に固まります。
3. 材料を組み合わせます。
   1. 5 mLの遠心チューブに、0.6 mLの油(菜種油または溶かした乳脂肪)と調製したホエイタンパク質溶液3.4 mLを加えます。
4. エマルジョンを均質化します。
   1. 高せん断ミキサー(HSM)を使用します。速度を25,000rpmに設定し、5分間混合します(図2C)。
   2. 必要に応じて、粗いエマルジョンを高圧ホモジナイザーに通します。典型的な条件:500-1000バールの圧力で2-3パス。
5. エマルジョンを希釈します。
   1. エマルジョンを1:1000に希釈して調製します。ピペットを使用して元のエマルジョンの4μLを測定します。これを3996μLの脱イオン水に加えます。均一に希釈するためによく混ぜます。

3.光ピンセットの初期設定

1. マイクロ流体フローセルを準備して清掃します( 材料の表を参照)。
   注:このデバイスには、6つのマイクロ流体チャネルが装備されています。この実験では、 図 3B の左端のチャネルのみを使用して、1 つのチャネルを使用します。
   1. マイクロ流体チャネルを準備するには、必要なすべての機器と流路を清掃します。すべての機器を脱イオン水で十分にすすぎ、残留物が残らないようにします。
   2. 洗浄するには、必要なチャネルをエタノールで洗い流します。流量を1.0バールに設定し、エタノールで洗い流します。実験の1時間前に、ウシ血清アルブミン(BSA)をフローセルにフラッシュします。BSAは、表面上に「ブロッキング」層を形成し、エマルジョン液滴や他の生体分子の非特異的吸着を低減します。
2. 調製したエマルジョンを実験チャネルに流します。
3. 実験前に装置を準備してください。
   1. 光ピンセット装置を開きます。
   2. 下対物レンズに約70μLの脱イオン水を加えます。
   3. 「カチッ」という音がするまでサンプルチャンバーを挿入します。
   4. サンプルチャンバーの上に浸漬油を一滴垂らします(図3C)。
   5. コンデンサーレンズを、サンプルチャンバーの上面に軽く触れるまでゆっくりと下げます。
   6. レーザーをオンにする前に、光ピンセット装置を閉じてください。レーザーは1064nmで動作します。
4. Z平面の位置を特定し、光路を調整します。
   1. レーザーをオンにして、電源を100%に設定します。
   2. 光ピンセットシステムの下部ノブ(図3A)を調整して、レーザースポットを特定します。下から上へ移動(時計回りに調整)し、レーザースポットを3回観察します。レーザースポットの2番目と3番目のセットの間にZ平面を設定します。
      注:レーザーがフローセルの下面、下部カバースリップの上面、および上部スライドガラスの下面にレーザーが集束すると、3セットのレーザースポットが表示されます。レーザーは、カバーガラスの上面とスライドガラスの下面との間に集束する必要があります。
   3. レーザー出力を30%に下げます。
   4. 7 から 11 の干渉縞が画面に表示されていることを確認します(図 3E)。数値が高すぎたり小さすぎたりする場合は、下のノブを調整します。
      注:干渉縞の数は、コンデンサーとフローセルの間の間隔の最適化を反映しています。7〜11フリンジの範囲で、コンデンサーは十分な光を効果的に捕捉し、機械的応答などの測定信号の良好な信号対雑音比を確保します。また、この間隔は安全な距離を保つことで、レンズがフローセルに接触するのを防ぎ、光路散乱や反射干渉を低減します。
5. 流路を調整します。不要なチャネルを閉じ、必要な実験チャネルのみが開いていることを確認します。
6. レーザー出力を設定します。通常、液滴を捕捉するにはレーザーを100%に設定しますが、特定の実験条件に必要な強度に調整します。
7. データストレージを設定します。実験データをすぐに取得できるように、ファイル保存ディレクトリを設定します。

4. エマルジョンの力-距離曲線の測定

1. 流量を0.5バールに設定します。液滴が画面上に約5秒間表示されます。次に、[ Vacuum ]を選択して流れを停止し、チャネルバルブを閉じます。
2. 液滴を捕らえます。
   1. ジョイスティックを使用して、チャネル内の同様のサイズの2つの液滴をキャプチャします。正常に捕捉された液滴の概略図を 図4に示します。
   2. 2つの液滴間の距離を約10μmに調整します。テザーが形成されると、力の顕著な変化が観察されます。
   3. 右オプティカルトラップのx位置とy位置、および左オプティカルトラップのy位置を固定します。2つの液滴をそれぞれマゼンタと緑のボックスでマークします。
3. パワースペクトル密度(PSD)を測定します。
   1. [キャリブレーション]メニューに移動します。
   2. 左側の画面で、[ 測定] を選択します。騒音レベルが過度の場合は、満足のいく結果が得られるまで測定を繰り返してください。
   3. [適用] を選択して、キャリブレーションを確定します。
4. 元のデータをクリアし、力-距離を測定します。
   1. この段階では、ジョイスティックは左の光学トラップのみを制御する必要があります。距離がゼロになるまで、左のトラップを一定の速度(1.0μm / s)で右の液滴に向かってゆっくりと動かします。この手順により、必要な力-距離曲線が得られます。
5. データを選択して保存します。
   1. マウスの左ボタンを使用して、10 μmの液滴分離から0 μmまでの対象データ間隔を選択します。0 μmの距離では、測定された力は通常、最大値に達します。
6. 選択したデータを保存します。
   1. 右クリックして、選択したデータセグメントを初期フォルダディレクトリ に保存します 。

5. トリス緩衝液およびトリプシン溶液の調製

1. トリス緩衝液は、11.860 g/L トリス塩基、0.735 g/L 塩化カルシウム二水和物(CaCl₂・2H₂O)、8.766 g/L 塩化ナトリウム(NaCl)の組成で調製します。最終容量を100mLに調整します。最初に塩酸(HCl)を使用してpHを約8.4に調整し、pHテストストリップを使用して最終的なpHを確認します。
2. トリプシン溶液を調製するには、100 mgのトリプシン1:250(ブタの膵臓に由来)を1000 mLのトリスバッファーに溶解します。マグネチックスターラーで4°C、500rpmで15分間撹拌します。その後、溶液を4°Cで15分間遠心分離します。

6. トリプシンの行為および動的検出方式

1. エマルジョンにトリプシン溶液を加えます。
   1. 0.5μLから10μLの範囲のピペットを使用して、トリプシン溶液の4μLを引き出し、調製した4mLエマルジョンに慎重に加えます。
2. リアルタイムの動的監視を実行します。
   1. トリプシン溶液の添加後、光ピンセット技術を使用してエマルジョンを動的にモニターします。測定は10分ごとに行われ、最初の測定はトリプシン溶液の添加の10分後に行われます。

7. データ処理

1. 実験データを.h5形式で取得し、データ処理環境を使用して必要なフォーマット変換を行い、表形式のデータファイルを作成します。変換されたファイルは 2 つのセクションで構成され、それぞれ Force データと Distance データを記録します。
2. 曲線近似手法を使用してこれら 2 つのセクションのデータを近似し、結果の近似曲線を視覚的にプロットして、さらに分析します。

結果

本研究では、菜種油とホエイプロテインを含むエマルジョン、および乳脂肪とホエイプロテインを光ピンセットを用いて分析しました。まず、2つのエマルション間の力と距離の関係を測定して、ベースラインデータを確立しました(図5A-F)。次に、トリプシンを各エマルジョンに添加し、力と距離の関係を10分ごとに再測定しました。

図5は、トリプシンを含まない2つのエマルジョン液滴の力-距離(FD)曲線を示しています。液滴間の距離が減少すると、相互作用する力は非線形に増加し、液滴が接触するとピークが生じます。トリプシンを添加しない場合、ピーク力は液滴の直径と密接に関連しています。液滴が大きいほど、相互作用力が高くなります。例えば、 図5C の液滴の直径は約8μmで、相互作用力は100pNを超えています。直径が約3μmの小さな液滴は、

ディスカッション

この方法論の中核となる革新は、デュアルオプティカルトラップとリアルタイムの機械的監視技術(図3A)の同期動作にあり、シングルドロップレットレベルでの高精度の動的分析を可能にします。この方法は、デュアル光ピンセットを使用して2つの液滴を独立して捕捉し、それらの分離を最初の10μmの距離に正確に調整することにより(ステップ4.2.2を参照)、単一の液滴を操作するという従来の制限を克服します。 図1 は、液滴の捕捉と操作に使用されるデュアル光ピンセットの原理を示しています。酵素消化中、10分間隔で取得されたリアルタイムのFD曲線測定(ステップ6.2.1を参照)により、界面力学のダイナミックな進化が明らかになり(図6 および 図7)、従来のエンドポイントアッセイではアクセスできなかった一過性反応速度論を捕捉します

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Bluelake	LUMICKS、オランダ		ピンセット制御ソフトウェア
CaCl2.H4O2
ドームLEDデジタル加熱プレート撹拌機	SCILOGEX	SCI280-Pro
電子天びん	Shanghai Hengping Instrument Co., Ltd	FA1204
HCl
高速ホモジナイザー	Ningbo Kemai Instrument Co., LTD	KM-S10
浸漬油
光誘導渦混合装置	Shanghai HUXI Industrial Co., LTD	Vortex-5S
Microsoft Office Excel	Microsoft
脂肪	SM Mlekovita	Maslo Klarowane
NaCl
光ピンセットプラットフォーム	LUMICKS、オランダ	m-trap
Origin ソフトウェア	Origin Lab	2024	力と距離のフィッティング曲線を描くには
ピペットガン	Eppendorf	10 μL、100 &L、1000 & ミュー;L
菜種油	バンジ ポルスカ Sp.z o.o.	Kujawski
シーリングフィルム	パラフィルム	4IN*125FT
トリス
プシン	Sangon Biotech	A100458-0010	プシン1:250、ブタ膵臓由来ホ
エイプロテイン濃縮物	SM ムレコビタ	WPC