このプロトコルは、ヒドロキシサフロールイエローA(HSYA)がゼブラフィッシュのLPS誘発性神経毒性を弱めるかどうかをテストすることを目的としています。運動機能は、ビジュアルビジョンシステムを使用して評価されました。ドーパミン作動性神経損傷は免疫組織化学によって検査されました。TLR4/NF-κB経路に関与する分子をウェスタンブロットを用いて解析しました。
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研究記事
ヒドロキシサフロールイエローAは、TLR4/NF-ĸBシグナル伝達経路を調節することにより、ゼブラフィッシュのドーパミン作動性ニューロンにおけるLPS誘発毒性を弱めます
この記事について
サマリー
要約
リポ多糖(LPS)による炎症は、パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患の引き金となり、永続させる重要な役割を果たしています。ヒドロキシサフロールイエローA(HSYA)は、 Carthamus tinctorius L.の主成分です。この研究は、HSYAがゼブラフィッシュのドーパミン作動性ニューロンにおけるLPS誘発毒性を改善できるかどうかを観察することを目的としています。ゼブラフィッシュをLPSに曝露した後、HSYAで処理しました。ゼブラフィッシュの運動機能を評価するために、行動試験を行った。ドーパミン作動性神経細胞の損傷とドーパミンレベルを調べました。TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-αも測定しました。LPS(60μg/mL、最終濃度)がゼブラフィッシュに毒性を誘発し、運動機能障害とチロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性ニューロンの損傷を引き起こすことを示しました。LPS曝露は、ドーパミンの含有量を減少させただけでなく、IL-1β、TNF-αのレベル、およびTLR4およびNF-κBの発現も増加させました。HSYAは、LPSによる運動機能障害を改善しました。さらに、HSYAはTH陽性ニューロンの喪失を弱め、ドーパミン含有量の増加を伴いました。HSYA処理は、TLR4、NF-κBの発現、およびIL-1β、TNF-αの産生も阻害しました。結論として、この研究は、HSYAがTLR4/NF-κB経路を調節することにより、ゼブラフィッシュのドーパミン作動性ニューロンの炎症誘発性損傷を弱めることを実証しており、これはPDにおける炎症性損傷の予防のための実験的基礎を提供します。
概要
パーキンソン病(PD)の病因は、脳内のドーパミン作動性ニューロンの損傷による運動活動の悪化です。PDの症状には、安静時振戦、運動緩慢、姿勢の不安定性、筋緊張などの運動機能障害が含まれます。PD患者の脳脊髄液および死後黒質線条体脳領域のサイトカインレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して上昇しています1。ドーパミン作動性神経損傷が炎症によって引き起こされるメカニズムは十分に確立されています。PDでは、中脳のドーパミン作動性ニューロンは、腫瘍壊死因子(TNF)-ɑ2などのサイトカインに感受性があります。リポ多糖類(LPS)は細菌の成分です。LPSは、Toll様受容体4(TLR-4)のリガンドとして同定されます。TLR-4に結合すると、LPSは炎症反応を引き起こし、組織に毒性を示します。TLR-4は中枢神経系のミクログリア上に位置しています。LPSはTLR-4を活性化するため、TNF-αとIL-1βを産生します。LPSへの中枢または末梢曝露は、中枢神経系に毒性を誘発します。LPS誘発性毒性が、PD3,4,5を含む神経変性疾患の引き金となり、永続化させる役割を果たしていることを示す証拠があります。
近年、ゼブラフィッシュは神経系疾患の研究モデルとしてよく利用されています。ゼブラフィッシュとヒトは80%の遺伝的相同性を持っています。そして、ゼブラフィッシュは人間とほぼ同じ数の染色体を持っています。さらに、ゼブラフィッシュの脳とそのシグナル伝達経路の主な構造は、哺乳類のそれと似ています。また、ゼブラフィッシュは透明な胚を大量に産生し、急速に成長し、遺伝子操作を受けやすいことにもなります6。これらの利点により、ゼブラフィッシュはPDの病因を調査し、PDにおけるハイスループット薬物スクリーニングを開発するための優れたモデルとなっています。
ヒドロキシサフロールイエローA(HSYA)は、 Carthamus tinctorius Lの主成分です。以前の研究では、HSYAには抗炎症作用があることが示されています。初代中脳培養では、20 μM から 640 μM の HSYA は毒性を示さなかった。また、HSYA濃度が40μMから640μMの範囲にあるため、LPSによるドーパミン作動性ニューロンの損傷が軽減されました7。C57BL/6Jマウスを6-ヒドロキシドーパミンにばく露してPDのモデルを誘導したところ、HSYAは神経機能障害を弱めるだけでなく、脳内のドーパミン作動性ニューロンを保護する。さらに、HSYAは、黒質8におけるシクロオキシゲナーゼ-2、誘導性一酸化窒素合成酵素、およびNF-κBの発現を減少させた。
現在まで、HSYAがin vivoでLPSの毒性を低下させる特性を示す報告はありません。HSYAがin vitroでLPS誘発毒性を弱めることを示した7。ただし、細胞ベースの評価は、神経毒性の複雑なプロセスのすべてのステップを表すわけではありません。ゼブラフィッシュは、毒性のメカニズムを解明するために特に価値があることが証明されています。近年、HSYAはプロテインキナーゼBの発現を減少させることによりNF-κB炎症経路の活性化を阻害し、それによって炎症反応を改善することができること、また、HSYAは細胞増殖および腫瘍壊死因子α誘発性炎症性損傷に影響を与える活性化タンパク質1関連炎症性シグナル伝達経路も阻害することも示されている9。10.この研究は、HYSA がゼブラフィッシュのドーパミン作動性ニューロンにおける LPS 誘発毒性を改善できるかどうかを調査することを目的としています。
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プロトコル
実験は、国立衛生研究所の実験動物使用ガイドライン(Publication 86-23, 1986年改訂)に則って行われました。そして、この研究は煙台大学動物管理および使用委員会(YTDX20220623)によって承認されました。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。
1.ゼブラフィッシュのメンテナンス
AB株ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、水温27-28.5°C(pH 7.0)の再循環水系で、14/10時間の明暗サイクルで飼育されました。ゼブラフィッシュには1日2回エビを餌にしました。自然交配後、受精した胚を、脱イオン水、KCl、NaCl、MgSO4・7H2O、およびCaCl2を含むE3培地を含むシャーレに収集しました。
2. ゼブラフィッシュにおけるLPS誘発毒性
受精後24時間(hpf)のゼブラフィッシュ胚を採取し、対照群とLPS群に割り当て、各群に60個の胚を割り当てました。LPS粉末を秤量し、一定量のPBS(pH = 7.4)溶液に添加して溶解させ、2 mg/mLのLPSストック溶液として調製し、-20°Cで保存およびスタンバイしました。実験中、LPS予備溶液を30 μg/mL、60 μg/mL、および90 μg/mLのLPS溶液に希釈しました。最終濃度30 μg/mL、60 μg/mL、または90 μg/mLのLPS溶液を、24 hpfのゼブラフィッシュ胚を含むシャーレに添加しました。各実験ウェルの溶液容量は3 mLでした。対照群では、ゼブラフィッシュの胚をLPSを含まないE3培地で培養しました。ペトリ皿を28°Cの恒温インキュベーションチャンバーに入れました。 LPSへの曝露は、上記と同じ手順に従って5日間連続して繰り返されました。
3. ゼブラフィッシュのLPS誘発毒性に対するTLR4阻害剤の影響
24 hpfのゼブラフィッシュ胚は、コントロール、LPS、およびTAK-242グループに割り当てられました。TLR4シグナル伝達経路の調節に対する最終濃度1μMでのTAK-242の調節効果を検証するために多くの研究が行われており、その中でいくつかの研究は、TAK-242がLPS誘発性細胞増殖と炎症因子の放出を阻害することにより、術後の緑内障の減少に関連する問題を解決する新しい方法を提供することを示しています11.TAK-242グループでは、TAK-242(1μM、最終濃度)を24hpfゼブラフィッシュ胚を含むシャーレに添加しました。各実験ウェルの溶液容量は3 mLでした。30分後、LPS(60 μg/mL、最終濃度)を添加して毒性を誘発したところ、LPS濃度ではゼブラフィッシュの死亡率は引き起こされませんでした。対照群の胚は、E3培地のみで維持されました。ペトリ皿を28°Cの恒温インキュベーションチャンバーに入れました。 上記の手順を5日間連続して繰り返しました。
4. ゼブラフィッシュのLPS誘発毒性に対するHSYAの影響
24 hpfのゼブラフィッシュ胚は、対照群、LPS群、およびHSYA群に割り当てられました。最終濃度20 μM、40 μM、または80 μMのHSYAを、24 hpfのゼブラフィッシュ胚を含むシャーレに添加しました。各実験ウェルの溶液容量は3 mLでした。30分後、LPS(60 μg/mL、最終濃度)を添加しました。対照群の胚は、E3培地のみで維持されました。ペトリ皿を28°Cの恒温インキュベーションチャンバーに入れました。 上記の手順を5日間連続して繰り返しました。
5. 行動評価
ゼブラフィッシュは、96ウェルプレートの中央60ウェルに移され、ウェルごとに1匹のゼブラフィッシュの幼生がいます。E3培地(250μL)を各ウェルに添加して、自由に泳げるようにしました。自発運動活動は、ビジョンシステムを使用して記録されました。ダークボックス(30cm×40cm×60cm)に純水を加え、温度を28°Cに調整して加熱状態にしました。
ダークボックスの温度が28°Cに達すると、ゼブラフィッシュが入った96ウェルプレートを内部に置き、Visual Visionシステムを作動させて自発運動を記録しました。データを格納するために新しいフォルダーが作成されました。実験設定インターフェースに入るためのビデオソースとして 、Homemade Video File が選択されました。 「実験設定 」では、観察ゾーンの数を60に設定し、60匹のゼブラフィッシュを同時に観察できるようにしました。 アリーナ設定では、レンズでキャプチャされた96ウェルプレートの画像が、位置決めサークルとともに画面に表示されました。 Arrange Arenas インターフェースのモジュールは、レンズキャプチャ領域が各ウェルと一致するように調整されました。 アリーナハードウェアマッピングでは、ダークボックスライトが ライトオンに設定されていました。
トライアルコントロール設定では、10分の準備期間と10分の検出期間で新しいプログラムが作成され、すべての並行実験に適用されました。検出設定を使用して、レンズキャプチャ機能が正常に動作していることを確認します。Trial Listには、各グループのゼブラフィッシュ60匹のデータが表示されました。ツールバーの試行回数を使用して、すべての実験グループを含むデータテーブルを生成し、データの完全性を確保しました。
すべての設定を確認し、ダークボックスの温度を28°Cに維持しました。 各ウェルにバイタルサインのあるゼブラフィッシュが1匹含まれていることを確認した後、実験が開始されました。実験中、行動器械のレンズは動きの軌跡、持続時間、および関連するパラメータを記録しました。最初の録音から20分後、システムは自動的に終了し、次の試験の準備が整いました。暗い箱を開け、96ウェルプレートをゼブラフィッシュが入った新しいプレートと交換して、その後の実験に備えました。
実験の最後に、解析モジュールから[結果]が選択されました。平均速度、距離、最大加速度、絶対ステアリング角度などの実験パラメータを結果モジュールから抽出し、エクスポートしました。その後、ゼブラフィッシュグループ間の行動の違いを分析するためにデータをまとめました12。
6. 炎症誘発性サイトカインの測定
ゼブラフィッシュが採集されました。試料を秤量し、PBS(0.01 M、pH = 7.4)を重量比1:9で添加し、4°Cでホモジナイズ(5000 r/min、30 s)しました。 ホモジネートを4°C、5000 x g、 20分で遠心分離し、上清を回収しました。IL-1βおよびTNF-αは、製造元の指示に従って、魚のELISAキットでアッセイしました。
7. 免疫組織化学
ゼブラフィッシュを 5 mL の 4% (v/v) パラホルムアルデヒドで固定しました。パラフィンに包埋し、厚さ5μmの切片を切断します。切片をクエン酸バッファー(200 μL)と共にして、マイクロ波で10分間インキュベートしました。0.3%過酸化水素とメタノール溶液で30分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼをブロックしました。PBSで3回、毎回5分間洗浄します。非免疫血清を37°Cで30分間インキュベートし、一次抗TH抗体(1:100)を37°Cで30分間インキュベートし、PBSで3回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(1:200)と結合した二次抗体と37°Cで30分間インキュベート。次に、3,3'-ジアミノドベンジジンを添加した。切片は明視野顕微鏡を使用して画像化しました。
8. 神経伝達物質
HPLC-ECDは、ドーパミンレベルを測定するために採用されました。ドーパミン塩酸塩を0.1 M過塩素酸(HClO4)に溶解して、3.90625 ng/mL、7.8125 ng/mL、15.625 ng/mL、31.25 ng/mL、62.5 ng/mL、125 ng/mLの濃度勾配溶液を得ました。一連のドーパミン標準溶液をHPLC-ECDで分析しました。ドーパミン濃度とドーパミンピーク面積を使用して線形回帰を行いました。標準曲線をプロットしました。ゼブラフィッシュの組織を0.1 M HClO413でホモジナイズしました。ホモジネートを4°C、20,000 x g、 15分間遠心分離しました。次に、ODS2カラム(E2118047;4.6 × 250 mm、5 μm)でサンプルを分離しました。緩衝液を調製した:酢酸ナトリウム25 mmol/L、クエン酸25 mmol/L、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩0.01 mmol/L、1-オクタンスルホン酸ナトリウム1 mmol/L、酢酸、pH 3.35に調整。移動相はアセトニトリル:バッファー(1:9、v/v)でした。0.22μmのフィルター膜で真空ろ過した後、サンプルを超音波脱気で10分間脱気しました。カラムオーブンの温度は30°Cでした。 流速は 1 mL/分でした。サンプルを 20 μL の容量で注入しました。電気化学検出器は、1000 mVの電圧で10 μAの範囲で動作しました。ゼブラフィッシュ組織中のドーパミン量は、回帰式に基づいて計算されました。
9. ウェスタンブロット
ゼブラフィッシュ組織からタンパク質を抽出し、濃度を測定しました(最終濃度:10 mg/mL)。タンパク質(50μg/5μL)を8%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけました。転写膜を110Vで1時間行った。メンブレンを5%ミルクで1時間ブロッキングした。一次抗体(ウサギ抗TLR4(1:1000)、ウサギ抗NF-κB(1:2000)、ウサギ抗ラミンB1(1:2000)、またはウサギ抗GAPDH抗体(1:1000)と4°Cでインキュベート。TBSTで洗浄した後(各5分間を3回)、メンブレンは二次抗体と1時間インキュベートしました。バンドはECL Chemiluminescent Substrate Kitを使用して視覚化し、ゲルイメージングシステムを使用して定量しました。Lamin B1とGAPDHをローディングコントロールとして使用しました。
10. 統計解析
全てのデータを平均SD±表し、統計ソフトで解析した。統計分析は、一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの検定を使用して実行されました。<0.05の P値は統計的に有意でした。
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結果
ゼブラフィッシュの運動機能に対するLPSの影響
ゼブラフィッシュの平均速度、総距離、最大加速度は、LPS(60 μg/mL および 90 μg/mL)群では、対照群と比較して減少(P < 0.01)しました。運動機能障害は、運動方向の頻繁な変化としても現れました。LPS 60 μg/mL群とLPS 90 μg/mL群のゼブラフィッシュの遊泳の絶対旋回角は、対照群と比較して有意に増加しました(P < 0.01)(図1)。
IL-1βおよびTNF-αに対するLPSの影響
対照群と比較して、LPS 60 μg/mL 群と LPS 90 μg/mL 群の IL-1β および TNF-α 含有量は有意に増加しました (P < 0.01) (
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ディスカッション
薬用植物には、抗炎症および神経保護用途の長い実績があります14。私たちの以前の研究では、HSYAが神経毒性物質誘発性PD動物モデルで保護効果を持つことが示されました。この研究では、ゼブラフィッシュのLPS誘発毒性を用いて、HSYAがTLR4/NF-κBシグナル伝達経路を調節することにより、ゼブラフィッシュのドーパミン作動性ニューロンにおける炎症誘発性損傷を弱めることを実証しています。
睡眠障害と認知機能障害はPD15,16と密接に関連しているだけでなく、運動機能障害もPD17の重要な特徴です。LPSによるゼブラフィッシュの毒性におけるゼブラフィッシュの行動を調べることにより、LPSに曝露されたゼブラフィッシュは、平均速度、総距離、最大加速度の低下を示し、絶対回転角の上昇も示しました。しかし、HSYAは絶対...
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開示事項
著者は、利益相反を宣言しません。
著者の貢献:
概念化:Guirong Zhang、Bing Han。資金調達:Guirong Zhang、Bing Han。調査:Huilin Zhang。方法論:Huilin Zhang、Mingyue Li、Xiaohan Zhang、Yang Li.監督:Guirong Zhang、Bing Han。執筆 - 原案:Mingyue Li、Xiaohan Zhang、Yang Li 執筆レビュー&編集:Huilin Zhang、Guirong Zhang、Bing Han。
謝辞
この原稿を編集してくれたレイチェル・ジェームズに感謝します。この研究は、山東省自然科学基金会(助成金番号。ZR2020MH377)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BCAタンパク質濃度 測定キット | Beyotime Biotechnology | P0012S | |
| 化学発光イメージングシステム | Beijing Sage Venture Technology Co. | ChampChemi 910 | |
| パミン塩酸塩 | グマ–アルドリッチPHR1090 | ||
| 電子天びん | オハウス計器有限公司 | AR-2140 | |
| ELISAキット。 | COIBO Biotechnology | CB10018-FI | |
| TNF-&α用ELISAキット。 | COIBO Biotechnology | CB10148-FI | |
| GAPDH 抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 5174S | |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad 統計ソフトウェア、ボストン、 MA、米国、www.graphpad.com | Prism 5.0 | |
| 高速液体 クロマトグラフィー–電気化学 検出(HPLC–ECD) | GL Sciences, Ibaraki, Japan | ED723 | |
| 高速凍結遠心分離機 | Beijing Dalong Xingchuang Experimental Instrument Co. | D3024R | |
| HPLC–ECD | GL Sciences | ED723 | |
| HSYA | Luye Pharma Group Ltd. | LY202206 | |
| Image Quant | GE Healthcare、東京、日本 | LAS 4000 | |
| ラミン B1 抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 13435S | |
| LPS | シグマ–Aldrich | L2630 | |
| 顕微鏡 | ライカ、Wetzlar | DM1000LED | |
| 顕微鏡 | ライカ、ドイツ | DM1000LED | |
| 多機能酵素ラベラー | Shanghai Meigu Molecular Instrument Co. | SpectraMaxパラダイム | |
| NF-κB抗体 | 細胞シグナル伝達技術 | 8242S | |
| Noldus Visual Vision XTシステム | ノルダスバイオテクノロジー株式会社 | EthoVision XT15 | |
| 核および細胞質 タンパク質抽出キット | Beyotime Biotechnology | P0028 | |
| PMSF | Beyotime Biotechnology | ST506 | |
| TAK-242 | Merck | 614316 | |
| Thermostat | Shenzhen Galaxy Instrumentation Co. | 12810129 | |
| TLR4 | Abcam | ab13556 | |
| ブラフィッシュ | 国立 ゼブラフィッシュモデル動物 | AB株 | |
| ブラフィッシュ循環水システムゼブラフィッシュ再循環水システム | アイシェンバイオテクノロジー株式会社 | エセン-AW-S1 |
参考文献
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