方法論記事

うつ病のマウスモデルにおける嗅覚快楽バイアスを測定するための嗅覚選好試験

DOI：

10.3791/68391

⸱

2025年7月11日

 ,  ,  ,  , 
1Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 3571, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Ecole Doctorale 158 - Cerveau, Cognition, Comportement, Université Paris Cité, 3Laboratoire d’Ethologie Expérimentale et Comparée – UR 4443, Université Sorbonne Paris Nord, 4Université de Paris Cité, 5Department of Psychiatry, Service Hospitalo-Universitaire, GHU Paris Psychiatrie & Neuroscience

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、うつ病のマウスモデルにおける食欲刺激と嫌悪臭刺激の両方に対する否定的な嗅覚バイアスの評価を可能にする嗅覚選好テストのプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

うつ病は、世界中で障害の最大の要因であり、年間2億8,000万人が罹患しています。活動とモチベーションの低下を超えて、うつ病は原子価の負のバイアスと関連していることが示されています:患者は健康な人と比較して、中立的で肯定的な感覚刺激が不快でなく、否定的な感覚刺激がより不快であると感じます。特に、嗅覚快楽バイアスは、患者における疾患の状態マーカーを表している可能性があり、マウスモデルで容易に測定できます。しかし、トランスレーショナルな方法で感情バイアスを測定するための動物での試験はほとんどありません。ここでは、さまざまな快楽値に関連する匂い物質の調査を通じて、コントロールマウスとうつ病様マウスの匂い価の帰属を確実に評価するためのプロトコルを提案します。この嗅覚選好テストといくつかの行動測定値を使用して、うつ病の2つの異なるマウスモデルで、食欲刺激と嫌悪刺激の両方に対する否定的な嗅覚バイアスを確認します。重要なことに、この方法は男性と女性の両方の個人に適用できます。最後に、このプロトコルは、感情的反応の評価を改善するための複数の適応を可能にし、ニューロン活動のライブモニタリングのための古典的なツールと簡単に組み合わせることができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

うつ病は深刻な気分障害であり、世界中の障害の主な原因です。世界保健機関(WHO)によると、人口の約4%にあたる約2億8000万人がうつ病を経験しています。男性よりも女性の方が50%多く、COVID-19の発生により、パンデミックの最初の年にうつ病性障害の有病率が25%増加しました(世界保健機関、2022年)。さらに、患者の約3分の1は古典的な抗うつ薬療法に反応せず、抗うつ薬の効果を観察するのに数週間かかり、気分障害の生理病理学はほとんど不明のままです。

DSM-51に基づくと、うつ病の診断は、抑うつ気分、興味や喜びの喪失、体重の大幅な変動、身体的および心理的な減速、疲労、無価値感、集中力の低下、死の繰り返しの考えなど、いくつかの症状に依存しています。臨床研究では、気分障害は感覚の変化を伴うことも示されました:うつ病の患者は、対照被験者2,3,4よりも感覚刺激が不快であると感じます。

快楽的な「原子価」とは、何かが楽しい(正の原子価)または嫌悪的(負の原子価)の程度を指します。刺激への価数の割り当ては、アプローチまたは回避5を含む適応行動を引き起こす可能性があります。興味深いことに、このプロセスは昆虫から人間までの種間で高度に保存されています6。したがって、うつ病は原子価の負のバイアスと関連しています。しかし、臨床診断は、まだ感覚バイアス評価にほとんど依存していません。

感覚様式の中で、嗅覚入力は主に視床リレーをバイパスし、ヒトを含む哺乳類の大脳辺縁系に投影するため、嗅覚は特に興味深いものです。進化論的な観点から、このシステムは、環境刺激7,8,9,10,11,12に対する一連の主要な応答をコードする上で重要であることが示されています。これらの共有された神経回路に加えて、臨床研究では、嗅覚とうつ病の両側関係が明らかになり、うつ病患者は嗅覚の変化を経験し、嗅覚障害は抑うつ症状を引き起こします13。さらに、投薬または治療後にうつ病患者では嗅覚機能が回復します14、15、16、17。これらの結果は、嗅覚障害が、疾患の形質(精神障害の病態生理学において先行する、おそらく因果的な役割を果たす特性、したがって早期の発症前診断に使用できる特性)ではなく、状態(患者の臨床症状の状態)のバイオマーカーである可能性があることを示唆しています18。したがって、うつ病における嗅覚モダリティがどのように変化するかについてのより適切でさらなる理解は、治療反応性の診断と検出のための新しい治療ツールへの道を開く可能性があります。

したがって、うつ病のモデルにおける嗅覚快楽バイアスの評価は、誘発されたうつ病様表現型を評価するため、また、これらの価数割り当ての変化の背後にある神経メカニズムを調査するツールとして、特に興味深いものとなるでしょう。これまでの研究では、マウスの匂い価の割り当てを評価するために、すでに行動学的アプローチが用いられています。しかし、これらのテストは、いくつかの注意点を提示する:彼らは、主に蓋19、20、21によって閉じられた箱を含む洗練された装置19を必要とし、臭気溶液20、21、22との絶え間ない物理的接触を含み、および/または非常に短い臭気探索時間21、22、23をもたらす.このため、これらのアッセイは、つながれたマウスでより長いサンプリング時間を必要とするニューロン活動のライブモニタリングの従来のツールと互換性がありません。

さらに、Malkesmanらは、雌マウスの尿に曝露された雄マウスの嗅覚調査を測定することにより、げっ歯類の報酬探索活動を監視するための雌尿嗅覚試験(FUST)をすでに開発している24。ただし、このテストは、社会的性質の特定の肯定的な刺激に対する行動反応のみを、短い相互作用時間で評価します。さらに、このテストは男性のげっ歯類のみを対象として設計されていますが、うつ病は女性の間で男性の2倍一般的です。

これらすべての制限を克服するために、ここでは、Bigotら14から適応した嗅覚選好テスト(OPT)を開発しました。これにより、うつ病の状況で快楽反応を正確に評価するために、雄と雌の両方のマウスをさまざまな中性、陽性、および陰性の臭気にさらすことができます。匂いの選択は、以前の出版物14,25に基づくことができますが、このテストでは、天然成分と単分子または特別に設計された化学混合物の両方を使用して、新しい社会的、栄養的、感染関連の刺激を探索することもできます。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物の世話と実験手順は、国内およびヨーロッパ(2010/63 / EU)のガイドラインに従い、フランス研究省(APAFiS:#16380-2018080217358599_v1;APAFIS #51636-2024101718013761_v4)。C57BL/6JRjの雄と雌のマウス(UCMSモデル)とC57BL/6NTac(CORTモデル)の雄マウス(8週齢)を社会的に飼育し(ケージあたり4-5匹)、標準条件(23 ± 1 °C、湿度40%)で14/10時間の明暗サイクル(午前7時に点灯)で維持し、餌と水 を自由に使用しました。

1. 実験のセットアップ

  1. アリーナの設置
    1. 灰色のプレキシガラスの壁と白い床で作られた2つのコンパートメントアリーナ(45 cm × 50 cm × 25 cm)で構成される実験セットアップを準備します。2つのコンパートメント(25 cm×45 cm)をグレーのプレキシガラスの壁(37 cm×25 cm)で分割します。
    2. 穴あきペトリ皿(60 mm×15 mm、直径5 mmの7つの穴)を各コンパートメントから壁の底に置きます。
    3. 両面接着剤または感圧接着剤(Blu-tackなど)を使用して、シャーレを壁に垂直に固定します。
    4. アリーナの上にカメラを設置して、動物の行動(アリーナから2 m上)を記録し、実験を通じて動物の動きを自動的に追跡します。
  2. 臭いの選択
    1. 実験に先立って、テストする中性、陽性、および陰性の原子価を持つ臭気のリストを選択します(例については 表1 を参照してください)。
    2. 選択したすべての臭気が同様の蒸気圧を持っていることを確認してください。さらに、光イオン化検出器(PID)26を使用して、一部の臭気についてアリーナ全体の拡散を評価します。
    3. それぞれの臭いを別々の日にテストします。
      注:最初に中性臭いの使用を計画し、次に食欲をそそる臭いを使用し、嫌悪臭で終わることを計画して、日ごとの探索効果を最小限に抑えることをお勧めします。この順序により、あるテスト日から別のテスト日へのキャリーオーバーの影響が最小限に抑えられます。あるいは、ランダムなプレゼンテーションを使用することもできますが、すべての実験グループを同じ臭気シーケンスでテストする必要があります。
  3. 実験群の設計
    1. マウスを少なくとも2つの実験グループに分けます:対照マウスとうつ病のモデルを受けるマウス。同じグループの動物を同じケージに収容します。
      注意:統計的有意性を得るために、各実験グループには少なくとも約7〜8人の個人が含まれている必要があります。ケージは、ケージの影響を最小限に抑えるために、動物の家の近くに配置する必要があります。
    2. 選択したうつ病のモデルを使用して、関連するマウスグループでうつ病様表現型を誘導します。
      注:マウスでうつ病様の行動を誘発するプロトコルを説明することは、この記事の範囲を超えています。しかし、この研究では、この嗅覚選好テストの代表的な結果として、2つの異なるモデル(予測不可能な慢性軽度ストレス[UCMS]とコルチコステロン[CORT])27,28を使用した実験を提示しています。まもなく、UCMS モデルは、数週間にわたるさまざまな異なる環境ストレス要因への曝露に依存していますが、CORT モデルは、マウスの飲料水に溶解したコルチコステロンを慢性的に投与することで構成されます (マウスの飲む量に応じて約 5 mg/kg/日)。

2.慣れ段階

  1. 一般的な慣れと取り扱い
    1. 到着したら、寝具を交換せずにマウスを1週間放置します。ケージに補助的な綿素材とイグルーを追加して、ストレスを軽減します。
    2. 1週間後、すべてのマウスを毎日3〜4日間優しく取り扱い、できれば実験室でカップの取り扱いに慣れさせます。
  2. 試験の実験条件
    1. 実験開始の30分前にマウスを行動試験室に移します。
      注:理想的には、行動室には2つの別々の部分が含まれ、動物が一方の部分にいて、テストされたマウスがもう一方の部分で実行できるようにする必要があります。
    2. 標準的な住宅条件(23±1°C、湿度40%)が維持されており、部屋に不快な音、照明、臭いがないことに注意してください。
    3. ルクスメーターを使用して、アリーナの照明を約40ルクスに設定します。アリーナ内の照明が均一であることを確認してください。
  3. アリーナへの慣れ
    1. きれいな濾紙(42.5 mm)を両方のペトリ皿(60 mm×15 mm)に加えます。
    2. 透明なテープを使用して、ペトリ皿の蓋を底に取り付けます(垂直に配置するため)。
    3. 初日は、同じハウジングケージのすべてのマウスをアリーナに10分間静かに置き、新恐怖症を軽減します。
      注意: テールで拾うことによるストレスを避けるために、常にカップの取り扱いでマウスをアリーナに入れてください。
    4. 翌日、すべてのマウスを個別にアリーナに導入し、2つのコンパートメントの間だけで、動作を10分間記録します。
    5. 2〜3日続けて繰り返します。
  4. 探索基準
    1. ペトリ皿が置かれた2つのエリア(25 cm 15 cm)を定義し、各動物が各ゾーンで過ごす時間を測定します。
    2. これらの測定値を、個々のすべての慣れステップで平均化します。
    3. 各ゾーンでの平均滞在時間が 50 秒を超える場合、基準は満たされます。そうでない場合は、基準に達するまで慣れセッションを繰り返すか、動物を分析から除外します。
      注:1日あたり最大2回の馴化セッション(午前と午後)を実行できます。

3. テストフェーズ

  1. 臭いの準備
    1. テスト当日は、ケミカルフードの下で正しい希釈で臭いを準備します。化学構造に応じて、鉱物油または蒸留水で臭いを希釈します。汚染を避けるために、鉱物油は臭気物質から離れた別の換気された部屋に保管してください。
      注:新しい実験を開始するときは、新しい鉱油のボトルを使用することをお勧めします。
    2. 臭気溶液をガラスバイアルに保管します。臭気汚染を引き起こす可能性のあるプラスチックチューブ容器は避けてください。
    3. 各マウスを試験する直前に、フィルターチップを使用してマイクロピペットで200μLの臭気溶液を採取し、2つのシャーレのいずれかのフィルターペーパーに置きます。
    4. 2番目のペトリ皿の他の濾紙は手つかずのままにしておきます。
    5. テストルームでペトリ皿を移し、アリーナの壁に垂直に固定します。
      注意:臭気混入を防ぐため、臭気溶液を実験室に用意して捨てないでください。実験中は定期的に手袋を交換してください。臭気操作中に手袋が汚染された疑いがある場合は、マウスをつかんでテストする前に手袋を交換してください。
  2. 行動テスト
    1. 各マウスをアリーナの2つのコンパートメントの間だけに個別に配置します。
    2. 10分間録画します。
    3. アリーナからマウスを取り外します。
    4. 臭いのペトリ皿を取り除きます。
    5. アリーナを消毒液(エタノール70%など)で洗浄し、乾燥させます。
    6. 濾紙を捨てて、次のマウスのために臭いの準備を繰り返します。
    7. 理想的には、1日1つの臭いだけをテストします。最初に中性の臭気を優先的に使用し、次に正の臭気、最後に陰性の臭気を優先的に使用します ( 図 1 を参照)。
      注意:実験の日を通して、ほぼ同じ時間に慣れとテストの両方のステップ を実施 します(理想的には午前9時から午後3時の間)。動物の数に長い時間が必要な場合は、日中のバイアスを避けるために、異なる実験グループを交互にテストするように注意してください。男性と女性を同じ実験でテストする必要がある場合は、性別を次々とテストすることをおすすめします。
      注意: 臭いの汚染を避けるために、テストの毎日清潔なペトリ皿を使用してください。注目すべきは、穴あきペトリ皿は、適切な洗浄と臭気の除染後、いくつかの実験に再利用できます。

4. データ分析

  1. 行動追跡
    1. 自動追跡プログラムを使用して、テストを通じてマウスの位置を記録します。
    2. 分析のためにアリーナに個別のゾーンを定義します ( 図 1 を参照)。
      1. 「臭気ゾーン」(25 cm × 15 cm)、つまり、臭いが染み込んだフィルターペーパーと一緒にペトリ皿が置かれる領域 (つまり、表面コンパートメントの約 3 分の 1 を表す臭いに最も近い領域) を定義します。
      2. 「臭気ゾーン」に対して対称的であるが、ペトリ皿に臭気が追加されていない「コントロールゾーン」(25 cm×15 cm)を定義します。
      3. 「臭気ゾーンの後ろ」(25 cm×30 cm)を定義します。つまり、コンパートメントの残りの部分は、臭気ペトリ皿が置かれる場所です。
      4. 「ビハインドコントロールゾーン」(25 cm × 30 cm)を定義し、「ビハインドコントロールゾーン」に対して対称で、残りの無臭コンパートメントで構成されます。
        注:マウスの体の中心点の追跡は、動物の嗅覚の好みを分析するのに十分です。しかし、各マウスの鼻を具体的に追跡することで、動物による嗅覚調査をより正確に説明することができます。
  2. 快楽的な反応の読み出し
    1. 自動追跡を使用して、すべてのマウスとテストの毎日について、慣れ手順を含む次の情報を収集します。
      1. アリーナで移動した合計距離(m)を記録します。
      2. アリーナの各ゾーンで費やした時間を記録します。
      3. アリーナの各ゾーンのエントリー数を記録します。
    2. 総移動距離を使用して、主な自発運動効果を評価します。
    3. さまざまな匂いに対する嗅覚の好みの違いを評価するには、主要な読み出しを使用します。
      1. 臭いゾーンで過ごした時間を使用してください。
      2. 臭気ゾーンのエントリ数を使用します。
      3. 匂いゾーンで過ごした時間を、慣れ中にこのゾーンで過ごした時間に正規化して計算された選好指数を使用します(正規化はすべてのグループのマウスで実行されます)。平均は臭気ゾーンで費やした時間の算術平均を指し、sdはその標準偏差を指します。
        figure-protocol-1
      4. 次のように、移動距離、臭気ゾーンで費やした時間、および臭気ゾーンへのエントリ数を正規化した値の平均として計算される臭気探索インデックスを使用します。
        figure-protocol-2
        figure-protocol-3
        注:この選好指数は、必要に応じて、たとえば、臭気ゾーン と コントロールゾーンで費やした時間を比較することにより、適応させることができます。グループが慣れ中の「臭気ゾーン」の探索に大きな違いを示した場合、正規化は、すべてのグループを組み合わせたものではなく、対照グループのみに対して実行できます。
    4. 対照マウスおよびうつ病様マウスのこれらの読み出しを、平均の平均±標準誤差(SEM)として視覚的に表します。
    5. 反復測定の二元配置分散分析(ANOVA)とそれに続く事後検定(ここでは未修正のFisherの最小有意差検定)を使用して、実験グループ、臭気(反復測定係数)、および交互作用効果因子の両方を考慮します。交互作用因子は、グループ間の差が提示されたすべての匂いで一貫しているかどうかを示します。
    6. 適応テスト(Shapiro-Wilk検定、Bartlettテスト)を使用して正規性と等分散性を確認します。統計的有意性は、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001に設定されました。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

うつ病様マウスが負の嗅覚バイアス14,29を示し、ここで説明する嗅覚選好テストのプロトコルを使用して確実に測定できることを確認するために、うつ病の2つの異なるマウスモデルで異なる匂いに対する快楽反応を評価しました。

まず、28から4週間続く予測不可能な慢性軽度ストレス(UCMS)のマウスモデル(詳細なプロトコルについては補足ファイル1を参照)を使用して、若い雌のC57BL / 6JRjマウスに抑うつ様表現型を誘導しました(図2A、B)。これらの雌マウスを嗅覚選好試験で試験し、雄マウス尿(MU、純粋)を食欲臭、2,4,5-トリメチルチアゾール(TMT、鉱物油中5%)を嫌悪臭として投与しました。平均して、すべてのマウスは、慣れ中に「コントロール」ゾーンと「匂い」ゾーンの両方で少なくとも50秒を費やし、基準を満たしました(図2C)。しかし、慣れさせることで、UCMSマウスはコントロールと比較して「コントロールゾーン」で過ごす時間が有意に長かったが、臭気が加わるゾーンについては大きな違いはないので、この差は無視できる。距離に関しては、対照マウスはMUにばく露されたとき、UCMSよりも有意に多く動きましたが、慣れ中またはTMTの存在下では動きませんでした(図2D)。最後に、快楽反応のすべての読み出し(臭気ゾーンで過ごした時間、臭気ゾーンへのエントリ数、および選好指数)は、対照とUCMSの女性との間に有意差または統計的傾向を示しています(図2E-G)。この影響は、快楽反応と自発運動反応を組み合わせた尺度である全球臭気探索指数を通じても確認できます(図2H)。したがって、一貫して、すべての読み出しは、食欲と嫌悪の両方の嗅覚刺激に反応して負の快楽バイアスを示しています。興味深いことに、感情スコアは、大量の行動テスト14に基づいて不安および抑うつ様表現型の正規化値として計算され、MUおよびTMTの両方の匂い探索指数と正の相関があり(図2I)、正および否定の匂い物質に対する行動反応と不安および抑うつ様表現型との関係を示しています。

次に、同じUCMSプロトコルを使用して、今回は雄マウスにうつ病様表現型を誘導しました。嗅覚選好試験中、これらのマウスは、食欲をそそる雌マウス尿(FU、純粋)と、以前と同様にTMTに陰性の臭気として曝露されました(図3A、B)。馴化中に4つのゾーンで費やされた時間や、テスト中に移動した距離に差はありません(図3C、D)。臭気ゾーンで費やされた時間は、コントロールと比較して、UCMSでのFUおよびTMT探索の大幅な減少を示しています(図3E)。さらに、UCMSマウスは、匂いゾーンに有意に少ない、または入る傾向があり、FUおよびTMTの両方について有意に低下した選好指数を示し(図3F、G)、抑うつ様状態における負の嗅覚バイアスを確認する。同様に、匂い探索指数は、UCMSマウスのFUおよびTMTに対する行動反応が対照群と比較して負にシフトしたことを示しており(図3H)、これらは動物の感情スコアと正の相関がある傾向があります(図3I)。

3番目の実験では、雄のC57BL / 6NTacマウスの飲料水中のコルチコステロン(CORT)の慢性投与に依存するうつ病の別のモデルに頼りましたが、対照マウスはビヒクル(Veh)溶液(10%2-ヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン)のみを受け取ります27。CORTまたはVeh処理を4週間行った後、マウスを4日間慣らした後、中性臭気(OCT:2-trans octenal、水中1%)、陽性臭(PO:ピーナッツ油)、陰臭(TMT:2,4,5-トリメチルチアゾール、鉱物油中5%)に曝露した(図4A,B)。慣れにより、VehとCORTの間に違いはありませんでした(図4C)。しかし、両グループとも「コントロールゾーン」よりも「ニオイゾーン」で過ごす時間が有意に多かった。移動距離に差はありませんが、VehマウスがCORTよりも多く移動した陽性臭気(PO)を除きます(図4D)。重要なことに、UCMSマウスと同様に、中性で食欲をそそる匂いにさらされると、CORTマウスの匂いゾーンで過ごす時間が大幅に短縮されました(図4E)。臭気の探索の減少は、臭気ゾーンへの侵入数が大幅に減少するか、減少する傾向によっても見られます(図4F)。この場合、分析された読み出しによってグループ間の違いは明らかになりますが、これはおそらく、使用される動物の数に関連する制限と、TMT博覧会後に観察された探索時間の短さによって引き起こされる潜在的な床効果によるものです。全体として、CORTマウスでは、すべての匂い刺激について、Vehと比較して選好指数が有意に低くなっています(図4H)。最後に、すべての匂いの匂い探索指数は、動物の感情スコアと有意に相関しており(図4I)、この嗅覚選好テストが、うつ病のいくつかのマウスモデルにおける否定的な感情バイアスを評価するのに適したツールであることを改めて示しています。

最後に、観察された違いが感情的な偏見ではなく、運動活動の減少によって引き起こされる可能性を排除できます。実際、移動した総距離を評価する場合、慣れ中のグループ間で移動運動に違いはありません(図2D、 図3D、 図4D)。さらに、統計分析に基づくと、タスクエンゲージメントの一般的な減少や新規性効果も、これらのバイアスを説明することはできません。実際、嗅覚指数分析では、匂い因子の有意な影響が見られ、実験群と匂いとの間に有意な相互作用は見られませんでした。これらの結果は、うつ病様マウスが実際にこの課題を実行し、その探索の減少が各嗅覚の手がかりに特異的であることを示しています。

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図1:嗅覚選好テストのタイムラインと設定の一般的な概略図。 マウスは最初にアリーナに慣れます。慣れの初日に、同じハウジングケージのマウスを一緒に配置して、新恐怖症を軽減します。翌日、彼らは個別にアリーナに配置されます。慣れた後、チャンバーの1つに臭いが加わります。中性の臭気が最初に優先的にテストされ、次に正の臭気、最後に否定的な臭気がテストされます。分析のために、アリーナは4つの異なるゾーンに分割できます。Biorenderで作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:うつ病のUCMS雌マウスモデルにおける負の嗅覚バイアス。 (A,B)研究のタイムラインと実験グループ: 対照マウスと UCMS (予測不可能な慢性軽度ストレス) 雌マウスは、嗅覚選好試験で陽性 (MU: 雄マウス尿、純粋) および陰性 (TMT: 2,4,5-トリメチルチアゾール、鉱油中 5%) で試験されます。Biorenderで作成。(C)UCMSマウスは、慣れ中の対照と比較して、「対照ゾーン」で平均して有意に長い時間を過ごし、「背後の臭ゾーン」で過ごす時間が少なかった（グループ）F(1, 12) = 74.03, p < 0.0001;ゾーン: F(2.434, 29.21) = 7.688, p = 0.0012;交互作用: F(3, 36) = 5.148, p = 0.0046)。(D)MUに曝露された場合、UCMSで移動した総距離は大幅に減少しましたが、Habituation(Hab)およびTMTでは移動しませんでした(グループ:F(1、12)= 4.664、p = 0.0518;臭気:F(1.871、22.45)= 4.846、p = 0.0195;交互作用: F(2, 24) = 4.797, p = 0.0177)。(E)UCMSマウスは、MUおよびTMTの探索に費やした時間が大幅に短縮されました(グループ:F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003;臭気:F(1、12)= 59.69、p < 0.0001;交互作用: F(1, 12) = 2.267, p = 0.1580)。(F)UCMSマウスは、臭気ゾーンよりも少ない値に入ったか、または匂いゾーンに入る傾向がありました(グループ:F(1、12)= 9.279、p = 0.0102;臭気:F(1、12)= 5.100、p = 0.0433;交互作用: F(1, 12) = 1.649, p = 0.2233)。(G)MUおよびTMTの選好指数は、UCMSマウスで有意に減少します(グループ:F(1, 12) = 24.39, p = 0.0003;臭気:F(1、12)= 59.69、p < 0.0001;交互作用: F(1, 12) = 2.267, p = 0.1580)。(H)MUおよびTMTの臭気探索指数は、UCMSマウスで大幅に減少します（F(1,12)= 14.71、p = 0.0024;臭気:F(1,12)= 0、p > 0.9999;交互作用: F(1, 12) = 0.02630, p = 0.8739)。(I) MUとTMTの匂い探索指数は、どちらも動物の感情スコアと正の相関がある(MU: Pearson R2 = 0.4837, F(1,12) = 11.24, **p = 0.0058;TMT: Pearson R2 = 0.5340, F(1,12) = 13.75, **p = 0.0030)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:うつ病のUCMS雄マウスモデルにおける負の嗅覚バイアス。 (A,B)研究のタイムラインと実験グループ: 対照マウスと UCMS 雄マウスは、嗅覚選好試験で陽性 (FU: 雌マウス尿、純粋) と陰性の臭気 (TMT: 2,4,5-トリメチルチアゾール、鉱油中 5%) でテストされます。Biorenderで作成。(C) 慣れを通じてアリーナの異なるゾーンで費やされた時間には、平均して差はありません(グループ:F(1, 13) = 3.921, p = 0.0693;ゾーナー = F(1.688, 21.94) = 34.57, p < 0.0001;交互作用: F(3, 39) = 0.7385, p = 0.5355)。(D)コントロールとUCMSの間で移動した合計距離に違いはありません(グループ:F(1、13)= 2.313、p = 0.1522;臭気:F(1.722、22.38)= 1.746、p = 0.1998;交互作用: F(2, 26) = 0.8806, p = 0.4266)。(E)FUおよびTMTを用いた臭気ゾーンの探索に費やされた時間は、UCMSマウスで大幅に短縮されました（グループ）F(1, 13) = 6.808, p = 0.0216;臭気:F(1,13)= 16.21、p = 0.0014;交互作用: F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753)。(F)UCMSマウスは、TMTの臭気ゾーンに有意に少ない回数で入り、FUの傾向がありました(グループ:F(1、13)= 6.572、p = 0.0236;臭気:F(1,13)= 3.784、p = 0.0737;交互作用: F(1, 13) = 0.2145, p = 0.6509)。(G)UCMSマウスの選好指数は、FUおよびTMTで有意に低下します(グループ:F(1,13)= 6.808、p = 0.0216;臭気:F(1,13)= 16.21、p = 0.0014;交互作用: F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753);(H)UCMSの臭気探査指数は、両方の臭気で大幅に減少します(グループ:F(1、13)= 12.42、p = 0.0037;臭気:F(1、13)= 0.002580、p = 0.9603;交互作用: F(1, 13) = 0.5804, p = 0.4598)。(I)FUとTMTの匂い探索指数は、動物の感情スコアと正の相関がある傾向があります（FU:ピアソンR2 = 0.2573、F(1, 13)= 4.504、p = 0.0536;TMT: Pearson R2 = 0.2266, F(1, 13) = 3.809, p = 0.0729)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:うつ病のCORT雄マウスモデルにおける負の嗅覚バイアス (A,B) 研究のタイムラインと実験グループ:VehおよびCORT雄マウスは、中性(OCT:trans-2-octenal、水中1%)、陽性(PO:ピーナッツ油、純粋)、および陰性の臭気(TMT:2,4,5-トリメチルチアゾール、鉱油中5%)で嗅覚選好試験でテストされました。VehマウスとCORTマウスには、実験の全期間中、それぞれビヒクルおよびビヒクル+コルチコステロン溶液を投与します。.Biorenderで作成。(C) 慣れ中にアリーナの異なるゾーンで過ごした平均時間 (グループ: F(1, 10) = 0.07588, p = 0.7886;ゾーン:F(2.224、22.24)= 6.939、p = 0.0036;交互作用: F(3, 30) = 0.7033, p = 0.5575)。(D)馴化(Hab)とさまざまな臭気(グループ:F(1, 10) = 4.193, p = 0.0678;臭気:F(3、30)= 11.80、p < 0.0001;交互作用: F(3, 30) = 1.489, p = 0.2375)。(E)CORTマウスは、OCTおよびPOについてVehよりも臭気ゾーンで過ごす時間が短い(グループ:F(1, 10) = 5.094, p = 0.0476;臭気:F(2、20)= 28.87、p < 0.0001;交互作用: F(2, 20) = 3.841, p = 0.0388)。(F)CORTマウスは、Vehと比較して臭気ゾーンに入る回数が少ないか、または匂いゾーンに入る傾向が少なかった（グループ）F(1,10)= 6.832、p = 0.0259;臭気:F(2、20)= 2.738、p = 0.0889;交互作用: F(2, 20) = 0.2902, p = 0.7512)。(G) CORT qmiceは、OCTおよびPOの下位選好指数を表示します(グループ:F(1, 10) = 5.895, p = 0.0356;臭気:F(2、20)= 20.83、p < 0.0001;交互作用: F(2, 20) = 1.437, p = 0.2611)。(H)臭気探索指数は、すべての臭気についてUCMSマウスで大幅に減少します(グループ:F(1、10)= 12.35、p = 0.0056;臭気:F(2、20)= 0.04381、p = 0.9572;交互作用: F(2, 20) = 0.3622, p = 0.7006)。(I)各匂いの匂い探索指数は、動物の感情スコアと正の相関があります(OCT:ピアソンR2 = 0.5601、F(1、10)= 12.73、**p = 0.0051;PO: ピアソン R2 = 0.4495, F(1, 10) = 8.165, *p = 0.0170;TMT: Pearson R2 = 0.5061, F(1, 10) = 10.25, **p = 0.0095)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

名前略称希釈原子価
2,4,5-トリメチルチアゾールTMTの5%の鉱物油－
2-トランスオクテナール10月1%の水ニュートラル
雌マウスの尿フー清い＋
オスのマウス尿ミュー清い＋
ピーナッツオイル発注書清い＋

表1:中性、正、負の原子価を持つ臭気の例。

補足ファイル1:4週間の予測不可能な慢性軽度のストレスに対するプロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

否定的な感情的偏見は、うつ病性障害の主要な特徴であり、病気の生理病理学をよりよく理解するために特に興味深いものです。したがって、うつ病様表現型の特徴付けを改善し、どの生物学的メカニズムが感情処理の根底にあるか、および病的状態におけるその変化を調査するために、前臨床モデルにおける感覚バイアスの評価を含めることが重要です。さらに、嗅覚は感情的な偏見を研究するための選択の感覚です。トランスレーショナルな観点からは、マウスとヒトの両方で感情処理を評価することは、動物倫理学的に関連性があります。さらに、嗅覚系と感情系は高度に絡み合っており、進化を通じて共通のニューロン構造を共有しています。嗅覚障害とうつ病10との間には強い相互関係があり、嗅覚は診断や治療の反応性、さらには基礎研究に使用される有望で強力なツールとなっています。

ここでは、うつ病の2つのマウスモデルにおける嗅覚感情バイアスを評価するための嗅覚選好テストのプロトコルを開発しました。重要なことに、この方法により、正と負の両方の原子価が変動する多種多様な刺激に対する応答と、病理学的条件下で値を変更する可能性のある中立刺激に対する応答を評価できます。これらの後の刺激は、テストの有効性に必須ではありませんが、実験に興味深い追加情報をもたらすことができます。このテストでは、さまざまな臭気濃度を使用して応答のスケーラビリティを評価することもできます。さまざまな快楽的価値観を持つ刺激に対する反応を評価し、うつ病の文脈でポジティブな感情処理とネガティブな感情処理を分離することが重要です。実際、前臨床の結果は、抗うつ薬治療が陽性と負の嗅覚処理を等しく一様に回復するわけではないことを示している14。先天的に顕著な食欲または嫌悪感のある嗅覚刺激の自発的な探求は、抑うつ様状態に関連する認知障害または動機付け障害からの交絡因子も防ぎます30,31。したがって、このプロトコルは長い学習フェーズを必要とせず、技術的な利点があります。この研究で使用された両方のモデルは成人期に実施された介入に依存しているため、このプロトコルが初期の逆境を含む他のうつ病の危険因子の評価にも敏感であるかどうかを評価するために、将来の実験が必要になることに注意することが重要です。

重要なのは、このプロトコルは男性と女性の両方に適用でき、女性は男性の2倍の確率でうつ病に罹患する可能性が高いため、これは重要であるということです。しかし、男性は、Shi et al.32でレビューされているように、社会的期待、恥、またはスティグマのためにうつ病から過小診断される可能性が高い。それにもかかわらず、うつ病は、症状学(臨床症状)、病因(生物学的原因)、および治療予測33,34,35の点で、男性と女性で異なるようですが、うつ病の多くのモデルとテストは、依然として主に男性被験者のみに設計されています。例えば、標準的な女性の尿嗅ぎテスト24は、同様のプロトコルを使用するが、独特の社会的な匂いの手がかりに依存している。非常に有益ですが、このテストは短い探索時間(コントロールで30秒)で、雌の尿は両性で同じ倫理学的および快楽的な重要性を持たないため、主に雄マウスに適応しています。最後に、嗅覚快楽反応は抗うつ薬治療に敏感であるように思われ14、私たちのテストは、フォーススイミングテスト36,37,38のような他の物議を醸すアッセイに取って代わる、うつ病様状態を確実に特徴付けるための選択ツールになります。

重要なことに、この試験は、前述の試験21,22,23と比較して、より長い刺激探索時間(100〜200秒)をもたらす。探索期間の延長は、このテストをニューロン活動のライブモニタリング技術と組み合わせる場合など、特に重要です。さらに、このテストは食物/水分の欠乏を必要としないため、代謝交絡因子を回避できます。最後に、この試験は光の期間中に実行できるため、実験の制約(逆サイクル、赤外線記録)が軽減されます。

ただし、このプロトコルを正常に実行するには、いくつかの技術的な手順が重要です。まず、実験は非常に制御されたストレスのない環境で行われることが不可欠です:照明は均一で明るすぎず、部屋に不快な音や臭いがあってはなりません。マウスは1日1回アリーナでテストでき、テストは毎日ほぼ同時に実施する必要があります。さらに、これらの実験を行う際には、動物のストレスを軽減するために、独自の実験者が推奨されます。

第二に、慣れの日を通じてアリーナの十分な探索を確保する必要があります。マウスが慣れ中にペトリ皿が置かれるゾーンのいずれかで平均して50秒未満を費やす場合、匂いをテストする前に1日または2日間の追加の慣れを追加できます。マウスがまだ十分に長くアリーナを探索していない場合は、分析から除外する必要があります。実験グループ間の慣れ中の「臭気ゾーン」の初期非対称な探索の場合、選好指数の計算は、例えば、各グループに関して、または慣れ中の彼ら自身の探索に関して、慣れ中に費やされた時間によって正規化することにより、異なる自発的な選好バイアスを補正するように適合させることができます。実際、別の問題は、実験グループ間のばらつきが大きいことです。問題が発生した場合、個体内変動を制限するために、マウスを同じ臭いで2日間連続して試験することができます。その後、結果を 2 日間で平均化できます。重要なことに、嗅覚反応の連続的なテストは、探索的行動14に有意に影響しないと想定されている。

臭気の準備に関しては、溶液はテストとは別の部屋で調製する必要があり、実験者は溶液が行動室で過度に拡散しないように注意する必要があります。最後に、溶液は、できれば試験の直前に調製し、臭気が消えたり汚染されたりしないように、無臭のガラスバイアルに保管する必要があります。マウスの雄や雌の尿のような一部の臭いは非常に食欲をそそると言われていますが、対照マウスが非常に正の原子価に関連する探索の読み出しを示さない場合は、溶液を確認する必要があります。特に、マウスの尿は、試験の直前(最大2〜3日前)に若いマウス(最大5か月齢)から新たに採取し、嗅覚特性を維持するために4°Cで保存する必要があります。注目すべきは、数日間連続して採取することで、雌マウスの発情周期期による影響を防ぐことができることです。必要に応じて、尿を-20°Cに保ち、長期間保存することができますが、この手順は臭気の強さを賢明に減らすため、推奨されません。同様に、ピーナッツオイルの知覚される心地よさも、たとえばバッチやブランドによって異なる場合があります。重要なことに、2つの異なる臭気または濃度の異なる臭気を、非臭気性の「コントロールゾーン」の代わりにコンパートメントに追加して、2つの臭気溶液間の好みを測定することができます。

最後に、嗅覚選好テストは、そのデザインを改善し、潜在的なアプリケーションを広げるために、さまざまな方法で適応させることができます。実際、運動の読み出しとは別に、このテストによる感情反応の評価は、感情のさまざまな要素を測定するためのさまざまな技術を組み合わせることによって改善できる可能性がある6。例えば、超音波マイクロフォンをアリーナの隣に配置して、超音波の発声を記録することができ、これは、特定の正および負の刺激に応答して発せられる24,39。体温は、赤外線カメラまたは埋め込み型リアルタイムテレメトリー送信機40、41、42を使用しても監視することができる。これらの送信機の一部は、心拍数および呼吸数43,44,45にアクセスすることさえできます。これらのツールを組み合わせることで、感情的な反応のより洗練された行動評価を構築することができます。嗅覚選好検査は、光遺伝学、ファイバー測光、ミニスコープライブイメージング、in vivo電気生理学記録など、感情調節障害の背後にあるニューロンメカニズムをさらに解明するための他の技術と簡単に組み合わせることもできます。最後に、このプロトコルは、感覚バイアスと快楽性嗅覚反応の評価を人間の研究に統合し、さらには診断または治療の反応性ツールとして、クリニックに簡単に翻訳できます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Agence Nationale de la Recherche (ANR) の Ref. ANR-11-IDEX-0004-02 および ANR-10-LABX-73、Agence Nationale de la Recherche (ANR-AAPG2021 "EMOKET")、生命保険会社 "AG2R-La Mondiale" が管理する Investissements d'Avenir プログラム、および Ecole Doctorale 158 (ED3C: Sorbonne Université, Université Paris Cité, Université Paris Sciences et Lettres) の支援を受けています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,4,5-トリメチルチアゾールシグマ・アルドリッチW332518-100G-K
2-トランスオクテナールシグマ・アルドリッチ52464-1MLの
ブルータックUHUの該当なし
濾紙フィッシャーサイエンティフィック1171012542.5ミリメートル
ガラスバイアルデュッチャー・ドミニク958983
鉱油シグマ・アルドリッチM5904-500MLです
ノルドゥス・エトヴィジョンノルドゥス・エトヴィジョンバージョン 17.5あるいは、オープンソースのICYソフトウェアまたはDeeplabcutのシングルマウストラッカーを使用することもできます
ペトリ皿隼35100760 mm x 15 mmのペトリ皿、直径5 mmのカスタムメイドの穴が7つある
プレキシガラスアリーナカスタムメイド 該当なし45 cm x 50 cm x 25 cmのプレキシガラスアリーナは、中央の37 cm x 25 cmの壁によって2つの部屋に分割されています。

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