Ovoに位置 患者由来急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の異種移植 (PDX-ALL)

ひよこの絨毛尿膜(CAM)は、孵化後の受精後7日目に形になり始め、12日目までに完成します。CAMは、血管新生^{1およびがん}細胞^{2、3、4、5、6、7、8、9、10}、特に血液関連^がん細胞11の生着に適したin vivoモデルとして脚光を浴びています、それは本質的に免疫不全であり、血管新生がよく発達しているためです。さらに、CAMは、コラーゲン、インテグリンαVβ3、フィブロネクチン、ラミニン、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP-2)¹⁰を含む多くの細胞外マトリックスタンパク質を運ぶため、腫瘍の浸潤と転移を調査するための望ましいシステムでもあります。

急性リンパ芽球性白血病 (ALL) は、未熟な B リンパ球と T リンパ球の急速な増加を特徴とする骨髄および血液のがんです。これは最も蔓延している小児がんであり、小児のがんによる死亡の主な原因です。ALLは罹患した小児の>85%で治癒可能ですが、成人と乳児の治癒率はかなり低く、再発/難治性ALLの5年生存率は<10%です¹²。したがって、再発または難治性の ALL を予防または阻止するための新しい治療戦略の開発が緊急に必要とされています。マウスやラット¹³など、多くの異種移植モデルが開発されていますが、これらの方法は時間(数か月など)と費用がかかり、包括的な倫理規制が必要です。新しいALL治療に対する満たされていない臨床ニーズに対処するには、基本的な in vitro 研究を延長するのに適した、再現性があり、時間的で費用対効果の高い動物モデルの開発が不可欠です。

この研究では、患者の B 細胞および T-ALL 細胞の 3D 血管コロニー形成を確実に生成する卵 内 異種移植プロトコルの確立に成功したことを報告し、これは ALL の進行を止める可能性のある新しい治療法の設計と、ALL 治療の結果とリスクの予測ツールの開発に使用されます。

実験は、カルガリー大学の倫理委員会 (REB15-1143; すべての被験者からインフォームド コンセントが得られた場合) およびアルバータ州がん委員会の健康研究倫理委員会 (HREBA.CC-17-0108_REN8)です。診断時(治療開始前)に循環芽球(骨髄だけでなく血液にも芽球)を有するALL患者が研究に含まれました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1.卵の孵化

1. 受精鶏卵を調達します。輸送中または割れ手順中に損傷した卵の数を考慮するために、必要以上に~10%多くの卵を入手してください。
2. 受精卵は生存率を失うことなく12°Cで最大2週間保存します。
3. 卵を39°Cの加湿(~50%-60%)ローリングインキュベーターに移します。
4. インキュベーターで卵を10dpf孵化させます。1日目は、卵がインキュベーターに移されたときに始まることに注意してください。

2. ALL患者の血液サンプルからの急性リンパ芽球性白血病細胞の単離

1. 前述のように細胞を単離します^14,15。
2. B-およびT-ALL患者から10 mLの末梢血(または骨髄)をヘパリン化試験管に採取します。
3. 血液サンプルを滅菌50mL遠心分離管に移し、137 mMのNaCl、2.7 mMのKCl、10 mMのNa2HPO4、および1.8 mMのKH₂PO₄を含む2容量の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回希釈します。
4. 希釈した血液サンプルを1容量の密度勾配培地に1容量重ね、ブレーキなしで室温で300 x g で30分間遠心分離します。
5. 界面から単核細胞(MNC)のバフィーコート層を収集し、滅菌ピペットを使用して新しい滅菌15mLチューブに移します。
6. 10 mLの1x PBSを加え、300 x g で5分間遠心分離して、残りの血清成分を除去します(このステップを2回繰り返します)。
7. 2 mLの0.8%NH₄Clを細胞ペレットに加え、穏やかにボルテックスし、室温で5分間インキュベートし、300 x g で5分間スピンして赤血球を溶解します(必要に応じて、このステップを繰り返します)。
8. ステップ2.6で説明するように、細胞を1x PBSで洗浄します。
9. 10%FBSを含むRPMI 1640に細胞を再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。
10. トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率を評価します。
11. 細胞を凍結培地(FBSでは10%DMSO)に再懸濁し、-80°Cで凍結し、液体窒素に保存します。

3. mCherryを運ぶ第2世代複製不能力レンチウイルスの増幅

1. ヒト胚性腎臓細胞HEK293T~60%〜70%コンフルエンスで、10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEMを含む6ウェルプレートに、5%CO₂の加湿インキュベーターで37°Cで播種します。
2. Lipofectamine 3000を使用して、FUW-Luc-mCherry-puro転写、pCMVΔr8.91パッケージング、およびpVSV-Gエンベロープベクターを3:2:1の比率で細胞(1.5 x 10⁶)を2日間共トランスフェクトします。
3. レンチウイルス含有上清を採取し、0.45μmフィルターでろ過します。
4. クリアされたウイルス上清を遠心分離管に移し、20,000 x g で4°Cで2時間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを100 μLのPBSまたは無血清培地に再懸濁します。
5. qPCR レンチウイルス力価キットを使用して感染の多重度 (MOI) を測定します。

4. mCherryによる連続増殖ALL細胞株および患者由来ALL細胞の標識

1. プレート1 x 10^6細胞/mLのB-(SEM)およびT-ALL(MOLT3)^16,17細胞株および患者由来のB-またはT-ALL細胞をRPMI 1640 + 10%FBSを含む6ウェルプレートに収めます。
2. ウイルス力価3.47 x 10⁶ IU/mLの300 μLのレンチウイルス製剤で細胞に感染させ、1 x 10⁶ 細胞に対して1のMOIを取得し、穏やかに混合し、37°Cで5%CO₂ で2日間インキュベートします。
3. 培地に1μg/mLのピューロマイシンを加えて、安定して形質導入された細胞を2日間選択します。
4. mCherry標識細胞を蛍光顕微鏡で可視化します。

5. 卵異 種移植

1. 10日目(上記の卵の孵化セクションを参照)に、ニワシ胚の血管系を光の下で調べて、胚の生存率を評価します。次に、卵を70%エタノールで優しく洗い、表面を殺菌します。
2. 卵のエアセルにドリルで穴を開け、ハンドドリルを使用して小さな(直径~2.0 cm)窓を作成します。
3. 透明な粘着テープで密封し、5%_CO2 インキュベーターに戻します。
4. 11日目に、34 G針を使用して、1 x 10⁷ mCherry標識ALL細胞を発育中の胚の血管に注入します。同じ場所で窓を開くことは保証されていないため、すべての細胞が異なる胚の同じ場所に注入されたかどうかを確認することは困難であることが判明したことに注意してください。
5. 窓を透明な粘着テープで密閉し、5%CO₂ インキュベーターに戻し、胚の生存率を毎日監視します。
6. 15日目に、胚から血管を解剖し、スライドガラスの上に置き、蛍光機能を備えた解剖顕微鏡を使用して成功した異種移植片を撮影します。
   注:15dpfを超えると(羽毛が全身を覆い、卵白がほぼなくなるため)、ニワトリ胚血管系におけるALL細胞の増殖とコロニー形成の変化を評価するために、免疫組織化学を実行する必要があります。

6. フローサイトメトリー

1. 15日目に、32 G針を備えた滅菌注射器を使用してニワトリ胚血管系から血液を採取し、ヘパリンを含む1.5 mL滅菌チューブに移し、226 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
2. 上清(血漿)を除去し、細胞ペレットを1%BSA(ウシ血清アルブミン)を含む1x PBSに再懸濁します。
3. ステップ2.7およびステップ2.8を実行して、赤血球を溶解します。
4. B-ALL細胞をヒトFITC-CD10およびヒトPE-CD19抗体で標識し、T-ALL細胞をヒトFITC-CD4およびヒトPE-CD8抗体でそれぞれ4°C暗所で30分間標識します。
5. 標識細胞を1%BSAを含むPBSで2回洗浄し、226 x g で4°Cで5分間遠心分離し、1x PBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。
6. 前方散乱(FSC)電圧と横方散乱(SSC)電圧をそれぞれ400Vと360Vに設定します。FITCチャネルとPEチャネルの検出器ゲインをそれぞれ450-500 Vと400-450 Vに調整します。
   注:ゲーティング戦略:(a)光散乱ゲーティング(FSC対SSC):FSC-Aを使用するのと。SSC-A は、リンパ芽球領域に対応する中間の前方散乱 (サイズ) と低側方散乱 (粒度) を持つ集団を同定します。このステップは、破片や単球や顆粒球などのより粒状の細胞を除外するのに役立つことに注意してください。(b)一重項の選択(FSC-H対FSC-A):FSC-HとFSC-Hのゲーティングによるダブレット識別を実行します。FSC-A、単一細胞イベントのみが分析されるようにします¹⁸.
7. CD10/CD19+ B-ALL および CD4/CD8+ T-ALL 細胞を象限 2 (Q2;FITC/PE+) とPEプロット¹⁸。現在は、3つの独立した実験(n = 3)のSEM±ことを意味します。

発生中のニワトリ胚におけるヒトALL細胞の生移植が成功したかどうかを判断するために、mCherryを運ぶ第2世代複製不能力レンチウイルスを増幅し、それらを使用してB-およびT-ALL細胞株、SEMおよびMOLT3をそれぞれ標識しました16,17。図1Aに示すように、B-(左上の2つのパネル)およびT-(右上の2つのパネル)ALL細胞の~50%をmCherryで標識しました。続いて、患者由来のB-(#1および#2)およびT-(#3および#4)ALL細胞もmCherryで標識されました(図1A、左下と右下の4つのパネルがそれぞれ)。mCherry標識ALL細胞を濃縮するためにピューロマイシンで処理した細胞を使用して、ヒトALL細胞の卵子異種移植を実施し、そのタイムラインを図2に概略的に示します。

mCherry標識ALL細胞の注入から4日後の15dpfに、発育中のニワトリ胚の血管を解剖し、スライドガラスに置き、蛍光顕微鏡で撮影しました。 図3に示すように、発生中のニワトリ胚血管の蛍光画像は、SEMおよびMOLT3(左の2つのパネル)、および患者由来のB-(#1および#2、中央の2つのパネル)およびT-(#3および#4、右の2つのパネル)ALL細胞の in situ 血管コロニー形成を示しています。注射後 6 時間の 11dpf での発育中のニワトリ胚の血管の画像を対照として使用しました。これらのデータは、ニワトリ胚血管系の発生中にALL細胞の確立と成長が成功したことを示しています。

B-およびT-ALL細胞の生着の成功を検証するために、15dpfの発生中のニワトリ胚血管系から血液サンプルを採取し、赤血球を除去しました。次に、細胞をヒトBリンパ球およびTリンパ球特異的マーカーで標識し、フローサイトメトリーにかけました。注射後 6 時間の 11dpf で発育中のニワトリ胚の血液サンプルを対照として使用しました。 図4 は、SEMおよびMOLT3(図4A、左上および左下の3番目 および4番目の パネル)を注入した発育中のニワトリ胚におけるヒトCD10 / CD19 + B-およびCD4 / CD8 + Tリンパ球の劇的な増加、および患者由来のB-(図4A;#1および#2、3番目の 右2つのパネル)およびT-(図4A;#3および#4、 4番目の 右2つのパネル)ALL細胞、ALL細胞の 卵子 異種移植で堅牢性を確認します。

図1:B-(SEM)およびT-(MOLT3)ALL細胞株および患者由来B-(#1および#2)およびT-(#3および#4)ALL細胞のmCherry標識。(A)B-(SEM)およびT-(MOLT3)ALL細胞株、ならびに患者由来のB-(#1および#2)およびT-ALL(#3および#4)ALL細胞は、mCherryを運ぶレンチウイルスに感染しました。 ピューロマイシンで処理して安定して形質導入された細胞を選択し、蛍光顕微鏡を使用して明視野(左パネル)および蛍光(右パネル)画像で視覚化しました。スケールバー:100 μm。(B)グラフは、(A)に示した平均蛍光強度(λem = 590nm)±SEM(任意の単位)を表し、ImageJソフトウェアを使用して定量化されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:B-およびT-ALL細胞を持つ異種移植発育中の鶏卵の概略図。 10日目(10dpf)に、すべての細胞注入のためのウィンドウを卵殻に作成しました。11日目(11dpf)に、ALL細胞を胚血管系に注入し、ALL細胞増殖(11dpf-15dpf)を監視しました。15日目(15dpf)に、胚から血管を採取し、スライドガラスの上に置き、蛍光機能を備えた解剖顕微鏡を使用して異種移植片の成功を確認するために写真を撮りました。さらに、フローサイトメトリーのために血液を採取しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ニワトリ胚におけるmCherry標識B-(SEM)およびT-ALL(MOLT3)細胞株、および患者由来B-(#1および#2)およびT-(#3および#4)ALL細胞の血管コロニー形成。 発育中の卵血管のλem = 590nm での蛍光画像は、1 × 107 mCherry標識ALL細胞の注射から6時間後に11dpf(対照)および15dpf(注射後4日)で撮影されました。スケールバー:0.2cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:15 dpfの発生中のニワトリ胚血管系からの血液サンプルのフローサイトメトリー分析。(A)SEMおよびMOLT3細胞、および患者由来のB-(#1および#2)およびT-(#3および#4)ALL細胞を11dpfのニワトリ胚血管系に注入しました。15dpfの発生中のニワトリ胚血管系からの血液サンプルを採取し、赤血球を除去しました。次に、B-ALL細胞の場合はCD10/19、T-ALL細胞の場合はCD4/8で標識された細胞をフローサイトメトリーにかけました。注射後 6 時間後に 11dpf から分離された血液サンプルが対照として機能します。(B)象限Q2のCD10/CD19+ B-およびCD4/CD8+ T-ALL細胞を定量しました。データは、3つの独立した実験(n = 3)のSEM±平均を表し、*p<0.05です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:この研究で使用された患者由来のB-およびT-ALL細胞。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。