このプロトコルは、注射の 4 日後に行われる患者由来の B および T 急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の卵子異種移植 について説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
この研究では、B 細胞系統と T 細胞系統の両方を含む、患者由来の急性リンパ芽球性白血病 (ALL) 細胞の 卵内 異種移植のための迅速で費用対効果が高く、効率的な方法を紹介します。受精したニワトリ胚を使用して、受精後 11 日 (11dpf) に患者由来の B-ALL および T-ALL 細胞を胚の血管系に注入しました。驚くべきことに、注射の4日後、生着したヒト白血病細胞は、発育中のニワトリ胚内で有意な生存、増殖、および血管コロニー形成を示しました。15dpfまでに、胚の血管系からの血液サンプル中のCD10/CD19+ B-ALLおよびCD4/CD8+ T-ALL細胞の顕著な増加が検出され、生着の成功が確認されました。このシステムは、他の動物モデルに関連するかなりのコストや倫理的制約なしに、生体内の白血病細胞挙動の効率的かつ再現性のある評価を容易にします。この迅速なアプローチは、潜在的な治療用化合物を評価するためのハイスループットで生物学的に関連性のある in vivo プラットフォームを提供します。ここで紹介する卵 内 患者由来異種移植片 (PDX)-ALL システムは、前臨床薬物スクリーニング、機構研究、および白血病研究における個別化医療アプローチのための有望なツールを提供します。
概要
ひよこの絨毛尿膜(CAM)は、孵化後の受精後7日目に形になり始め、12日目までに完成します。CAMは、血管新生1およびがん細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、特に血液関連がん細胞11の生着に適したin vivoモデルとして脚光を浴びています、それは本質的に免疫不全であり、血管新生がよく発達しているためです。さらに、CAMは、コラーゲン、インテグリンαVβ3、フィブロネクチン、ラミニン、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ-2(MMP-2)10を含む多くの細胞外マトリックスタンパク質を運ぶため、腫瘍の浸潤と転移を調査するための望ましいシステムでもあります。
急性リンパ芽球性白血病 (ALL) は、未熟な B リンパ球と T リンパ球の急速な増加を特徴とする骨髄および血液のがんです。これは最も蔓延している小児がんであり、小児のがんによる死亡の主な原因です。ALLは罹患した小児の>85%で治癒可能ですが、成人と乳児の治癒率はかなり低く、再発/難治性ALLの5年生存率は<10%です12。したがって、再発または難治性の ALL を予防または阻止するための新しい治療戦略の開発が緊急に必要とされています。マウスやラット13など、多くの異種移植モデルが開発されていますが、これらの方法は時間(数か月など)と費用がかかり、包括的な倫理規制が必要です。新しいALL治療に対する満たされていない臨床ニーズに対処するには、基本的な in vitro 研究を延長するのに適した、再現性があり、時間的で費用対効果の高い動物モデルの開発が不可欠です。
この研究では、患者の B 細胞および T-ALL 細胞の 3D 血管コロニー形成を確実に生成する卵 内 異種移植プロトコルの確立に成功したことを報告し、これは ALL の進行を止める可能性のある新しい治療法の設計と、ALL 治療の結果とリスクの予測ツールの開発に使用されます。
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プロトコル
実験は、カルガリー大学の倫理委員会 (REB15-1143; すべての被験者からインフォームド コンセントが得られた場合) およびアルバータ州がん委員会の健康研究倫理委員会 (HREBA.CC-17-0108_REN8)です。診断時(治療開始前)に循環芽球(骨髄だけでなく血液にも芽球)を有するALL患者が研究に含まれました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。
1.卵の孵化
- 受精鶏卵を調達します。輸送中または割れ手順中に損傷した卵の数を考慮するために、必要以上に~10%多くの卵を入手してください。
- 受精卵は生存率を失うことなく12°Cで最大2週間保存します。
- 卵を39°Cの加湿(~50%-60%)ローリングインキュベーターに移します。
- インキュベーターで卵を10dpf孵化させます。1日目は、卵がインキュベーターに移されたときに始まることに注意してください。
2. ALL患者の血液サンプルからの急性リンパ芽球性白血病細胞の単離
- 前述のように細胞を単離します14,15。
- B-およびT-ALL患者から10 mLの末梢血(または骨髄)をヘパリン化試験管に採取します。
- 血液サンプルを滅菌50mL遠心分離管に移し、137 mMのNaCl、2.7 mMのKCl、10 mMのNa2HPO4、および1.8 mMのKH2PO4を含む2容量の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回希釈します。
- 希釈した血液サンプルを1容量の密度勾配培地に1容量重ね、ブレーキなしで室温で300 x g で30分間遠心分離します。
- 界面から単核細胞(MNC)のバフィーコート層を収集し、滅菌ピペットを使用して新しい滅菌15mLチューブに移します。
- 10 mLの1x PBSを加え、300 x g で5分間遠心分離して、残りの血清成分を除去します(このステップを2回繰り返します)。
- 2 mLの0.8%NH4Clを細胞ペレットに加え、穏やかにボルテックスし、室温で5分間インキュベートし、300 x g で5分間スピンして赤血球を溶解します(必要に応じて、このステップを繰り返します)。
- ステップ2.6で説明するように、細胞を1x PBSで洗浄します。
- 10%FBSを含むRPMI 1640に細胞を再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。
- トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率を評価します。
- 細胞を凍結培地(FBSでは10%DMSO)に再懸濁し、-80°Cで凍結し、液体窒素に保存します。
3. mCherryを運ぶ第2世代複製不能力レンチウイルスの増幅
- ヒト胚性腎臓細胞HEK293T~60%〜70%コンフルエンスで、10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEMを含む6ウェルプレートに、5%CO2の加湿インキュベーターで37°Cで播種します。
- Lipofectamine 3000を使用して、FUW-Luc-mCherry-puro転写、pCMVΔr8.91パッケージング、およびpVSV-Gエンベロープベクターを3:2:1の比率で細胞(1.5 x 106)を2日間共トランスフェクトします。
- レンチウイルス含有上清を採取し、0.45μmフィルターでろ過します。
- クリアされたウイルス上清を遠心分離管に移し、20,000 x g で4°Cで2時間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを100 μLのPBSまたは無血清培地に再懸濁します。
- qPCR レンチウイルス力価キットを使用して感染の多重度 (MOI) を測定します。
4. mCherryによる連続増殖ALL細胞株および患者由来ALL細胞の標識
- プレート1 x 106細胞/mLのB-(SEM)およびT-ALL(MOLT3)16,17細胞株および患者由来のB-またはT-ALL細胞をRPMI 1640 + 10%FBSを含む6ウェルプレートに収めます。
- ウイルス力価3.47 x 106 IU/mLの300 μLのレンチウイルス製剤で細胞に感染させ、1 x 106 細胞に対して1のMOIを取得し、穏やかに混合し、37°Cで5%CO2 で2日間インキュベートします。
- 培地に1μg/mLのピューロマイシンを加えて、安定して形質導入された細胞を2日間選択します。
- mCherry標識細胞を蛍光顕微鏡で可視化します。
5. 卵異 種移植
- 10日目(上記の卵の孵化セクションを参照)に、ニワシ胚の血管系を光の下で調べて、胚の生存率を評価します。次に、卵を70%エタノールで優しく洗い、表面を殺菌します。
- 卵のエアセルにドリルで穴を開け、ハンドドリルを使用して小さな(直径~2.0 cm)窓を作成します。
- 透明な粘着テープで密封し、5%CO2 インキュベーターに戻します。
- 11日目に、34 G針を使用して、1 x 107 mCherry標識ALL細胞を発育中の胚の血管に注入します。同じ場所で窓を開くことは保証されていないため、すべての細胞が異なる胚の同じ場所に注入されたかどうかを確認することは困難であることが判明したことに注意してください。
- 窓を透明な粘着テープで密閉し、5%CO2 インキュベーターに戻し、胚の生存率を毎日監視します。
- 15日目に、胚から血管を解剖し、スライドガラスの上に置き、蛍光機能を備えた解剖顕微鏡を使用して成功した異種移植片を撮影します。
注:15dpfを超えると(羽毛が全身を覆い、卵白がほぼなくなるため)、ニワトリ胚血管系におけるALL細胞の増殖とコロニー形成の変化を評価するために、免疫組織化学を実行する必要があります。
6. フローサイトメトリー
- 15日目に、32 G針を備えた滅菌注射器を使用してニワトリ胚血管系から血液を採取し、ヘパリンを含む1.5 mL滅菌チューブに移し、226 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清(血漿)を除去し、細胞ペレットを1%BSA(ウシ血清アルブミン)を含む1x PBSに再懸濁します。
- ステップ2.7およびステップ2.8を実行して、赤血球を溶解します。
- B-ALL細胞をヒトFITC-CD10およびヒトPE-CD19抗体で標識し、T-ALL細胞をヒトFITC-CD4およびヒトPE-CD8抗体でそれぞれ4°C暗所で30分間標識します。
- 標識細胞を1%BSAを含むPBSで2回洗浄し、226 x g で4°Cで5分間遠心分離し、1x PBSに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。
- 前方散乱(FSC)電圧と横方散乱(SSC)電圧をそれぞれ400Vと360Vに設定します。FITCチャネルとPEチャネルの検出器ゲインをそれぞれ450-500 Vと400-450 Vに調整します。
注:ゲーティング戦略:(a)光散乱ゲーティング(FSC対SSC):FSC-Aを使用するのと。SSC-A は、リンパ芽球領域に対応する中間の前方散乱 (サイズ) と低側方散乱 (粒度) を持つ集団を同定します。このステップは、破片や単球や顆粒球などのより粒状の細胞を除外するのに役立つことに注意してください。(b)一重項の選択(FSC-H対FSC-A):FSC-HとFSC-Hのゲーティングによるダブレット識別を実行します。FSC-A、単一細胞イベントのみが分析されるようにします18. - CD10/CD19+ B-ALL および CD4/CD8+ T-ALL 細胞を象限 2 (Q2;FITC/PE+) とPEプロット18。現在は、3つの独立した実験(n = 3)のSEM±ことを意味します。
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結果
発生中のニワトリ胚におけるヒトALL細胞の生移植が成功したかどうかを判断するために、mCherryを運ぶ第2世代複製不能力レンチウイルスを増幅し、それらを使用してB-およびT-ALL細胞株、SEMおよびMOLT3をそれぞれ標識しました16,17。図1Aに示すように、B-(左上の2つのパネル)およびT-(右上の2つのパネル)ALL細胞の~50%をmCherryで標識しました。続いて、患者由来のB-(#1および#2)およびT-(#3および#4)ALL細胞もmCherryで標識されました(図1A、左下と右下の4つのパネルがそれぞれ)。mCherry標識ALL細胞を濃縮するためにピューロマイシンで処理した細胞を使用して、ヒトALL細胞の卵子異種移植を実施し、そのタイムラインを図2に概略的に示します。
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ディスカッション
微生物汚染を防ぎ、ニワトリ胚の生存を最大化するために、卵内 異種移植中の3つの重要なステップが特定されました:すなわち、(1)窓を作る前に卵殻表面を70%エタノールで滅菌し、(2)卵殻窓をセロテープでしっかりと密閉して、インキュベーション中のニワトリ胚の内容物の蒸発を防ぎます。 (3) 細針 (例: 34 G) の使用と最小容量 (例: 100 μL) での ALL 細胞の注入により、適切な血管送達を確保し、機械的破壊を最小限に抑えます。トラブルシューティング分析により、100 mL 容量の 1 x 107 mCherry 標識 ALL 細胞が、堅牢な血管コロニー形成に最も効果的な用量であることが明らかになりました。
異種移植中に遭遇した課題の1つは、ALL細胞の一貫した解剖学的部位注射を達成することでした。しかし、画像解析を容易にするために胚の血管を解剖する必要があるため、ALL細胞が異なる胚の同一の場所に注入されたかどうかを確認することは困難であることが判明しました。この...
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
FUW-Luc-mCherry-puro を提供してくれたコロンビア大学の Andrew Kung 博士に感謝します。この研究は、CIHR (PJT-174983) から KYL への助成金と韓国国立研究財団 (NRF;RS-2023-00284121)をKYLおよびM-YJに送信します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 針 34 G | BDペリセーフ | ||
| Attune NxT フローサイトメーター | サーモフィッシャー | ||
| BD Perisafeシリンジ(32 g) | BDペリセーフ | ||
| ウシ血清アルブミン(BSA) | ミリポアシグマ | A9647 | |
| 細胞凍結培地 | Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12648010 | |
| 遠心分離機(Allegra X-22R 遠心分離機) | ベックマン・コールター | ||
| 使い捨て手袋 | Royal Touch300 ニトリル試験用手袋 | ||
| 解剖顕微鏡 | ライカ MZ16FA | ||
| DMEMの | Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11965092 | |
| DMSOの | Invitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィック | D12345 | |
| 卵インキュベーター、Vevitts 120ローリングインキュベーター | ビクセストトレーディング株式会社 | ||
| エチルアルコール(95%) | VWRインターナショナル | BDH1158-4LP | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック | 26140079 | |
| Ficoll ソリューション (Ficoll??パケプラス) | ミリポアシグマ | GE17-1440-02 | |
| FITC-CD10抗体 | サンタクルーズバイオテック | sc-46656 フィトック | |
| FITC-CD4抗体 | サンタクルーズバイオテック | SC-19641 フィック | |
| 蛍光顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ | ||
| ハンドドリル(Dremel3000) | ボッシュ | ||
| HEK293T | ATCC、バージニア州、米国 | CRL-3216 | |
| 血球計算器 | VWRインターナショナル、ハウザー・サイエンティフィック | 15170-263 | |
| ブタ腸粘膜からのヘパリンナトリウム塩 | ミリポアシグマ | H3149 | |
| ヘパリン化試験管 | BDバキュテイナー | BD 366480 | |
| リポフェクタミン 3000 | Invitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィック | L3000008 | |
| マルチプレックスレンチウイルス力価キット(qPCRレンチウイルス力価キット) | アブム | LV900 | |
| NH4Cl(アンモニウムchloride_ | ミリポアシグマ | A9434 | |
| オリンパスIX71倒立顕微鏡 | オリンポス | ||
| PE-CD19抗体 | サンタクルーズバイオテック | sc-19650 PE | |
| PE-CD8抗体 | サンタクルーズバイオテック | sc-1177 PE | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15140122 | |
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | シグマ | P3813 | |
| ピペット(容量調節可能) | エッペンドルフ | ||
| ピューロマイシン | Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1113803 | |
| RPMI1640 | Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11875093 | |
| スコッチチェロテープ | 3メートル | ||
| 滅菌6ウェルプレート | VWRインターナショナル、コーニング | 22250-140 | |
| 滅菌遠心分離管 | Axygen Inc、コーニング | AXYMCT-150-CS | |
| 滅菌培養フラスコ(75T) | VWRインターナショナル | 10062-872 | |
| 滅菌ファルコンチューブ(15mL) | ザルシュテット | 62.554.502 | |
| 滅菌ファルコンチューブ(50mL) | ザルシュテット | 62.547.254 | |
| 滅菌フィルター(0.45µm フィルター) | VWRインターナショナル | 76778-974 | |
| 滅菌鉗子 | VWRインターナショナル | 82027-404 | |
| 滅菌スライドガラス | VWRインターナショナル | 48300-031 | |
| 滅菌ピペットチップ | VWRインターナショナル | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| 滅菌シリンジ | BDシリンジ | 309628? | |
| トリパンブルー | Invitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィック | T10282 |
参考文献
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