血行動態特性評価と灌流分析による慢性心筋虚血の大型動物モデルの最終収穫手順

サマリー

次の手術プロトコルは、新しい治療法を調査するために、ブタモデルで慢性心筋虚血の誘発に成功した後、心機能と心筋灌流を徹底的かつ確実に特徴付けるための 2 番目で最後の手順を表しています。

要約

再現性と研究の完全性は、科学的発見の基本的な信条であり、確立され実証済みの原則とプロトコルを利用して作成されます。さらに、心血管疾患 (CVD) の有病率と個人や社会全体への負担がますます増加しているため、調査のための堅牢で検証済みのモデルを開発することが不可欠であると考えられています。私たちのグループは、過去 20 年間で徐々に改良されてきた豚モデルで 2 つの手術プロトコルを利用しており、まずヒトの冠動脈疾患 (CAD) の病態生理学を模倣したアメロイド収縮剤を配置することにより慢性心筋虚血を誘発します。2 番目の最終手順は、心臓の血行動態パラメーターと局所冠動脈灌流の包括的かつ思慮深い収集であり、その後、鼓動心臓の安楽死と心臓の詳細な切片化が続きます。私たちの研究室では、実験的治療薬による側副化を定量化する強力な方法として、同位体標識ミクロスフェアを使用して虚血領域への心筋血流を分析しています。さらに、おそらく最も重要な測定可能な心血管転帰である、左心室内圧容積 (PV) ループ カテーテル法を利用して、広範囲の血行動態パラメーターを測定します。慢性心筋虚血のブタモデルの包括的な心臓分析を詳細に説明することで、他の研究者が心血管疾患を排除するための独自のプロトコルと治療法の調査を改善し、発展させることを願っています。

概要

米国では、個人のほぼ半数が心血管の少なくとも 1 つの構成要素を持っており、心臓と血管の病状の大きなグループで構成されています¹。2060 年までに、CVD を含む複数の診断の有病率は 2025 年と比較して大幅に増加すると予測されています。例えば、心筋梗塞は30%、虚血性心疾患(IHD)は31.3%、心不全は33%増加すると予測^{されている2}。これらの驚異的な統計は、糖尿病患者の数が 39.3%、脂質異常症が 27.5%、高血圧患者の数が 27.2^{% 増加}すると推定される心血管危険因子の同様の予測と併せて考えると、さらに懸念されます2。全体として、これは、CVD とその危険因子の革新的な治療法を効果的に調査するための、信頼性が高く再現性のある研究モデルの差し迫った必要性を浮き彫りにしています。私たちは^、豚3におけるCADの生理学的に類似したモデルを実証しました。豚の使用は、前臨床研究が翻訳可能性について批判されてきたCADのヒトの状態を正確に表現するという私たちの研究モデルの妥当性を満たすのに役立ちます。豚は、人間と同様の冠動脈の解剖学的構造、心臓生理学、心筋プロテオームと代謝を持っています⁴。さらに、私たちのモデルの重要な要素は、治験療法によるその後の生理学的、心筋的、および分子的転帰を正確に説明することです。

通常、臨床試験は、観察によってのみ発見される有益な心血管転帰を調査するための新しい医学的または外科的治療法を実施するために使用されます。これは、心血管への影響を調査するいくつかの新規抗糖尿病薬の画期的な試験で明らかです。たとえば、SUSTAIN-6ランダム化対照試験では、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)アゴニストであるセマグルチドで治療された2型糖尿病患者は、プラセボと比較して主要な心血管有害事象の発生率が低いことが判明^{しました5。}同様の観察結果は、二重ナトリウム-グルコース共輸送体 1 および 2 (SGLT-1 および SGLT-2) 阻害剤であるソタグリフロジンを研究した別の RCT でも見られ、2 型糖尿病、慢性腎臓病、および追加の心血管危険因子⁶ の患者における主要な心血管有害事象の減少が示されました。これらの発見は、心血管の危険因子や疾患の発生率を減らすために、そのような治療法のFDA承認を拡大する上で極めて重要でした。しかし、これらの観察結果の主な制限は、これらの新しい治療法がそのような効果を永続させるメカニズムについての理解が不足していることです。これは、CVDの新しい治療法の根底にあるメカニズムの決定要因の科学的発見における私たちのモデルの重要性を例示しています。

大型動物モデルを用いることで、心機能や心筋灌流の巨視的変化を侵襲的に特徴づけるとともに、実験的治療に反応した微視的な分子シフトを包括的に理解することができます。心機能の変動を決定するために、PV ループ カテーテル法を使用します。PV ループの使用は、収縮期および拡張期の心室機能を侵襲的に判断するためのゴールド スタンダードであり、心エコー図や心臓 MRI などの非侵襲的画像技術を比較するためのベンチマークとして機能します⁷。この技術により、いくつかの測定を実行して各血行動態変数を決定し、カテーテルをリアルタイムで再配置して、再現性のあるデータ取得を確保できます。つまり、この技術の利用は、ベースラインの心機能、虚血発症時の心機能、および治療中の心機能などの縦断的データを収集できないという点で制限されています。これは、負荷に依存しない測定値を測定し、心臓の本質的な機能状態を取得する能力によって相殺されていると感じています。さらに、最も虚血性領域をマッピングした後に同位体標識マイクロスフェア注射を使用すると、治療薬の虚血性の利点を特定するのに役立ちます。マイクロスフェア注射は、局所的な心筋血流の変化を正確に表すことが長い間証明されてきました⁸。

私たちの研究室では、直径15μm、濃度250万マイクロスフェア/mLのマイクロスフェアを一貫して使用しています。この直径は、微小球が血流に応じて適切に分布し、直径が小さいほど左心室層間の分布の変動が最も少ないことを示す以前の研究によって確認されたように、心筋血流の最も正確な測定^{を保証します9。}さらに、信頼性の高い結果を確保するには、マイクロスフェアの最小限の取り込みが必要であり、これは私たちの研究室で使用される高濃度で簡単に生成されます。まとめると、最終収穫中に採用された技術は、任意の数の実験的治療後の主要な心臓生理学的変化を一貫して細心の注意を払って分析します。この特性評価は、心筋組織を収集し、マルチオミクス研究などの高度な技術で局所変化を徹底的に分析する能力によってさらに強化され、心筋内の中心ドグマの各層で堅牢で定量的な特性評価を提供します。

プロトコル

以下の外科的処置は、ロードアイランド病院とブラウン大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました (プロトコル #23-08-0005)。

1. 動物モデル

1. 以前に近位左回旋冠動脈 (LCx) の周囲にアメロイド収縮剤を配置し、それによって慢性心筋虚血を誘発し、その後実験的治療薬で治療したヨークシャー豚を選択します。アメロイド配置の最初の操作からその後の最終収穫までの間に~7週間を空けてください。アメロイド閉鎖に2週間かかり、その後豚が実験的治療を受けるようにします。豚がこの最終収穫時に生後~18週、体重~40kgであること、および実験群と対照群が性別によって一致していることを確認してください。
   注:代表的な図は、アメロイドが以前に配置された場所と虚血性心筋の予想される領域を含む、採取している心臓の解剖学的構造を示しています(図1)。

2. 術前処置

1. 処置当日の朝は食事を控えてください。
2. テラゾール(4.4 mg / kg)とキシラジン(2.2 mg / kg)の筋肉内注射を使用して豚を麻酔し、カフ付き気管内チューブで挿管します。
3. 0.03 mg/kg のブプレノルフィンを使用して鎮痛を開始します。
4. 静脈内(IV)カテーテル(20〜22 G)を太い耳介静脈の1つに配置し、~5〜10 cc∙^kg-1∙^h-1の割合で0.9%生理食塩水の注入を開始します。
   注:IV輸液は、豚のNPOステータスと手術症例の長さに関連してのみ維持率にあります。
5. ECGモニタリングに使用される手術部位およびその他の部位を剃ります。
6. 豚を手術室のテーブルに運び、足をテーブルに縛り付けて仰臥位に置き、イソフルラン(0.75〜3.0%)を使用して麻酔を続けます。
7. 心電図と血圧のモニタリングを開始し、豚に電気焼灼接地パッドを適用します。
8. 手術部位を洗浄します。
   注:これは最終手順です。したがって、無菌性を維持する必要はありません。手術部位の準備とドレープに関しては個人の好みです。

3.外科的処置

1. 大腿カテーテル法
   1. 大腿骨脈拍を触診します。
   2. 2%リドカインを皮下注射して、鼠径部のしわにほぼ垂直に、頭蓋尾側に動く左または右の鼠径部のいずれかで大腿骨の鼠径部を切り取る準備をします。
   3. #10メスを使用して4〜5 cmの切開を行い、再び鼠径部のしわに対して垂直に保ち、大腿骨脈拍が触診された尾側から始めて頭蓋側に移動します。(図2A)
   4. 電気焼灼を使用して、皮下組織を大腿動脈のレベルまで解剖します。Weitlaner リトラクターを使用して筋肉を広げ、大腿動脈をさらに露出させます。
      注:これには、半膜筋と内側広筋を少量分割する必要がある場合があります。
   5. 直角クランプを使用して直視解剖し、大腿動脈を周囲の組織から円周方向に露出させます。メッツェンバウムはさみを使用して、鈍く取り除くことができない癒着を鋭く分割します。
   6. 動脈を血管ループで囲むことにより、大腿動脈を隔離します。
   7. 2 番目の血管ループを配置して、動脈の近位および遠位制御を確保します。
   8. カニューレ挿入の前に、80 IU/kg の用量で豚を全身ヘパリン化します。
      注:ヘパリン化して大腿骨アクセスを達成する前に、正中胸骨切開術と心臓曝露が完了していることを確認してください。癒着の溶解は出血を引き起こす可能性があるため、ヘパリン化の前に心臓への曝露が完了していることを確認します。ヘパリン化の全体的な目的は、大腿動脈と左心室の両方にアクセスする際の血栓予防です。
   9. セルディンガー法を使用して、後動脈壁を突き刺さないように、18 G アクセス針で大腿動脈に穴を開けます。血液が戻ったら、ガイドワイヤーを針を通して動脈に進めます。針を取り外し、7F動脈鞘を動脈に導きます。ガイドワイヤーと血管拡張器を取り外し、動脈鞘だけを所定の位置に残します。
      注: 大腿動脈は簡単に解剖できるため、アクセスが難しい場合があります。これが最終処置であることを考えると、このような場合は、メッツェンバウムはさみで大腿動脈を鋭く切断し、ガイドワイヤーを内腔に直接挿入することをお勧めします。動脈鞘は、ガイドワイヤーを介して血管に簡単に通すことができます。小さな止血剤を使用して大腿動脈の遠位部分を必ずクランプしてください。
   10. シースを介した血流を確保します。Harvard Apparatusの引き出しポンプに接続します(図3)。
2. 正中胸骨切開術
   1. 共同外科医の数に応じて、この部分は鼠径部の切断と同時に完了することができます。
   2. 正中胸骨切開術の準備のために、2% リドカインを皮下注射します。
   3. #10メスを使用して、胸骨切欠から剣状突起までの正中線切開を行います。(図2B)
   4. 電気焼灼を使用して、胸骨に到達するまで皮下組織を分割し、止血を維持します。
   5. 電気焼灼で横方向および下方向の癒着を解放することにより、剣状突起を切除します。ケリークランプを使用して剣状突起を持ち上げ、電気焼灼を使用してその基部を水平に横断します。
   6. 胸骨のこの部分を分割しやすくするために、胸骨ノッチが上空に解剖されていることを確認してください。これには通常、いくつかの表面的なストラップの筋肉を分割する必要があります。
   7. 指を使って胸骨の下を鈍く解剖します。
   8. レブシェナイフを使用して、胸骨を鋭く分割し、正中線を保ちます。必要に応じてナイフの角度を変更し、胸骨の後半の3分の1に達したらゆっくりと続けます。
      注:ナイフの使用は、胸骨の頭蓋部分の角度と厚さが急であるため、人間のように胸骨のこぎりよりも好まれ、理想的には下にある大血管への損傷のリスクを低減します。下にある大血管を保護するために、胸骨の頭蓋部分の下にガーゼを置くと便利です。
   9. 胸骨切開が完了したら、胸壁と心膜または胸膜の間の癒着が存在する場合は、鈍く鋭く溶解します。
   10. 胸骨レトラクターを配置して肋骨を広げ、心臓を露出させます。
   11. メッツェンバウムはさみを使用して心膜を開きます。右心房に向かって伸び、左心室頂点に向かって尾側に進みます。
   12. 癒着を鈍くまたは鋭く溶解して、左右の心耳を露出させます。Allis クランプにピーナッツ スポンジを使用すると、この解剖に役立ちます。
   13. 心耳の解剖と同定が難しい場合は、胸腺摘出術が役立つ場合があります。これを行うには、電気焼灼を使用して胸腺組織を解剖します。
   14. 心耳が露出したら、単一チャンバーの外部ペーシングボックスに接続されている両方の付属器にペーシングクランプを適用します。150 bpmまでのテストペーシングを行い、各拍動が心電図に記録されるようにします。
   15. 左心室頂点の露出を確保し、再び鈍的で鋭い解剖を使用します。
   16. 最後に、左胸膜腔に入り、下大静脈(IVC)を大きなサチンスキークランプで囲みます。容器ループで隔離します。
   17. これが完了したら、豚をヘパリン化して大腿骨アクセスを取得する適切な時期です。
3. マイクロスフェア注入灌流分析
   1. IV チューブに取り付けられたファインゲージのバタフライ針と 3 方向活栓を使用して、左心耳にアクセスします。小さな止血剤を使用して針をガイドし、所定の位置に保持します。
   2. 滅菌ヘパリン化生理食塩水で注射器を活栓に接続し、正しい位置を確保するために引き戻します。血液が簡単に抜かれれば、位置は正しいです。
   3. 5 mLのルテチウム標識マイクロスフェア(濃度:250万マイクロスフェア/ mL)を含むシリンジを3方向活栓に接続します。
   4. 手術室助手を90秒の時間に割り当てます。
   5. ハーバード装置ポンプを介して大腿動脈の採血を開始し、合計 10 mL の血液を 6.67 mL/分の速度で採取し、タイミングを開始します。
   6. 採血の最初の30秒間に、ルテチウムマイクロスフェアを左心耳に注入します(図4)。途中で、マイクロスフェアを含むシリンジを引き抜いて位置を確認します。
   7. これが完了したら、ヘパリン化生理食塩水の注射器でチューブを洗い流し、正しい位置を再度確認します。
   8. 90 秒後、チューブを大腿骨アクセスから引き出しポンプから外し、新しいチューブを再接続してペーシング中の分析を取得します。
   9. 150 bpm までのペースを開始します。
   10. 5 mLのサマリウム標識マイクロスフェア(濃度:2.5 × 10⁶ マイクロスフェア/ mL)を使用して、ステップ3.3.5、3.3.6、および3.3.7を繰り返します。
   11. ペーシングを停止し、ハーバード装置引き抜きポンプから大腿動脈鞘を外します。
   12. バタフライ針を取り外し、圧力を加えて左心耳の止血を確実にします。
4. 圧力-容積ループカテーテル法
   1. 4-0ポリプロピレンで左心室頂点に巾着縫合糸を配置します。
   2. 縫合糸で囲まれた領域の中央で、上記のセルディンガー法を使用して左心室に別の動脈鞘にアクセスし、配置します。
   3. 校正されたマイクロマノメーターチップ付き圧力体積伝達カテーテルをシースを介して左心室に挿入します。動脈シースをカテーテル上の左心室から引き出し、圧力-容積測定システムを使用して圧力波形の変換を開始します。これにより、カテーテルが大動脈、弁複合体、または左心室にあるかどうかなど、カテーテルの位置が通知されます。必要に応じてカテーテルを引き戻して左心室腔内にあることを確認し、圧力-容積ループの形態が適切であることを確認するためにカテーテルを再配置します(図5)。
      注:左心室からシースを取り外すと、カテーテルからの圧力-体積トレースの伝達が容易になり、各PVループの最も適切な形態を得るためにカテーテルの位置を変更することがより容易になります。
   4. 別の校正された PV カテーテルを大腿骨アクセスに配置して、収縮期血圧と拡張期血圧、および平均動脈圧を取得します。
   5. PV ループの形態に満足したら、安静時に 3 回息止めを実行して、圧力-容積ループの呼吸変動を減らします。これにより、心拍出量や一回拍出量など、いくつかの負荷依存変数が測定されます。
   6. その後、血管ループをゆっくりと引っ込めて IVC を閉塞し、同時に息止めを実行して、収縮末期血圧容積関係 (ESPVR) や拡張末期圧力容積関係 (EDPVR) などの負荷に依存しない変数を取得します。さらに2回繰り返します。
   7. 150 bpm までのペーシングを開始し、ストレス条件下での心臓のパフォーマンスを特徴付けるために 3 回の息止めを行います。
   8. これで心機能のプロファイリングは完了です。両方のカテーテルを取り外し、左心室の巾着縫合糸を結びます。
5. 安楽死を打ち負かす
   1. ペーシングリードとすべての器具を胸から取り外します。
   2. 共同外科医の吸引を取得します。
   3. 胸壁への心臓の横方向の癒着を率直に解剖し、左心室頂点が簡単に上に持ち上げられるようにします。
   4. 鎮静を深めるために麻酔を依頼します。
   5. 上大静脈 (SVC) に大きなケリー クランプを置き、簡単にアクセスできる場合は、IVC の周囲に大きなサチンスキー クランプを置きます。同時にクランプします。
   6. すぐに#10メスを取り、胸から心臓を取り除きます。これには、心臓を IVC、SVC、大動脈、肺動脈、肺静脈から分離することが含まれます。
      注: この間、共同外科医は、手術野をできるだけきれいに保つために吸引を提供する必要があります。
   7. 胸から心臓を届け、別のテーブルに置きます。
   8. 頂端と基底の2つの半分にカットします(図6A)。これにより、心室組織が心房および大血管から分離されます。
   9. 左心室を他のすべての心筋組織から分離します。
   10. 図 6B に示すように、各半分は、左前下行冠動脈 (LAD) および後下行冠動脈への近接性に基づいて、円周方向に 12 のセクションに分割する必要があります。
   11. 膵臓、肝臓、肺、腎臓などの他のすべてのチャンバー、弁、大血管、末梢組織から組織サンプルを収集します。
   12. 各左心室切片からの少量のサンプルを、微小球定量化のために BioPAL に割り当てる必要があります。特定の切片は組織学的分析のためにホルマリンで固定されますが、組織の大部分は将来の分子研究のために液体窒素で急速凍結されます。

結果

まず、同位体標識マイクロスフェアを左心耳に注入することにより、局所心筋灌流を測定します。心筋血流を計算するには、6.67 mL/分の一定の採血速度を使用した場合、次の式を適用できます: 心筋血流 = (基準採血量 [6.67 mL/分]/組織重量) (定量化組織微小球数/定量化血液参照微小球数)。簡単に言えば、特定の心筋切片で測定されたミクロスフェアと、特定の速度で収集されたときに血液中に定量化されたミクロスフェアの比率は、その後の心筋セクションへの血流速度を導き出します。ミクロスフェアの量は、組織と血液が乾燥するとBioPALによって計算されます。ルテチウムは安静時の心拍数で使用され、サマリウムはペースで使用されます。以前の研究では、7週間の経過にわたって発達した側副血管系が安静時の血流を回復するのに十分である可能性があることが判明しているため、心臓のペーシングをする際のサマリウムの使用はプロトコルにおいて重要です。ただし、ストレスがかかると十分に堅牢ではない可能性があります¹⁰。これは、ヒトにおける狭心症の発症を示すため...

ディスカッション

この外科的処置には、心臓の露出、大腿カテーテル法、灌流分析のためのマイクロスフェア注入、および圧力容積ループの取得の 4 つの重要なステップがあります。心臓の露出に関して、重要な考慮事項は、最初の外科的処置による重大な癒着に遭遇する可能性です。胸骨正中切開を行う場合、心膜が胸壁に付着することがあり、胸骨切開を開始する前に胸壁を鈍く掃く必要があります。胸骨の後半の3分の1に近づくと、胸骨は著しく厚くなり、急激に下向きに傾きます。胸骨のこの部分の下にガーゼを置き、レブシェナイフとその下にある大血管および無名静脈との間により多くの分離を作成することが役立つ操作かもしれません。プロセス中に無名静脈がせん断された場合は、最初に圧力と吸引を加えてフィールドをクリアします。損傷が特定されたら、側壁をポリプロピレン縫合糸で修復するか、血管を絹縫合糸で結紮することができます。さらに、心耳と左心室頂点の両方を露出させることが難しい場合があります。通常、メッツェンバウムはさみ、アリスクランプのピーナッツスポンジ、および指のスイープを使用して慎重に解剖すると、心臓への医原性損傷のリスクが軽減さ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#10 メス	メドライン	MDS15310
生理食塩水 0.9%	デクラ/ベティベックス	17033-492-50	速度:ケース中5-10 mL / kg
18G針	パターソン獣医	78032793	薬剤・マイクロスフェアの描画用
2% リドカイン	フェニックス	57319-533-05	投与量:2-5mg / kg
4-0 ポリプロピレン縫合糸	コビディエン	D9H0436Y	財布紐用
すべての手術器具	ステリスとメドライン	営業担当者が必要	病院の手術室でよく見られるもの
鎮痛剤:ブプレノルフィン	ホスピラ	ブランド名: ブプレジン	投与量:0.03 mg / kg
麻酔:テラゾール	ゾエティス	(チレタミンとゾラゼパム)	投与量:4.4 mg / kg
麻酔:キシラジン(ロンプン)	デクラ	該当なし	投与量:2.2 mg / kg
動脈シース	コーディス	401-711メートル	6Fまたは7Fのいずれか。2 つの
バタフライニードル輸液セット	サーフロ	SV-25BLK型	マイクロスフェア注入用;通常23-25G
クロルヘキシジン 4%	BD E-Z スクラブ	371073	必要に応じて、外科的準備
カフ付き気管内チューブ	ラッシュ	通常 7-0	豚のサイズと体重によって異なるサイズが必要になる場合があります
心電図モニタリングシステム	ミッドマーク	該当なし	マルチパラメータモニター
電気焼灼	ボビー スペシャリスト プロ	1250秒	可能であれば、通常は 2 つ設定します
イソフルラン、USP	デクラ		投与量:0.75%-3.0%
ラップトップ	HPマイクロソフト	該当なし	個人が好むノートパソコンを使える
レブシェナイフ	インテグラ	300-425	該当なし
ルテチウムSTERIspheres	株式会社バイオパル	C-15E20	量:手術ごとに5cc
ミニホワイトベッセルループ(X線検出可能)	デロイヤル	30-711	大腿動脈とIVCを分離するには
複数の5ccシリンジ	テルモ	SS-05L	フラッシュおよびマイクロスフェア注入用
ペースメーカー	オシプカメディカル	2428001	一時的なペーサー
PVループカテーテル	遷 音速	モデル:FDH-5018B-E3450およびS / N:50-679	PVループ取得用
PVループコンピュータプログラム	トランスオニックサイセンス	ADV500ソフトウェア	ラップトップでプログラムする
PVループデータ収集システム	トランスオニックおよびADInstruments	モデル:FY097BおよびPowerLab 8/35	カテーテルとコンピュータを接続します
サマリウム ステリスフィア	株式会社バイオパル	C-15A20	量:手術ごとに5cc
スモールマレット	インテグラ	410-335	該当なし
滅菌手袋	アンコール	820955	それでも滅菌手袋とガウンをお勧めします
滅菌生理食塩水	バクスター	G171328	希釈してヘパリン化生理食塩水フラッシュを作る
吸引システム	ゴンコ	4042	自家施設の壁面吸引が良い
吸引チップ:ヤンカウアー	メドライン	DYND50130	心臓を切除する際には、フィールドをきれいに保つことが重要です
全身性ヘパリン	コベトラス	82496	投与量:80 IU / kg
三方活栓	ヨルゲンセン研究所株式会社	200820	マイクロスフェア注入用
温水浴	漁夫		使用前にカテーテルを温めるには
引き出しポンプ	ハーバード大学装置	70-2002	末梢血を一定の速度で採取するには
ヨークシャー豚	CBSET株式会社	該当なし	豚はすでに最初の外科的処置を受けているでしょう