Method Article

動的および3次元蛍光顕微鏡写真によるミトコンドリア形態の変化の理解

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ミトコンドリアの分裂と融合活動の経時的な3次元変化の定量化に役立つImageJプラグインであるミトコンドリアイベントローカライザー(MEL)について説明します。また、ImageJでの分析前の顕微鏡写真のクリーンアップに役立つ画像処理パイプラインについても説明します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアは、あらゆる動物の生存に不可欠な非常に動的な細胞小器官であり、宿主のニーズやストレスに応じて定期的な分裂および融合イベントを経験し、ミトコンドリアネットワークの絶え間ないリモデリングにつながります。このため、ミトコンドリアネットワークを3次元で、また経時的に評価できることは、ストレスや薬物介入などの要因にシステムがどのように反応するかを理解する上で利点をもたらします。細胞のミトコンドリアネットワークの蛍光イメージングにより、これらの変化を視覚化および監視することができます。ただし、ミトコンドリアネットワークは、標準化されていないメトリックによって定義される2次元の静的構造として説明されることがよくあります。そこで、ミトコンドリアネットワークにおける核分裂と融合のイベントを経時的に3次元的に検出するImageJプラグインツールであるミトコンドリアイベントローカライザー(MEL)用に画像を準備できるパイプラインの記述に着手しました。さらに、ミトコンドリア数の変化と形態学的変化に照らして、核分裂と核融合を理解することの利点について説明します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアは、すべての真核細胞に存在する非常に動的な細胞小器官であり、真核細胞にエネルギーを供給し、代謝を調節します。したがって、ミトコンドリアは細胞死と生存の交差点にあります。ミトコンドリアは、リソソームの酸性化や分子運動作用から筋肉の収縮やシナプスの発火に至るまで、さまざまなプロセスに不可欠であることが示されています1,2。

ミトコンドリアは、細胞の代謝需要とストレスに応答して ATP を効率的に生成するミトコンドリア ネットワークを維持するために、定期的な分裂および融合イベントを経験します。実際、ミトコンドリアは、ミトコンドリア断片の選択的除去であるマイトファジーを促進するために分裂を受けることが示されています。したがって、活発に呼吸し、脱分極していないミトコンドリアのみが細胞系に残ります3,4。ただし、核融合は、ニーズが増加した場合にネットワークのATP出力を増やす手段として発生します5,6。さらに、分裂と融合の両方がミトコンドリアDNAの分配と保護に重要な役割を果たすことも示されています7,8。核分裂と核融合の程度は、どちらかのプロセスが多すぎたり少なすぎたりすると有害であることが示されているため、健全なミトコンドリアネットワークを確保するために慎重な恒常性制御が必要であることに注意する必要があります。

過度の分裂は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびタウオパチーのATPレベルの低下を伴うミトコンドリアネットワークの断片化につながることが示されており9、10、11、低レベルの分裂は、脱分極ミトコンドリアの蓄積につながり、パーキンソン病のような症状につながる可能性があります12.ネットワークの過融合は、ATP 出力を増加させるためにストレス時に発生することが知られています。しかし、この状態で長期間存在すると、ROSレベルとオートファジー活性が増加し、細胞死が始まることが示されています9,12。

したがって、ミトコンドリアネットワークの状態を理解することは、細胞の状態、ひいては生物の状態を理解するための重要な洞察を提供することが明らかになります。健康と病気の文脈でミトコンドリアネットワークを理解することの明確な重要性、分裂および融合イベントを経験するミトコンドリアネットワークの能力、およびそれらが細胞の健康に及ぼす影響が、このプロトコルと関連する分析ツールの開発の動機となっています。具体的には、ミトコンドリアダイナミクスの特性評価を可能にするツールは、ほとんど限られており、文献では十分に説明されていません。

ミトコンドリアの形態は通常、共焦点顕微鏡とそれに続く計算分析を使用して決定されますが、ミトコンドリア組織を最もよく表しているため、評価のための品質を向上させるために生の顕微鏡写真をある程度処理する必要があります。このようにして、ユーザーは、数、体積、長さ、アスペクト比13、14、15など、ミトコンドリアネットワークの多くの形態計測結果を決定することができます。ユーザーは形態学的評価に2Dまたは3D顕微鏡写真を利用できますが、ミトコンドリアネットワークは3D構造で構成されているため、3D分析はより高い精度と洞察を提供します。核分裂と核融合を分析する目的で、ミトコンドリアネットワーク16の3次元性を最もよく補うz軸の顕微鏡写真の使用が推奨される。

多くの研究では、ネットワークを記述する手段として、ミトコンドリアを断片化、糸状、または中間状態に分類することが含まれます16,17。3D分析は、ミトコンドリアが細胞内で取るさまざまな形状のために特に有益です。研究に3次元性を追加すると、ミトコンドリアはz軸に沿って上下に移動する可能性が高いため、特にミトコンドリア数に自信が持てます。MELは、3Dキャプチャされた画像に依存するImageJプラグインです18。ここでは、TMREとHoechstで染色したGT1-7マウス海馬ニューロン細胞を利用して、ミトコンドリアネットワークと細胞の核を視覚化しました。次に、細胞を前処理パイプラインに通して配置し、画像解析の準備として顕微鏡写真の品質を向上させました。

静的指標に基づいてミトコンドリアの形態を決定できる多くの技術が利用可能になっています。核分裂および核融合活動を含み、ミトコンドリアの動的挙動を定量的に捕捉できるものはほとんどありません13,19,20,21。ここでは、ミトコンドリアの分裂と核融合活性に焦点を当てて、ネットワーク特性を決定する前に画像強調のためのプロトコルについて説明します。この技術が、ミトコンドリアの形態を決定するために以前に発表された方法をどのように補完できるかを示します。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 細胞処理と顕微鏡取得

  1. 10%FBSおよび1%ペンストレップ(完全培地)を添加したDMEMの8チャンバーディッシュでGT1-7細胞を培養します。細胞を一晩付着させてから、DMEMで10%FBSを含む2.5 mMの塩酸メトホルミンで72時間処理し、24時間ごとに培地を交換してください。イメージングの6時間前に10 μM CCCPで細胞を共処理し、イメージングの4時間前に400 nMのバフィロマイシンA1(Baf)で細胞を共処理します。
    注:これは、選択した真核細胞株で行うことができます。
  2. イメージングの前に、5 nM Hoechstと100 nM TMREを含む予熱した完全培地のカクテルを調製します。
  3. 細胞処理培地をイメージングカクテルに交換し、イメージング前に10分間のインキュベーション時間を待ちます。
    注:ミトコンドリアの動的活性により、細胞は、インキュベーションチャンバーを37°Cおよび5%CO 2に設定した顕微鏡を使用して画像化する必要があります。

2. イメージング

  1. 1.4 NAで100倍の倍率を使用して細胞を画像化します。
  2. 光退色を避けるのに十分な出力(~2%)になるように、レーザー出力を調整します。スキャン速度が速いことを確認してください。 512 x 512の解像度で画像をキャプチャします。
  3. Zスライス間隔を0.25μm刻みで設定します。このプロトコルに従うには、10個のZスタックで構成されるように細胞をイメージ化します。Zスタックの取得間隔なしで5つの時間枠を取得します。
    注:最適化されたら、ここにリストされているマクロでは、すべての細胞でイメージングプロトコルを標準化する必要があるため、このプロトコルは治療グループまたは実験グループ間で調整しないでください。

3. 計算評価

注:その後のすべての処理は、ImageJ v1.53tを使用して行われました。MELプラグインとサポートモジュールは https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin にあり、使用されているすべてのマクロは https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections にあります。

  1. 画像の準備
    1. ImageJでrawファイルを開きます。
    2. 1枚の顕微鏡写真から複数の細胞を切り取るには、まず、分析する単一細胞の数まで画像を複製します。
    3. ウィンドウ の同期 ツール、 フリーハンド描画 ツール、および色調整を使用して、視野内に複数のセルがある関心のセルの周囲に関心領域を描画します(補足図S1)。
    4. [ 編集] |外をクリアします。
    5. 赤と青のチャンネルを互いに分割し、ミトコンドリアチャンネルを として保存します。Tiffファイル。
  2. 点拡散関数の生成とデコンボリューション
    1. 点拡散関数(PSF)を生成するには、埋め込まれた顕微鏡写真情報を使用してPSFジェネレータプラグインを使用します。プラグイン |PSF Generator を使用してプラグインを開きます。さらに、画像 |情報を表示...または、I を押して画像情報を開き、一番下までスクロールします。ボクセルサイズと深度を使用して、情報の表示ボックスから、ピクセルサイズXYを166.1 nmに、Zステップを200 nmに変更します。波長を568 nmに変更し、サイズXYZを512 x 512の画像解像度と10個のZスライスのZスタックに一致させます(補足図S2)。
    2. プラグイン |マクロ |編集 |Deconvolution_time_lapse_mine.ijm マクロ。
    3. 入力行と出力行を編集し、実行を押します(補足図S3)。
  3. 画像のコントラスト強化とぼかし
    1. プラグイン |マクロ |編集 |Preprocessing.ijmです。
    2. Preprocessing.ijm マクロ内で、転がりボールの半径が 6 に等しい背景減算を使用します。Sigma Filter Plusは、半径が1、使用ピクセル数が2、最小ピクセル率が0.2に等しくなり、プラグインが外れ値を認識するように設定します。ブロックサイズが64になるようにCLAHE設定を調整します。ヒストグラムビンを 256、最大傾きを 2.5、ガンマを 0.8 に設定します。
      注: これらの設定はすべてデータセット向けに最適化されており、適用する前に値を代替データセット用に最適化する必要があります。シグマ フィルタリングは、画像を滑らかにし、近くのピクセルを効果的にブレンドして一貫した構造を確保するために適用されます。ローカルコントラストは、明るいピクセルと暗いピクセルの間のコントラストを高めるために適用され、ガンマの変化と相まって、バックグラウンドピクセルを最小限に抑えながらミトコンドリア構造の存在を高めます。
    3. 入力行を、デコンボリューションを行った顕微鏡写真を含むフォルダーに変更します(補足図S4)。
    4. [実行] をクリックします。
  4. 画像しきい値
    注:ユーザーは選択した任意のしきい値ツールを使用できますが、Qingzong Tseng(https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold)の適応しきい値プラグインをお勧めします。
    1. ImageJ の Preprocessed.ijm マクロによって変更された目的のファイルを開きます。
    2. プラグイン | adaptiveThr に移動します。
    3. ローカルしきい値を [加重平均] に設定し、ユーザーの好みに応じてピクセル ブロック サイズを設定します。
      注:ピクセルブロックサイズは、体積やアスペクト比などのミトコンドリアの寸法評価に影響を与えるため、細胞間で一貫性を保つ必要があります。
    4. 時間を最適化するには、 プレビュー をクリックし、できるだけ多くのミトコンドリアが明確に含まれるように ブロックサイズ を調整します。また、各セルの減算値を調整して、不要な背景を排除します。減算値に関連付けられたフォルダーに顕微鏡写真ファイルを保存します(補足図S5)。
      注: Threshold.ijm マクロには、小さな粒子を除去するためのサイズ フィルターが含まれています。
    5. プラグインを選択 |マクロ |編集 |Threshold.ijm です。
    6. マクロスクリプトのinput_path行とoutput_path行、およびblockSizeを編集し、行を減算します(補足図S6)。
    7. [実行] をクリックします。
  5. ミトコンドリアイベントローカライザー(MEL)プラグインによる核分裂および核融合イベントの検出
    注:MELは、一度に1つのTiffとして保存される1つのチャンネルで構成されるzスタックのタイムラプスシーケンスを処理するように設計されています。これは、入力行を対象のしきい値付きTiffファイルに変更することで実現できますが、ImageJの concatenate 関数を使用して複数のTiffファイルを一度に処理する方法も示します。
    1. 同じ治療条件に属する最大10枚の閾値付き顕微鏡写真を開きます。
      注:これが機能するには、顕微鏡写真に同じ数のzスライスが必要です。
    2. 画像に移動 |スタック |ツール |連結して [OK] を押します。
    3. しきい値によって残された残りの小さな涙点を削除するには、 プラグイン |インテグラル画像ファイラー |外れ値を削除します。 プレビュー を使用して、必要なフラグメントを削除する X サイズと Y サイズを設定します。
    4. 連結されたファイルを Tiff として保存します。
    5. プラグイン |マクロ |編集 |Quicktest_new.ijmを開き、必要に応じて入力パスと出力パスを編集します(補足図S7)。
      注:完了すると、出力フォルダに「MEL_results」というフォルダが見つかり、すべてのMEL結果が表示されます。これらは、各時点で検出された核分裂および核融合イベントとして示され、MELの仕組みにより、最後の時点は常に削除する必要があります18。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

適切なセルの選択
ユーザーは、ミトコンドリアネットワークが細胞の有糸分裂状態に応じて変化することに注意する必要があります。核がダンベルまたはU字型に見える場合、または核の近くに蛍光シグナルのない空間がある場合、これは細胞が有糸分裂に近づいていることを示している可能性があります。この状態では、ミトコンドリアは、治療介入やネットワークへの影響ではなく、細胞分裂によって分裂している可能性があります(補足図S8)。

メトホルミンは、ミトコンドリア融合を誘導することが示されている抗糖尿病薬です22。GT1-7マウス視床下部細胞を、ミトコンドリア分解を阻害するために400 nMのバフィロマイシン(Baf)で4時間、ミトコンドリアの脱分極を引き起こすために10 μM CCCPで6時間、および5 mMの塩酸メトホルミン(Metf)で72時間処理した後、DMEM中のTMREとHoechstを含むカクテルでインキュベートしました。生画像は、405 nm および 561 nm レーザ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ミトコンドリアの形態を説明するためのアプローチの数は増えていますが、ミトコンドリアのダイナミクスを定量的に適切に捉えるために利用できる技術は限られています。さらに、ミトコンドリアネットワークの形態とこの形態を支配するメカニズムは本質的に多様であることに注意する必要があります。これにより、エネルギー出力を強化するための分岐形成から、マイトファジーを促進するための時間的に異なる分裂領域に至るまで、細胞のニーズにリンクされたネットワークが形成されます24,25。このプロトコルは、細胞内のミトコンドリアの分裂および融合イベントの変化を測定することを目的としており、それによって 3D および経時的なミトコンドリアの動的な変化に関する洞察を提供します。取得および分析パイプラインは、TMRE染色ミトコンドリアの潜在的な光退色を補正する試みを示し、必要に応じてイメージング時間を延長することができます。

画像取得後、...

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Disclosures

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著者には宣言すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は、南アフリカのステレンボッシュ大学、南アフリカ医学研究評議会(SAMRC)、南アフリカ国立研究財団(NRF)、カナダ衛生研究所(CIHR)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)から資金提供を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8つのチャンバーディッシュサーモフィッシャー#Z734853
調整されたしきい値https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
バフィロマイシンA1LKTラボ#B0026
シアン化カルボニルクロロフェニルヒドラゾン(CCCP)メルク#C2759
共焦点顕微鏡カールツァイスAGLSM780 ELYRA PS.1超解像プラットフォーム
ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)サーモフィッシャー#341956062
ウシ胎児血清 (FBS)シグマ・アルドリッチ#F0679
Githubリンクhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad プリズム v7.06
GT1-7セルATCCのSCC116
ホエクシュトシグマ・アルドリッチH6024
イメージJ v1.53tフィジー
マクロhttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
メトホルミン欧州薬局方M06050000
ペニシリン/ストレプトマイシン(PenStrep)シグマ・アルドリッチ#P4333
T25のバイオスマート科学#70025
TMREのサーモフィッシャー#T669
トリプシンシグマ・アルドリッチ#T4049

References

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