同時灌流マッピングによるアメロイド収縮筋留置による慢性心筋虚血の臨床的に関連するブタモデル

サマリー

このプロジェクトの目標は、近位左回旋冠動脈 (LCx) の周囲にアメロイド収縮筋を外科的に配置し、それによって慢性冠動脈疾患を誘発し、同位体標識マイクロスフェアを使用して虚血領域を正確にマッピングする、徹底的に精査されたプロトコルを詳細に説明することです。

要約

心血管疾患の治療のための医学的および処置的治療における画期的な進歩にもかかわらず、診断ツールと治療戦略を調査するには、トランスレーショナル大型動物モデルの必要性が根強く残っています。豚は、心臓の解剖学的構造と生理学、および代謝およびプロテオミクスプロファイルによく似ているため、ヒトの心血管疾患の非の打ちどころのない正確で適切なモデルを表しています。アメロイド収縮剤を使用した心筋領域への慢性心筋虚血の誘導は、ヒトにおけるアテローム性動脈硬化症の発症とその後の心筋反応の一般的な病態生理学的プロセスを正確かつ容易にエミュレートします。アメロイドコンストリクターは過去50年間にわたって広く研究されており、その使用に関する厳密な証拠を提供しています。さらに、当社はこの手順を効率的かつ均一に実施してきた 20 年以上の経験があります。このプロトコルの重要なステップは、冠状動脈血流マッピングを実行して、同位体標識マイクロスフェアを注入することにより、最大の虚血の領域と虚血のない領域を決定することです。冠動脈血流マッピングを実行する能力により、灌流研究および虚血領域の決定に心臓 MRI または PET イメージングが必要かつ労働集約的な使用が妨げられます。この出版物の目的は、近位 LCx 上のアメロイド コンストリクターの正しい配置と、その後の冠動脈灌流マッピングを詳しく説明することです。

概要

世界的に、虚血性心疾患 (IHD) の死亡率と患者と医療制度への負担は増大する一方です。米国心臓協会によると、1990 年から 2021 年にかけて IHD に起因する死亡者数は世界中で 74% 増加しました¹。これは米国内でも当てはまり、米国疾病管理センターは、成人の20人に1人が冠動脈疾患(CAD)と診断されており、死亡の約5人に1人が心血管疾患によるものであり、これは33^秒ごとに心血管疾患で死亡する人に相当します2。この病気の負担は医療制度にストレスを与えており、2019年から2020年にかけて心血管疾患患者に2,500億ドル以上が費やされました²。心血管疾患の遍在性と患者と医療提供者の両方への深刻な負担を考慮すると、革新的で新しい治療法の研究を継続することが不可欠です。

このような目標を達成するには、臨床的に関連する動物モデルを採用し、再現性のあるトランスレーショナル研究の基準を満たすために精査する必要があります。動物モデルは、薬物動態が異なる異種の動物種、望ましい病態を誘発するためのプロトコルの違い、薬物の投与量とスケジュールの変動、無作為化動物の標準化の不十分さ、追跡期間、研究者の盲検化、そして最後に、小規模な実験グループ化など、さまざまな理由で疑問視されてきました³.IHD だけでなく、外科的プロトコル、動物の無作為化、薬物送達と期間、およびその後の結果も表すために、動物モデル全体のプロトコルを実験的に改良および標準化しました。IHDに関しては、豚は心臓の解剖学的構造と生理学において人間と非常に類似しているため、最適な動物モデルを表しています。重要なことに、豚は人間と同様の冠動脈分布を持ち、側副循環が最小限に抑えられているため、虚血の誘発はヒトのアテローム性動脈硬化症の発症の信頼できる表象となっています。さらに、豚は人間と同様の代謝、プロテオミクスプロファイル、免疫系を持っているため、治療薬の分子的影響の分析がより有意義になります⁴。これを念頭に置いて、このプロトコルで採用されている動物モデルは、ヒトの心血管病態生理学を再現性よく表現するのに最も適しています。

私たちの研究室では、LCx 上にアメロイド コンストリクターを外科的に配置し、心筋虚血の慢性誘発を可能にします。この技術を使用して慢性的に虚血を誘発すると、急性結紮に比べて独自の利点が得られます。1つは、このデバイス5^{を使用した}数十年にわたる広範な研究文献です。さらに、ヒトのアテローム性動脈硬化症の発生による段階的な冠動脈狭窄の信頼性の高い臨床シミュレーションが可能になり、最後に、血流が^{完全に停止した}であろう心筋を温存することによる動物死亡率の改善が可能になります6。アメロイドコンストリクターには、チタン製の外輪と内側の吸湿性プラスチック層の2つの部分があります。冠状動脈の周囲に配置されると、内輪はその後体液を吸収し、2〜4週間にわたって制限鋼スリーブにより内側に膨張^{します7。}LCx の周囲に配置される戦略は、これが 3 つの主要な冠状動脈の中で最も小さく、心筋⁷ の約 20% に影響を与えるため、死亡率の利点をもたらします。虚血領域を均一に生成するには、鈍角辺縁動脈を分岐させる前に、アメロイドをLCxテイクオフに配置する必要があります。

このプロトコルで採用されているさらなる考慮事項は、虚血の誘発を決定するための確認的な冠動脈血流マッピングと、治療薬の心筋効果を調査する際の正しい領域の使用です。この目的のために、LCxが完全に閉塞したアメロイド留置時に、BioPhysics Assay Laboratory, Inc.の金マイクロスフェア注入を採用しています。金の微小球の定量化が最も低いセクションは、最も虚血性の左心室領域を表します。実験的処理によって生成される分子修飾を決定する場合、マッピングの重要性はどれだけ強調してもしすぎることはありません。さらに、同位体標識マイクロスフェアの使用は、心筋灌流を測定するための心臓磁気抵抗イメージングと比較して費用対効果の高い方法を提供します⁸。

最後に、ここで説明するモデルは、心血管疾患の発症とその後の治療反応における男女間のよく知られた変動を考慮しています。前臨床動物モデルは、ヒト集団の違いを忠実に表現できないことがよくあります。したがって、対照群と実験群で利用された豚の性別を雌豚と無傷の雄豚の間で照合します。私たちは以前、新しい治療法に対する性別に基づく反応を決定するためにこれを使用しました⁹。このプロトコルの翻訳可能性をさらに高めるのは、治療群の無作為化の使用と、各ブタの心臓機能および心筋灌流パラメーターを分析する研究者の盲検化です。

プロトコル

以下に詳述する外科的処置は、ロードアイランド病院とブラウン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 動物モデル

1. ヨークシャー豚の幼体と無傷の雄の両方を使用し、理想的には生後約11週齢、通常体重は約15kgです。

2. 術前処置

1. 豚が手術の 1 日前から術後 5 日まで、術前および術後にアスピリン (10 mg/kg) を毎日投与されるようにしてください。
2. 手術当日の朝、豚が餌を食べていないことを確認してください。
3. 手術当日は、テラゾール(4.4mg/kg)とキシラジン(2.2mg/kg)の筋肉内注射で麻酔を誘発します。
4. 適切なサイズ(通常は7-0)のカフ付き気管内チューブで豚を挿管します。
5. 同時に、ブプレノルフィンを0.03mg/kgで投与し、フェンタニルパッチ(4μg/kg)を塗布することにより鎮痛効果を発揮します。
6. 20〜22 Gの静脈内(IV)カテーテルを太い耳介静脈に留置します。
7. IV 輸液 (0.9% 生理食塩水) を 5 mL/kg/h の速度で開始します。
8. 広域スペクトルのセファロスポリン系抗生物質であるセフチオフールを投与します。これは通常、単回投与の IM 注射として切開から 30 分以内に行われます。
9. 手術部位(左肩から臍まで)およびリード位置を監視する心電図(ECG)でブタを剃ります。
10. 豚を手術室に運び、0.75〜3.0%イソフルランで麻酔を維持します。
11. 豚を心電図モニターに接続し、電気焼灼接地パッドを適用します。
12. 豚を手術台に適切に配置します:右側を下にして、左前肢を伸ばしてテーブルに縛り付け、テーブルの右側を上に傾けます。
13. 2%クロロヘキシジンスクラブで手術部位を準備します。
14. 切開部位に、4つの小さなスティックオンドレープと1つの大きな開腹ドレープでドレープします。

3.外科的処置

1. 予想される切開部位に 2% リドカインを皮下注射することから始めます。
2. 次に、#10メスを使用して、腋窩皮膚のひだの近くから斜めに約5cmの切開を行い、横方向に進みます。これは、2^番目 から^3番目の 肋間腔のあたりです。
3. #10メスを使用して、筋膜層に到達するまで、筋肉層を通してこの切開を続けます。
4. このとき、電気焼灼を使用して皮膚と筋肉の止血を実現します。
5. 鎖骨を触診できるようになるまで、筋膜の場所を上に鈍く開きます。
6. これが達成されたら、肋骨のスペースを触診し、2^番目の リブのスペースが特定されていることを確認します。
   注:通常、^第 2肋間腔は、フィールドのわずかに優れたビューを達成し、アメロイドコンストリクターの近位配置を容易にします。豚の解剖学的構造により、第3^肋間腔 に入る必要がある場合があります。
7. 電気焼灼で肋間筋にスコアリングを付け、大きなケリークランプで胸膜腔に入ります。
8. この開口部を電気焼灼で内側と外側に伸ばし、大きなケリークランプをガイドとして肺と心膜を保護します。
9. 小さなフィノチエット リトラクターを導入して、肋骨を広げます。
10. 濡れたガーゼを置き、肺を左胸膜腔に押し戻します。これにより、心膜の視野が広がります。
11. Debakey鉗子を使用して心膜をテントアップし、Metzenbaumはさみで小さな切り込みを入れます。これを内側および外側に伸ばして、左心耳を露出させます。肺に向かって横方向に伸びるときは、肺と横隔神経を特定して保護します。
12. 必要に応じて、3-0シルク縫合糸を使用して心膜を固定します。
13. 小さなサチンスキークランプを使用して、左心耳の遠位部分をつかみ、0シルクタイを使用してこの部分を結紮します。小さな止血剤を使用して、付属肢を引っ込めてLCxとLADを露出させます(図1A)。
14. 血管が露出したら、ジェラルド鉗子に切り替え、左主冠状動脈からの離陸近くのLCxを覆う心外膜脂肪にメッツェンバウムハサミで小さな傷をつけます。
15. 小さな直角と Allis クランプのピーナッツ スポンジを使用して、LCx を注意深く解剖します。動脈を直角に囲んだら、血管ループを配置して完全に隔離します。両端に小さな止血剤を置きます。
16. このとき、血栓形成を防ぐために豚を全身的に80 IU / kgでヘパリン化します。
17. 心筋灌流マッピングを実行します。
    メモ: この手順には 2 人のアシスタントが必要です。2分間の時間を計る手術室の技術者であることを確認してください。もう一人は外科助手でなければなりません。
    1. LCxを完全に閉塞するために血管ループをゆっくりと引っ込めるようにアシスタントに指示します。ECGモニターでSTセグメントおよび/またはT波の変化を表示して、閉塞を確認します。
    2. 閉塞の最初の30秒間に、28 G針を使用して5 mLの金マイクロスフェアを左心耳に注入します(図1B)。注射の中間点で注射器を引き戻して、血液を視覚化します。これは、左心房内で針を正しく配置し、その後正確なマッピングを行うために重要です。
    3. 注射が完了したら、ピーナッツスポンジを使用して、止血が達成されるまで注射部位を圧力保持します。圧力で止血ができない場合は、6-0ポリプロピレン縫合糸で小さな8の字縫合糸を配置します。
    4. ECG の変化を視覚化しながら、2 分間ずっと血管ループを引っ込め続けるように手術助手に指示し、LCx の閉塞を確保します。
18. 2 分後、ECG の変化が治まったら、近位 LCx 血管の周囲にアメロイド コンストリクターを配置します。サイジングは目視検査に基づいており、通常は 2.0 mm から 2.75 mm の範囲です。アメロイドをアリスクランプまたはケリークランプでつかむと、適用が容易になります(図1C)。アメロイドが十分に潤滑されていることを確認してください。
19. 手術助手に、ジェラルド鉗子および/またはピーナッツスポンジのいずれかで解剖によって作成されたポケットを引っ込めてスペースを開いてもらいます。鍵穴を通してアメロイドを動脈にそっと導き、鍵穴が外側に回転していることを確認します(図1D)。
20. アメロイドがその位置ができるだけ近位にあることを確認します。これは、配置とその後の虚血領域の均一性を維持するのに役立ちます。
21. 血管ループを取り外し、局所ニトログリセリン(~2 mL)を動脈にスプレーして、さらなる血管痙攣を防ぎます。
22. 心耳のネクタイを切断し、元の位置に戻します。
23. 逆ベベル(RB)針で3-0吸収性縫合糸を使用して心膜を閉じます。
24. 濡れたガーゼを取り出し、肺を引っ込めて、怪我がないか検査することを忘れないでください。
25. 鈍い先端の針に 0 ポリジオキサノン縫合糸 (PDS) を使用して、肋骨のスペースを再近似します。
26. 3-0吸収性縫合糸で筋肉層を閉じ、ほぼ閉じたら、吸引に接続された小さな赤いゴム製カテーテルを胸膜腔に導入します。主治医が最終縫合糸を固定するときに、息を止めて助手に赤いゴムを空洞から引き抜いてもらいます。これにより、胸膜腔内の空気が確実に排出されます。
27. 皮下層を3-0吸収性縫合糸で閉じ、皮膚を皮下4-0モノクリル縫合糸で閉じます。
28. 切開部位に滅菌包帯を置きます。

4. 術後のケアと回復

1. イソフルランの離乳を開始します。
2. 豚が目覚めるのを待っている間、切開包帯をガーゼと伸縮性のあるラップで固定します。
3. 豚が自力で呼吸できるようになったら、気管内チューブを取り外します。
4. 獣医チームの監視下で、熱サポート付きのパッド入りの回復ケージで豚を回復させます。
5. 繰り返しになりますが、血栓のリスクを軽減するために、アスピリンは術後 5 日目まで継続されます。術前にフェンタニルパッチを貼り、3日間貼り付けて鎮痛効果を発揮します。
6. 豚の術後チェックを1日2回、3日間完了します。通常、豚はこの期間中、不整脈や梗塞を経験しません。
   注:術後14日目頃には、早期のアメロイド閉鎖および/または自発的な心室性不整脈が発生する可能性が高いことに注意してください。グループは、アミオダロンやリドカインなどの予防的抗不整脈薬を使用してこの期間のトラブルシューティングを行う可能性があり、これは議論でレビューされます。さらに、継続的な心電図モニタリングも利用できます。しかし、それは非常に労働集約的であり、豚で維持するのは困難です。

結果

上記の手順を実行してから 20 年以上で、生存率は約 80% ^{です 10,11}。死亡の大部分は術後約 2 週間で発生し、多くの場合、アメロイド閉鎖時の不可逆的で自発的な心室性不整脈が原因です。以前の複数の剖検では、典型的な所見は、左心室の急性瘢痕形成が最小限に抑えられた適切に配置されたアメロイドを示し、心室性不整脈の診断を確認します。不整脈は心臓突然死につながりますが、これがどの動物で発生するかを予測することは非常に困難です。したがって、術後最初の 2 週間は継続的な心電図モニタリングを検討しました。しかし、侵襲的な性質と適切な心電図トレースを維持するための作業負荷が、モニタリングの有用性を上回っていることが判断されました。2週間後、生存率は100%に近づきます。

おそらく、この手順からの最も重要な結果は、心筋灌流の異なるマッピングです。金の微小球の定量化により、各左心室セクションの絶対血流を測定できるため、どのセグメントが最も虚血性で、どのセグメントが最も虚血的で...

ディスカッション

アメロイドコンストリクターを使用する主な利点は、デバイスのシンプルさです。ただし、これにより、閉鎖率や冠状動脈周囲の狭窄の程度を制御できないという制限が生じます。これは、心筋虚血の誘発にばらつきをもたらす可能性があります。アメロイドコンストリクターの使用に代わるものとしては、シルクタイ、油圧オクルーダーの使用、またはフロープローブ^{12、13、14、15、16}の連続配置が挙げられる。シルクタイと閉塞器の使用は、特定の冠状動脈の閉塞の正確な割合を提供する固定狭窄モデルを作成するためによく採用されますが、多くの場合、より高い死亡率によって相殺されます^12,15

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#10 メス	メドライン	MDS15310
生理食塩水 0.9%	デクラ/ベティベックス	17033-492-50	速度:ケース中5 mL/kg
0-シルクタイ	エチコン	SA76G型	左心耳を結びます
1-0 CT鈍器チップのPDS II	エチコン	Z359T型	リブスペースを閉じる
2% リドカイン	フェニックス		投与量:2–5 mg / kg
SHテーパーの2-0シルク縫合糸	エチコン	K833H型	タック心膜
28ゲージ針	パターソン獣医	78032728	マイクロスフェア注入用
3 18G針	パターソン獣医	78032793	薬を描くために
3-0 ビクリル、RBテーパー	エチコン	VCP215H	心膜を閉じる
3-0 Vicryl リバース カッティング	エチコン	VCP442H	筋肉層と深層の真皮層を閉じる
4-0モノクリル	エチコン	MCP496G	肌を閉じる
6-0ポリプロピレン縫合糸	SharePoint	JS617N	アトリウムの緊急修理用
すべての手術器具	ステリスとメドライン	営業担当者が必要	病院の手術室でよく見られるもの
アメロイドコンストリクター	Research Instruments SW, Inc.	CS-2.00-TI型	タイプ:チタン(2.0cm〜3.0cm)
鎮痛剤:ブプレノルフィン	ホスピラ	ブランド名: ブプレジン	投与量:0.03 mg / kg
鎮痛:フェンタニルパッチ	コベトラス	77870	投与量:4 mg / kg
麻酔:テラゾール	ゾエティス	(チレタミンとゾラゼパム)	投与量:4.4 mg / kg
麻酔:キシラジン(ロンプン)	デクラ	該当なし	投与量:2.2 mg / kg
クロルヘキシジン 4%	BD E-Z スクラブ	371073	手術準備
カフ付き気管内チューブ	ラッシュ	通常 7-0	豚のサイズと体重によって異なるサイズが必要になる場合があります
心電図モニタリングシステム	ミッドマーク	該当なし	マルチパラメータモニター
電気焼灼	ボビー スペシャリスト プロ	1250秒
Excede (セフチオフール)	コベトラス	23814	単回投与IM注射
ゴールド STERIspheres	株式会社バイオパル	C-15H20型	量:手術ごとに5cc
イソフルラン、USP	デクラ		投与量:0.75%–3.0%
ミニホワイトベッセルループ(X線検出可能)	デロイヤル	30-711	LCx を分離するには
複数の5ccシリンジ	メドライン	TMOSS05L	複数回の注入用
ニトログリセリン	バクスター	5%デキストロース注射中のニトログリセリン(200mcg / mL)	スプレー2–局所的に3cc
赤いゴムカテーテル	カーディナルヘルス	888766008	胸に入れて空気を抜く
滅菌手袋	アンコール	820955
吸引システム	ゴンコ	4042	自社設備の壁面吸引が良い
吸引チップ:ヤンカウアー	メドライン	DYND50130
外科用ドレープ	パターソン獣医一般外科パック	78929436	小さな粘着ドレープ4枚と大きな開腹ドレープ1枚
外科用潤滑剤	サージルーブ	0281-0205-43	無菌でなければなりません
全身性ヘパリン	コベトラス	82496	投与量:80 IU / kg
ヨークシャー豚	CBSET株式会社	該当なし	理想的には生後11週頃