Method Article

動的および3次元蛍光顕微鏡写真によるミトコンドリア形態の変化の理解

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

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ここでは、ミトコンドリアの分裂と融合活動の経時的な3次元変化の定量化に役立つImageJプラグインであるミトコンドリアイベントローカライザー(MEL)について説明します。また、ImageJでの分析前の顕微鏡写真のクリーンアップに役立つ画像処理パイプラインについても説明します。

Abstract

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ミトコンドリアは、あらゆる動物の生存に不可欠な非常に動的な細胞小器官であり、宿主のニーズやストレスに応じて定期的な分裂および融合イベントを経験し、ミトコンドリアネットワークの絶え間ないリモデリングにつながります。このため、ミトコンドリアネットワークを3次元で、また経時的に評価できることは、ストレスや薬物介入などの要因にシステムがどのように反応するかを理解する上で利点をもたらします。細胞のミトコンドリアネットワークの蛍光イメージングにより、これらの変化を視覚化および監視することができます。ただし、ミトコンドリアネットワークは、標準化されていないメトリックによって定義される2次元の静的構造として説明されることがよくあります。そこで、ミトコンドリアネットワークにおける核分裂と融合のイベントを経時的に3次元的に検出するImageJプラグインツールであるミトコンドリアイベントローカライザー(MEL)用に画像を準備できるパイプラインの記述に着手しました。さらに、ミトコンドリア数の変化と形態学的変化に照らして、核分裂と核融合を理解することの利点について説明します。

Introduction

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ミトコンドリアは、すべての真核細胞に存在する非常に動的な細胞小器官であり、真核細胞にエネルギーを供給し、代謝を調節します。したがって、ミトコンドリアは細胞死と生存の交差点にあります。ミトコンドリアは、リソソームの酸性化や分子運動作用から筋肉の収縮やシナプスの発火に至るまで、さまざまなプロセスに不可欠であることが示されています1,2。

ミトコンドリアは、細胞の代謝需要とストレスに応答して ATP を効率的に生成するミトコンドリア ネットワークを維持するために、定期的な分裂および融合イベントを経験します。実際、ミトコンドリアは、ミトコンドリア断片の選択的除去であるマイトファジーを促進するために分裂を受けることが示されています。したがって、活発に呼吸し、脱分極していないミトコンドリアのみが細胞系に残ります3,4。ただし、核融合は、ニーズが増加した場合にネットワークのATP出力を増やす手段として発生します5,6。さらに、分裂と融合の両方がミトコンド

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Protocol

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1. 細胞処理と顕微鏡取得

  1. 10%FBSおよび1%ペンストレップ(完全培地)を添加したDMEMの8チャンバーディッシュでGT1-7細胞を培養します。細胞を一晩付着させてから、DMEMで10%FBSを含む2.5 mMの塩酸メトホルミンで72時間処理し、24時間ごとに培地を交換してください。イメージングの6時間前に10 μM CCCPで細胞を共処理し、イメージングの4時間前に400 nMのバフィロマイシンA1(Baf)で細胞を共処理します。
    注:これは、選択した真核細胞株で行うことができます。
  2. イメージングの前に、5 nM Hoechstと100 nM TMREを含む予熱した完全培地のカクテルを調製します。
  3. 細胞処理培地をイメージングカクテルに交換し、イメージング前に10分間のインキュベーション時間を待ちます。
    注:ミトコンドリアの動的活性により、細胞は、インキュベーションチャンバーを37°Cおよび5%CO 2に設定した顕微鏡を使用して画像化する必要があります。

2. イメージング

  1. 1.4 NAで100倍の倍率を使用して細胞を画像化します。

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Results

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適切なセルの選択
ユーザーは、ミトコンドリアネットワークが細胞の有糸分裂状態に応じて変化することに注意する必要があります。核がダンベルまたはU字型に見える場合、または核の近くに蛍光シグナルのない空間がある場合、これは細胞が有糸分裂に近づいていることを示している可能性があります。この状態では、ミトコンドリアは、治療介入やネットワークへの影響ではなく、細胞分裂によって分裂している可能性があります(補足図S8)。

メトホルミンは、ミトコンドリア融合を誘導することが示されている抗糖尿病薬です22。GT1-7マウス視床下部細胞を、ミトコンドリア分解を阻害するために400 nMのバフィロマイシン(Baf)で4時間、ミトコンドリアの脱分極を引き起こすために10 μM CCCPで6時間、および5 mMの塩酸メトホルミン(Metf)で72時間処理した後、DMEM中のTMREとHoechstを含むカクテルでインキュベートしました。生画像は、405 nm および 561 nm レーザ.......

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Discussion

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ミトコンドリアの形態を説明するためのアプローチの数は増えていますが、ミトコンドリアのダイナミクスを定量的に適切に捉えるために利用できる技術は限られています。さらに、ミトコンドリアネットワークの形態とこの形態を支配するメカニズムは本質的に多様であることに注意する必要があります。これにより、エネルギー出力を強化するための分岐形成から、マイトファジーを促進するための時間的に異なる分裂領域に至るまで、細胞のニーズにリンクされたネットワークが形成されます24,25。このプロトコルは、細胞内のミトコンドリアの分裂および融合イベントの変化を測定することを目的としており、それによって 3D および経時的なミトコンドリアの動的な変化に関する洞察を提供します。取得および分析パイプラインは、TMRE染色ミトコンドリアの潜在的な光退色を補正する試みを示し、必要に応じてイメージング時間を延長することができます。

画像取得後、.......

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Disclosures

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著者には宣言すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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この研究は、南アフリカのステレンボッシュ大学、南アフリカ医学研究評議会(SAMRC)、南アフリカ国立研究財団(NRF)、カナダ衛生研究所(CIHR)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)から資金提供を受けました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8つのチャンバーディッシュサーモフィッシャー#Z734853
調整されたしきい値https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
バフィロマイシンA1LKTラボ#B0026
シアン化カルボニルクロロフェニルヒドラゾン(CCCP)メルク#C2759
共焦点顕微鏡カールツァイスAGLSM780 ELYRA PS.1超解像プラットフォーム
ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)サーモフィッシャー#341956062
ウシ胎児血清 (FBS)シグマ・アルドリッチ#F0679
Githubリンクhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad プリズム v7.06
GT1-7セルATCCのSCC116
ホエクシュトシグマ・アルドリッチH6024
イメージJ v1.53tフィジー
マクロhttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
メトホルミン欧州薬局方M06050000
ペニシリン/ストレプトマイシン(PenStrep)シグマ・アルドリッチ#P4333
T25のバイオスマート科学#70025
TMREのサーモフィッシャー#T669
トリプシンシグマ・アルドリッチ#T4049

References

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  1. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  2. Bhabha, G., Johnson, G. T., Schroeder, C. M., Vale, R. D. How dynein moves along microtubules. ....

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Mitochondrial MorphologyMitochondrial DynamicsFluorescence MicrographsMitochondrial FissionMitochondrial FusionThree Dimensional ImagingImageJ AnalysisMitochondrial NetworkDeconvolution MicroscopyMitochondrial Event Localizer

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