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方法論記事

フリーフローティング正常ヒト上皮-線維芽細胞スフェロイド共培養物の生成

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DOI:

10.3791/68440

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2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cell Biology (Cancer Research), Medical Faculty, University of Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、マトリックスに頼らずにヒト肺上皮細胞と線維芽細胞を直接球状に共培養するための、シンプルで非常に実用的でありながら信頼性の高いプロトコールを紹介します。

要約

三次元(3D)培養システムは、自然な細胞特性と構造を再現する能力により、 in vitroで組織様構造を模倣するため、ますます人気が高まっています。これらのモデルの中で、半固体の細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれた球状の細胞凝集体(いわゆるスフェロイド)の培養は、細胞間および細胞-ECM相互作用の結果として異なる機能的細胞状態、ならびに酸素および栄養素の勾配を可能にするため、高度なin vivo に近い細胞培養モデルを表しています。スフェロイドは技術的に要求が少なく、比較的安価に入手できるため、薬物スクリーニングや毒性試験に頻繁に使用され、前臨床段階で新薬をテストするためのハイコンテントスクリーニングが可能になります。この目的のために、さまざまな腫瘍の3D構造が主に再現されます。同時に、マトリゲルは現在最も広く使用されているECMの1つであり、スフェロイドおよびオルガノイド培養のゴールドスタンダードと見なされていますが、これはマウスの実験に基づく3Dマトリックスであり、その抽出は一般的な動物実験と同様に、主要な倫理的懸念に関連しています。ここでは、ヒト気管支上皮細胞と線維芽細胞の直接球状共培養のためのマトリックスフリープロトコールを提示します。これは、特に(動物ベースの)キャリアマトリックスに頼らずに、それぞれのスフェロイド内の上皮-線維芽細胞のコミュニケーションと相互作用に関して、最適化された共培養法と見なすことができます。これらの浮遊性上皮-線維芽細胞様スフェロイド共培養物を、がん治療アプローチの正常(肺)組織毒性をモデル化するための患者志向の in vitro プラットフォームとして確立することにより、実験動物の数を減らすだけでなく、対応する動物実験の適切かつ有意義な置き換えも達成できます。

概要

平坦な単層細胞を培養し、増殖させ、細胞ベースの研究アッセイのためにプレーティングする二次元(2D)細胞培養は、標準的な前臨床スクリーニング手順1,2において、簡単で便利、かつ費用対効果が高く、広く使用されている方法であることに変わりはありません。in vitroでさまざまな種類の細胞間の相互作用(パラクリン)クロストークを研究するために、ある細胞タイプの馴化培地を別の細胞タイプの刺激に使用できます。さらに、共培養した細胞を微多孔質膜を用いて物理的に分離する間接法など、さまざまな共培養方法が登場しました。これらの「トランズウェルシステム」には、従来の2D細胞培養プレートに挿入するインサート(微多孔質膜)が含まれています。次に、一方の細胞タイプをメンブレン上で播種して増殖させ、コンパニオンウェル上で増殖するもう一方のタイプと同じ培地を共有するため、双方向のパラクリンコミュニケーションが可能になります2。2つの細胞型は、膜の両側に播種され、より直接的な細胞間接触共培養を形成することさえあり、これはバリア構造の組織の研究に適している3,4。

しかし、これらの高度な2D細胞培養システムの細胞応答は、対応する動物実験や臨床研究の結果を常に反映しているわけではなく、これはとりわけ、異なる細胞タイプ間の直接的なシグナル伝達の欠如、したがってin vivo様細胞組織の欠如によるものです。したがって、3次元(3D)培養システムは、天然のような細胞特性とin vitroで組織のような構造を模倣する構造の能力により、ますます人気が高まっています5,6。これらのモデルの中で、半固体の細胞外マトリックスに埋め込まれた球状細胞凝集体(スフェロイドと呼ばれる)の培養は、細胞間および細胞ECM相互作用に続くさまざまな機能的細胞状態、ならびに酸素および栄養の勾配を達成できる、より高度な細胞共培養モデルを提供する7。これらの望ましい、より複雑なin vivo様in vitro培養3D培養は、細胞の発達と分化を促進しながら、細胞集合サイズに関して均一に生成および維持する必要がありますが、それでも効果的で、迅速で、一貫性があり、便利です7,8。

自己凝集および接着の自然な特性を利用して、スフェロイド(主に腫瘍スフェロイド)は通常、吊り下げ技術9,10を用いて生成される。胚体を生成するために使用された最初の技術の1つとして、ハンギングドロップアッセイは、マウスベースでありながら、細胞外マトリックスの「ゴールドスタンダード」であるMatrigelを使用してECM包埋に先立って、重力と表面張力の原理に基づいて多数の均質なスフェロイドを生成するために広く使用されている方法となっています。足場のないアプローチ8,11でスフェロイドを生成するために、かなりの努力が払われた。例えば、スフェロイドは、攪拌機を備えた細胞培養ボトルを使用して作製することができ、したがって、細胞播種を防止することができ、これはスフェロイドを大規模に作製する最も簡単な方法である12。

細胞培養の複合体化、したがって in vivoのような in vitro の代替法のように生理学的に価値のあるシステムを確立する上で最も難しいことは、多くの異なるステップ(まだ確立する必要がある)を伴う複雑なプロトコルです。例えば、最初に方法を使用して細胞構造を生成し、それらを回収し、次にマトリックスに埋め込むこと、特に扱いにくいマトリックスを使用することは、メソッドを日常的かつ連続的に使用する前に、より説得力のある重要なステップです。ここでは、96ウェルフォーマットの超低接着プレートを使用しましたが、これにより、肺上皮細胞と線維芽細胞の複雑な3Dスフェロイドを確立するための培養器に細胞が実質的に付着することはありません。得られたスフェロイドは、24時間以内に非常に均一でかなり速く形成されるため、実験のタイムラインが短縮されます。長期にわたる培養、したがって信頼性の高い細胞増殖と分化は、全期間にわたって同じウェルで行われるため、最初のプレーティング後、培養期間全体にわたって培地を交換するだけで済みます。したがって、気道上皮を生理学的に近いレベルで形態学的および機能的に複製するヒト肺スフェロイドを生成するための、非常に単純で迅速、したがって非常に実用的なプロトコルを提示します。別の利点は、このプロトコルを他の細胞に容易に適応させることができることです。

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プロトコル

すべてのステップは無菌条件下で行われます(バイオセーフティキャビネット)。この研究で使用した培地組成については、 表1を参照してください。

1. 実験材料の準備

  1. 標準的なインキュベーター13 ( 表1を参照)を使用して、正常な上皮増殖培地中の標準的なプラスチック細胞培養皿(T75フラスコ)上でヒト正常肺上皮細胞(HBEC3-KT)を培養および増殖します。
    注:成長を改善するために、培地に10%ウシ胎児血清(FCS)を追加で補充することができます。
  2. 10%ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン10,14を添加したRPMI培地でヒト線維芽細胞(HS-5)を培養します(表1を参照)。
  3. DMEM/F12にN-2、B27、ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ血清アルブミン、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、KGF/FGF7、FGF10、ATRA、およびCHIR99021を添加することにより、分岐肺オルガノイド培地(BLO-Medium)を調製します。( 表1 および 資料の表を参照)。
    注:少なくともKGF / FGF7、FGF10、ATRA、およびCHIR99021を追加して、培地を新たに準備することをお勧めします。短期間でより多くの培地が必要な場合は、4°Cで数日(最大1週間)の短い保存期間のみをお勧めします。あるいは、市販のPneumaCult Airwayオルガノイド分化培地を使用することもできます。

2. 上皮細胞および線維芽細胞の調製

注:細胞が約80%のコンフルエントに達する場合は、両方の細胞タイプを使用してください。各セルタイプを別々に準備します。

  1. 培地を取り出して廃棄します。
  2. 細胞層を5mLのPBSで短時間すすいで細胞を洗浄します。
  3. 2 mLの0.5%トリプシン-EDTAを加えて上皮細胞をトリプシン化し、続いて37°Cで4〜8分間短時間インキュベートします。
  4. 5 mLの血清ピペットを使用して、正常な増殖培地または10% FCSを添加したPBSを添加することにより、丸みを帯びたほぼ分離した細胞を回収します。
  5. T75フラスコ内で(成長面に沿って)適切な量を数回上下させて、細胞凝集物をさらに分離し、細胞懸濁液を15mLチューブに移します。
  6. TEトリプシン処理を37°Cで3〜5分間、それぞれHS5線維芽細胞を採取します。
  7. 各細胞タイプ(したがってトリプシンを含まない)を遠心分離(例えば、室温[RT]で5分間300〜400×g)でペレット化し、カウントする前に1〜2 mLの正常な上皮増殖培地に再懸濁します(上皮細胞と線維芽細胞の両方)。
  8. 適切な量の再懸濁細胞を用いて生存細胞数を決定します。それぞれを0.4%トリパンブルーステインを用いて1/5に希釈し、ノイバウアー計数チャンバーで顕微鏡下で行いました。

3. 上皮線維芽細胞3次元スフェロイド培養物の作製

  1. 正常な上皮増殖培地中の細胞数を15 mLチューブで希釈します。96ウェルプレートの各ウェルについて、100μLの培地に50個の線維芽細胞を含む2000個の上皮細胞を計算します。1つの96ウェルプレートに適した細胞数は、10 mLの正常上皮増殖培地中の200,000個のHBEC細胞と5,000個のHS5線維芽細胞です。
  2. 10 mLの滅菌血清ピペットを使用して穏やかに混合します。
  3. 細胞懸濁液をマルチチャンネルマイクロピペット用の滅菌試薬リザーバーに移します。
  4. (12チャンネル)マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの細胞懸濁液を各ウェルに移すことにより、細胞を超低接着プレートに播種します。
  5. 標準的な細胞培養条件、37°C、5%CO2 、加湿雰囲気下でインキュベートします。
    注:スフェロイド形成は、倒立顕微鏡を使用した定期的な顕微鏡検査と、所望の時点ごとのスフェロイドの撮影によって評価されます。
  6. 4日後、1ウェルあたり100 μLのBLO-Mediumを作製したスフェロイドに加えます。
  7. さらに、加湿雰囲気中で37°Cおよび5%CO2 の標準細胞培養条件下でインキュベートします。

4. 定期的なメディア交換の実行

  1. 7〜8日後、定期的なメディア交換を行います。そのため、重力に応じてスフェロイドが傾く方向に沈むように、プレートをわずかな角度で配置してください。
  2. 上清を100〜200μLのピペットチップで慎重に、できるだけ最善を尽くして吸引します。
  3. プレートを水平に再配置し、ウェルあたり100〜150 μLのBLO培地を充填します(マルチチャンネルピペットを使用)
  4. 加湿雰囲気で37°Cおよび5%CO2 の標準的な細胞培養条件下でさらにインキュベートするか、実験/処理を開始します。
    注:スフェロイドは、より長い期間(最大21日間)培養することができます。その後、完全な培地交換を少なくとも週に2回実行する必要があります。

5. ダウンストリーム解析(スフェロイドの採取)

  1. スフェロイドのサイズ測定と体積計算を組み合わせて写真を撮ることにより、定期的な顕微鏡検査と文書化を行い、最終的にスフェロイドの成長と治療後の潜在的な成長変化を定量化することができます。
  2. 目的の時点でのライブセルイメージングを行うには、スフェロイドを1 μg/mL Hoechst 33342(またはDAPI)でさらに15分間インキュベートして核染色し、蛍光顕微鏡で解析します。
  3. 200 μLのピペットを使用して、生成したスフェロイドを所望の時点で回収し、出口を切り取り(無菌状態に保つ)、直径を大きくします。したがって、スフェロイドを含む培地も吸引します。スフェロイドを2〜5mLのチューブに組み合わせて収集します。2〜5分後、重力により回転楕円体が沈んだら、上清を取り除き、下流の解析に進みます。
  4. 全スフェロイドタンパク質溶解物を調製するには、採取したスフェロイドを含むチューブに氷冷溶解バッファー(150 mmol/L NaCl、1% NP40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、50 mmol/L Tris/HCl、pH 8、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加)を直接添加します。2〜3回の凍結融解サイクルの後、ライセートのタンパク質含有量を決定し、下流の分析、例えば、ウェスタンブロット分析15に進む。
  5. 全スフェロイドRNAライセートを作製するには、回収したスフェロイドが入ったチューブにRNA溶解バッファーを直接加え、使用する各RNA単離キットの製造元の指示に従ってRNA単離を行います。
  6. 免疫組織化学染色(IHC)および免疫蛍光染色の場合は、ステップ5.6.1〜5.6.3に従ってください。
    1. 回収したスフェロイドを1〜2 mLの4%パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で30分間処理し、その後、パラフィン包埋および切片化(3〜5 μm)を行います。
    2. 免疫蛍光染色の前に、下降する一連のアルコールを使用してサンプルを調製し、ターゲット賦活化溶液でインキュベートします。その後、ブロッキング溶液(2%正常ヤギ血清/PBS)でスライドをブロックして非特異的相互作用を減らし、一次抗体を4°Cで一晩インキュベートします。
    3. 蛍光標識された二次抗体により抗原を検出します。DAPIで核を対比染色します。追加の染色(PAS染色キットなど)は、組織学的評価のためのメーカーのプロトコルに従って行ってください。
  7. シングルセル懸濁液の場合は、ステップ 5.7.1 および 5.7.2 に従います。
    1. 回収したスフェロイドを100 U/mL DNase Iを含む1-2 mLのTrypLEに再懸濁した後、37°Cで15分間インキュベートします。 2-5% FCS、2 mM EDTA、および DNAse I を含む PBS を添加して消化を停止します。
    2. 下流の分析(フローサイトメトリーやシングルセル分析など)の前に、細胞溶液を70 μmの細胞ストレーナーに通して新しいコニカルチューブに入れます。
  8. シングルセルRNAシーケンシング解析では、ステップ5.8.1-5.8.3に従います。
    1. 製造元の指示に従って、(ヒト)シングルセルマルチプレックスキットを使用して、異なる時点または処理を表す目的の異なるシングルセル懸濁液を標識します。
    2. その後、サンプルを結合し、10,000〜40,000個の細胞を目指してシングルセルカートリッジのレーンにロードします。
    3. 単一細胞を取り出し、メーカーの指示に従って逆転写とライブラリ調製を行い、単離されたRNAのシーケンシングを行います。

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結果

このシンプルなプロトコールにより、ヒト気管支上皮細胞と線維芽細胞のマトリックスフリー球状共培養を超低接着プレートと組み合わせて行うことができます(図1A)。培養プロセスでは、最初に生成されたスフェロイドからより複雑な肺スフェロイドが徐々に形成され、生細胞イメージング(図1B)、免疫組織化学(図1C)、免疫蛍光(図1D)を用いた形態学的解析によって明らかなように、直接的な細胞相互作用を表す異なる上皮および線維芽細胞構造が効率的に生成されます).共培養された上皮細胞からそれぞれの細胞を区別するために、Turquoise2(シアン)蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現する(「空」の)レンチウイルスSINベクターを用いて形質導入した蛍光標識ヒトHS5線維芽細胞を用いた16。線維芽細胞が上皮細胞内に挿入されている場所には、一種のメインスフェロイドが現れますが(<...

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ディスカッション

このタイプの(共)培養は、in vivoに存在する生理学的、形態学的、および病理学的特性をよりよく模倣するため、3D細胞培養モデルは、2D培養とin vivo研究との間のギャップを埋めるために提案されている、なぜなら、より多くのin vivo様細胞-細胞相互作用、細胞-ECM相互作用、刺激に対する応答、遺伝子発現、タンパク質発現、および分化が存在するからである17。18.多数の、そして時には非常に複雑な腫瘍スフェロイド10,15,19,20に加えて、これらのスフェロイドは、正常組織検査11,21,22

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開示事項

著者は、個人的または組織的な利益相反はないと述べています。

謝辞

Mohammed Benchellal、Eva Gau、Sabine Senkel、Olga Kruseの優れた技術支援に感謝します。この研究は、連邦教育研究省(BMBF)(LuOrgNTT:16LW0293 to D.K., SeniRad:02NUK086C to V.J., D.K.)およびDFG Research Training Group 2762の支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 mL滅菌血清ピペット ThermoFischer170356NNunc滅菌血清学的ピペット、または同等の
15 mLコニカルチューブCorning430052または同等の
37 °C/5%CO2加湿 インキュベーター
5 mL 滅菌血清学的ピペット&NBSP;ThermoFischer170355NNunc滅菌血清ピペット、または同等の
50 mLコニカルチューブCorningCLS430829または同等の
ATRA(オールトランスレチノイン酸)StemCell TechnologiesCat#7226250 nM
B-27 Supplement (50x), ThermoFischer/GibcoCat#175040441x
BD Rhapsody WTA Amplification KitBD BioscienceCat#633801メーカーの指示に従って使用バイオ
セーフティキャビネット
シ血清アルブミンRocheCat#BSAVHS-RO0.4% (v/v)
セルストレーナーCorning352350ファルコン70&マイクロ;m 細胞ストレーナー、白色、滅菌済み、個別包装
心分離機Eppendorfhttps://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001例: Eppendorf Centrifuge 5804 - 卓上遠心分離機
DMEM/F12InvitrogenCat#11330-032500 mL
DNase I、RNase フリー (1 U/μL)サーモフィッシャーCat#EN0521100 U/mL 
EDTA(0.5 M)、pH 8.0、RNaseフリーのThermoFischerAM9260G2 mM
Eppendorf Researchと12チャンネルマルチチャンネルピペット エッペンドルフ例: #3125000044 (10–100 & マイクロ;L) または #3125000060 (30–300 & マイクロ;L)
子牛胎児血清ThermoFischer/GibcoCat#A525670110% (v/v)
HBEC3-KT ATCCCRL-4051ヒト正常肺上皮細胞株 
ヘパリン溶液 (0.2%)StemCell TechnologiesCat#79800.8 mL
Hoechst 33342 サーモフィッシャーCat#H13991 & マイクロ;g/mL
HS-5 ATCCCRL-3611ヒト間質線維芽細胞
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACFStemCell TechnologiesCat#78173.110 ng/mL
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF StemCell TechnologiesCat#78186.110 ng/mL
ヒト単一細胞マルチプレックスキットBD BioscienceCat#633781製造元の指示に従って使用
ドロコルチシン原液 StemCell TechnologiesCat#7926500 mL あたり 0.5 mL
ラデュビグルシブ (CHIR-99021)Biozol/SelleckchemCat#S12633 &M
L-アスコルビン酸シグマアルドリッチCat#A9290250 &g/mL
顕微鏡ZEISS
モノチオグリセロールシグマ アルドリッチCat#M61450.4 &M
N-2 サプリメント (100x)ThermoFischer/GibcoCat#175020481x
ノイバウアー計数チャンバーメルクBR718605例: BRAND 計数室 BLAUBRAND ノイバウアーパターン
ノーマルヤギ血清ThermoFischerCat#31873PBS
NP-40Merck/MilliporeCat#492016NP-40-Alternative、1 %
PAS 染色キットSigma AldrichCat#1016460001メーカーの指示に従って使用
PBSThermoFischerCat#100100231x
ペニシリン-ストレプトマイシン (10.000 U/mL)、100 xThermoFischer/GibcoCat#151401221 x
PFAThermoFischerCat#J61899。AKパラホルムアルデヒド、PBS
PneumaCult 気道オルガノイド分化培地 (ODM)StemCell TechnologiesCat#05060PneumaCult 気道オルガノイド基礎培地 (#05061, 360 mL) および PneumaCult 気道オルガノイド分化サプリメント* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus 培地StemCell TechnologiesCat#5040PneumaCult-Ex Plus Base Medium (#05041, 490 mL) と PneumaCult-Ex Plus 50X Supplement*(#05042, 10 mL) からなるキットプロ
テアーゼ阻害剤カクテルMerck/RocheCat#46931320011 タブ/10 mL
Rhapsody cDNA キットBD BioscienceCat#633773製造元の指示に従って使用
RPMI 1640 培地ThermoFischer/GibcoCat#11875093500 mL
塩化ナトリウムMerck/Sigma-AldrichS9625150 mmol/L
クエン酸ナトリウムMerck/Sigma-AldrichCat#1613859-1G0.10%
デオキシコール酸ナトリウムMerck/Sigma-AldrichCat#309700.50%
ドデシル硫酸ナトリウム Merck/Sigma-AldrichCat#116672890010.10%
マルチチャンネルマイクロピペット用滅菌試薬リザーバー(例:60 ml)ThermoFischer9510037または同等の
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 StückSarstedt (または facellitate)83.3925.400 (または F202003)超低アタッチメントプレート
Tris/HClThermoFischerCat#AM9855G50 mmol/L、pH 8
Triton X-100シグマ アルドリッチキャット #X100-5ML0.05 % 
トリパンブルー染色(0.4%)ThermoFischerCat#152500611/5 (v/v) NGMを含む
TrypLEThermoFischerCat#126040131x
Trypsin-EDTA (0.5 %)ThermoFischerCat#154000540.05 % トリプシン-EDTA(TE)溶液をリン酸緩衝生理食塩水(カルシウムおよびマグネシウムなし)を使用して無菌的に1Xに希釈した
WST-1試薬CELLPRO-RO、RocheCat#5015944001細胞増殖試薬 
ウの遠ヒ 中 4 %

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