このプロトコルでは、マウス背根神経節 (DRG) のホールマウントおよび解離培養を確立する方法と、腫瘍と神経の相互作用を評価するためのそれらの使用について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
腫瘍微小環境への神経系の寄与と、がん播種経路としての神経浸潤の重要性がますます認識されるようになってきています。がん細胞とニューロンとの相互作用は、神経の周囲や神経への浸潤を促進する可能性があり、これは臨床転帰が不十分な多くのがんの特徴です。ニューロンとがん細胞との間の相互相互作用を研究する ためのin vitro モデルは、がんの広がりを理解し、それを緩和するためのアプローチを特定するための貴重なツールを提供します。
ここでは、マウスの後根神経節(DRG)の単離と、ニューロンの形態と神経突起の長期にわたる成長を視覚化するために使用できる全マウントおよび解離した単層培養の確立のためのプロトコルについて説明します。マトリゲル島にマウントされたDRG全体は、 in vivo 神経に近い不均一な環境で神経構造と刺激に対する応答を維持しますが、解離した神経培養は、直接的な細胞間相互作用をより詳細に評価することができます。DRG培養が確立されると、がん細胞を添加して共培養物を作製し、がん細胞に応答した神経突起伸長や神経形態の変化を可視化することができます。神経由来のシグナルに応答したがん細胞の増殖や運動性を経時的に、または成長刺激や抑制の条件下で評価できるほか、がん細胞と神経伸展との直接接触の影響を可視化することができます。
両方の共培養モデルを同時に生成できるため、このプロトコルは、がんとニューロンの相互作用の影響をより包括的に把握し、治療条件の比較と細胞レベルおよび全神経節からの情報の統合を容易にします。このプロトコルは、神経と腫瘍の相互作用の研究を容易にし、細胞シグナル伝達の研究、薬物スクリーニング、または腫瘍と神経環境の不均一性の研究や神経に沿った腫瘍播種のメカニズムの研究など、幅広いアプリケーションに使用できます。
概要
局所浸潤および局所または遠隔転移による腫瘍の播種は、がん関連死の主な原因である。研究は血管またはリンパの転移経路に焦点を当ててきましたが、腫瘍細胞への神経浸潤は、膵臓1,2、前立腺3、頭頸部4、乳房5、および結腸直腸6のがんを含む多くの固形腫瘍で頻繁に観察されます。近年、多くの研究が、腫瘍の成長と進行を促進する神経の新たな役割、および転移の進行を促進する普及経路としての役割を強調しています7,8。これに関連して、がん神経科学は著名な研究分野として浮上し、腫瘍細胞とこれらのプロセスに寄与する可能性のある末梢神経系(PNS)の基本成分との間の相互作用を解明することにより、腫瘍学に新たな視点を提供しています8,9。
PNSは、末梢神経と神経節の両方から構成され、これらは、さまざまなサイズと機能のニューロン、シュワン細胞と他のグリア細胞、線維芽細胞、マクロファージ、肥満細胞、メラノサイト、および局所血管系を形成する血管内皮細胞を含む多様な細胞タイプで構成される不均一な構造である10。PNSは腫瘍微小環境(TME)の重要な構成要素であり、がん細胞と神経との間の相互コミュニケーションは、物理的接触を通じて直接的または神経栄養因子、神経伝達物質、成長因子、およびその他のシグナルの放出を通じて間接的に、神経浸潤を促進し、より攻撃的な表現型を促進することができます8。
インビトロモデルは、神経の維持と修復に寄与するプロセスを特徴付けるために使用でき、神経と癌細胞との間の細胞相互作用を調べるためにますます使用されています11,12。頻繁に使用されるin vitroモデルには、腫瘍細胞と共培養された抽出マウス後根神経節(DRG)が含まれます11。これらのモデルは、解離したDRG細胞の二次元(2D)単層培養を使用してin vitroでニューロン生物学を研究することが多く、PNS13,14の細胞相互作用をモデル化するために使用されてきました。しかし、2D培養は神経微小環境の複雑さを欠いており、そのin vivo構造を十分に表現していません。末梢ニューロンまたは神経節の3次元(3D)全マウントは、末梢神経生理学をより効果的に再現して、神経と環境の相互作用をより全体的に表現する代替手段を提供する15,16,17,18。しかし、このモデルの不均一性は、細胞間相互作用を視覚化または定量化する能力を制限し、これらのモデルは、特定の細胞相互作用や刺激に対する機構的応答を調査するよりも、全体的な末梢神経応答を観察する方が効果的です。したがって、解離したニューロン培養物とホールマウントニューロン培養物は相補的であり、2Dモデルと3Dモデルを並行して評価することが、全体的な効果と刺激に対する個々の細胞応答の両方を評価するために最適であることは明らかです。
このプロトコルは、細胞レベルと組織レベルの両方で神経細胞と癌細胞の相互作用を評価するために使用できる相補的な解離(2D)およびホールマウント(3D)神経培養を生成する方法について説明し、これらの相互作用のより包括的なビューを提供します1,13。これらのモデルは、神経細胞の形態や神経突起伸長などの細胞プロセス、神経栄養因子などの神経分泌走化性物質に対する腫瘍細胞の応答、感覚ニューロンと腫瘍細胞間のクロストークを視覚化および評価するために使用できます。また、腫瘍細胞と神経微小環境の他の構成要素(免疫細胞、線維芽細胞、グリアなど)との間の潜在的な相互作用の調査も可能にします。これらのモデルが、細胞の相互作用と応答を評価または定量化するためのアプローチの例として、生細胞染色または免疫蛍光法によって視覚化された、神経がん細胞の相互作用を経時的に研究するための応用に焦点を当てています。これらの方法の使用から得られる結果は、神経系ががんの成長と拡大をどのように促進するかについての理解を深め、これらのメカニズムを標的とする戦略を開発するのに役立ちます。
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プロトコル
すべてのマウスの研究は、クイーンズ大学の大学動物管理委員会のオフィスによってレビューされ、承認されました(プロトコル番号2524)。動物は、Canadian Council on Animal Care、およびNational Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research(英国)の倫理ガイドラインに従って、組織採取のために維持および安楽死させました。このプロトコルでは、C57BL/6動物から単離された組織を使用しましたが、Rag2IL2Rγc KO動物を含む他の遺伝子型も成功裏に使用しました。セクション1〜6は、表面滅菌されたラボベンチ( 図1を参照)の清潔な環境で実行できますが、セクション7〜9は生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。理解を深めるために、前述の手順の概略図を作成しました(図1)。
1. 原液の調製
- パパイン溶液とコラゲナーゼIV/ディスパーゼII溶液を調製します。パパインを滅菌PBS(リン酸緩衝生理食塩水)に30 U / mLの濃度で溶解します。1 mLアリコートに-20°Cで保存します。 コラゲナーゼIV型を1.25 mg/mLで溶解し、ディスパーゼIIを2.5 mg/mLでPBSに溶解します。1 mLアリコートに-20°Cで保存します。
- 2% B27サプリメント(50倍ストック溶液)、10%ウシ胎児血清(FBS)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-Strep)(100倍ストック溶液)を添加した神経基礎培養培地(F12)を調製します。
- ハンク平衡塩溶液(HBSS)を1%ペニシリン-ストレプトマイシン(100倍ストック溶液)で調製します。
注:初期の細胞生存と接着をサポートするために、10% FBSを添加したF12培地を使用して、培養の確立を改善します。しかし、FBSは線維芽細胞を含む非神経細胞の増殖も促進します。還元培地または無血清培地条件(例:F12にB27のみを補充)は、DRG培養およびがん共培養における非ニューロン細胞増殖を最小限に抑えるために使用できますが、特に解離したニューロン培養の生存に影響を与える可能性があります。DRGコンディショニング培地を採取してがん細胞の挙動に及ぼす影響を評価する際には、無血清培地も考慮する必要があります。
2. DRGの解剖のための試薬と材料の準備(図1A)
- オートクレーブ手術器具。解剖顕微鏡を70%エタノールで表面滅菌し、清潔なベンチに設置します。
- 6-8mLのHBSS-Pen-Strep(ステップ1.3)を2枚の10cm培養プレートに加え、氷上に置きます。
注:これらのプレートは、解剖後に脊柱を収集するために使用されます。解剖する脊髄の数によっては、追加のプレートが必要になる場合があります。 - 15mLのコニカルチューブに8〜10mLのHBSS-Pen-Strepを加え、氷の上に置きます。
- 3 cmの培養プレートにHBSS-Pen-Strep 3 mLを加え、氷の上に置きます。
注:ステップ2.3で調製した15mLチューブは解離のためのDRGの収集に使用され、3cm培養プレート(ステップ2.4)はホールマウントモデルのDRGの収集に使用されます。
3. ホールマウントDRG培養用試薬・材料の準備
注: このセクションの一部の手順では、夜間の準備が必要になる場合があります。DRG培養にはどのタイプの組織培養プレートも使用できますが、このプロトコルの容量と指示は8ウェルガラスボトムスライド用に最適化されており、分析に最適なイメージング品質を提供しました。8ウェルガラスボトムスライド、ピペットチップ、マトリゲルは常に氷の上に置いてください。
- マトリゲル溶液は、使用前に4°Cで一晩(または少なくとも3時間)解凍してください。マトリゲルは常に氷で覆われているようにしてください。
- ピペットチップと8ウェルガラスボトムスライドを-20°Cで一晩冷やして、チップへのマトリゲルの付着を最小限に抑え、プレート内のマトリゲルの早期重合を防ぎます。
- サプリメントを添加した培地(ステップ1.2)を水浴中で37°Cに温めます。
4. 解離DRG培養のための試薬および材料の準備
- パパイン溶液とコラゲナーゼIV/ディスパーゼII溶液(ステップ1.1)を37°Cの水浴で希釈し、使用する準備ができるまで加熱します。
注:解剖したマウスごとに、パパインとコラゲナーゼIV /ディスパーゼII溶液をそれぞれ1アリコート(1 mL)使用します。. - 温めた培養培地(ステップ1.2)。
5.脊柱の採取(図1B)とDRGの解剖(図1C)
- イソフルランの過剰摂取とそれに続く子宮頸部脱臼により、4〜8週齢のマウスを安楽死させます。安楽死させた動物を腹部に寝かせ、脊柱の上の領域に焦点を当てて毛皮を剃ります(図1B、 ステップ1,2)。
- 動物の背中に70%エタノールをスプレーし、緩い毛皮を取り除き、尻尾から頭蓋骨までペーパータオルで拭いて、毛皮が解剖を汚染するのを防ぎます。
- 滅菌されたハサミを使用して、尾から頭蓋骨まで、削った背側表面に沿ってまっすぐに切開します。鈍い鉗子を使用して切開部の両側の皮膚を引っ込め、脊柱を露出させます(図1B、 ステップ3)。
- 毛皮による汚染を防ぐために、新しい鉗子とはさみを使用して、脊柱の基部(尾端)に水平切開を行います(図1B、 ステップ4)。
- 脊柱の両側に縦方向に2つの平行な切開を行い、脊柱を解放します。鉗子を使用して脊柱をそっと持ち上げ、周囲の結合組織を切除します(図1B、 ステップ5)。
- 脊柱を完全に解放するには、脊柱の上部(頭蓋骨の近位)を切開します。脊柱を、氷上のHBSS-Pen-Strepを含む予冷済みの10cmプレートに移します(ステップ2.2)(図1C、 ステップ6)。
注:すべての脊柱を同じ10cmプレートに集め、個々の柱を一度に1つずつ別のプレートに移動して、さらに解剖手順を行うと便利です。
6.背根神経節(DRG)の解剖
- スプリングハサミを使用して、脊柱の周囲に残っている結合組織をすべて取り除き、椎骨を露出させます(図1C、 ステップ7)。これにより、椎骨をより鮮明に視覚化し、正中線に沿った切断が容易になります。トリミングしたカラムを、事前に冷却した新しい10cmプレートに集めます(ステップ2.2)。
- 一度に1つずつ、トリミングした脊髄を顕微鏡ステージに移して解剖します。スプリングハサミを使用して、脊柱を矢状面で慎重に分割します(図1D、 ステップ8)。
- 先端の細い鉗子を使用して、脊髄を脊柱から取り外し、DRGを脊髄神経の根に沿って両側に露出させます(図1D、 ステップ9)。
注意: DRGは、乱暴に扱うと脊髄と一緒に除去できるため、この手順では特に注意する必要があります。 - スプリングハサミで脊髄神経を切断し、DRGの周りの結合組織をすべて取り除きます(図1D、 ステップ10)。
注:このステップで結合組織を除去すると、DRG培養物の破片が最小限に抑えられます。 - 先端の細い鉗子を使用して、DRGをそっと引っ張って背根から抽出します。ホールマウント培養の場合は、DRGを3 cmプレート(ステップ2.4で調製)に入れます(図1D、 ステップ11)。残りのDRGを15 mLの円錐チューブ(ステップ2.3で調製)にプールして、解離に使用します。
注:解剖プロセス全体を通して、プレートとチューブを氷の上に置いてください。 - すべてのDRGが抽出されるまで、手順6.4から6.5を繰り返します。追加の脊柱について、上記のすべての手順を繰り返します。
注:マウスは系統に応じて30〜31ペアのDRGを持っており、各動物から最大60のDRGを収集できます。脊髄の腰部のみからDRGを採取した場合、10個のDRGを抽出できます。同じ動物由来のDRGを使用して両方の培養モデルを確立することで、実験内のばらつきが減少し、補完的な実験間で一貫した比較可能な結果が得られます。
注意: DRGの抽出に続くすべての手順は、生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。
7. ホールマウントDRG培養(図2)
- 予め冷却したチップ(ステップ3.2)を使用して、冷やしたマトリゲル2μLをピペットで注入し、氷上に置いた8ウェルガラスボトムスライドの各ウェルに液滴を形成します(図2A、 ステップ1)。DRGを添加する前にマトリゲルが早期に重合するのを防ぐために、一度に1滴だけをピペットで動かしてください。滑り台表面の傷を防ぐため、滑り台を10cmのプレートに入れてから氷の上に置いてください。
- 先端の細い鉗子を使用して、1つのDRGをドライプレートに移し、ゆっくりと動かして余分なHBSSを取り除き、DRGをマトリゲル液滴に添加するときにマトリゲルがさらに希釈されるのを防ぎます。DRGをマトリゲルドロップに移します(図2A、 ステップ2)。
注意: 先端の細い鉗子を使用して、DRGをマトリゲル液滴にゆっくりと押し込み、DRGが完全に浸され、液滴の中央に配置されていることを確認します。 - マトリゲル液滴に追加されたDRGごとに、手順7.1から7.2を繰り返します。
- 8ウェルガラスボトムスライドを加湿インキュベーターで37°Cで5分間インキュベートし、マトリゲルを重合させます(図2A、 ステップ3)。
- 200 μLの温かい添加培地を各ウェルに慎重に加え、5% CO2 で37°Cでインキュベートします(図2B、 ステップ4)。培地を新鮮なサプリメント添加培地と72時間ごとに交換します。
- 明視野顕微鏡を使用してDRGをモニターし、その生存率と24時間ごとのニューロンの成長を評価します(図2C および 図3)。
注:生存率は、神経突起の長さと密度の増加によって示されます。DRG細胞の伸長の進展を示すために、経時的に画像をキャプチャすることができます(図3)。
8. 解離したDRG培養(図4)
注:任意のマルチウェルプレートを使用して、解離したDRGニューロンをシードできます。しかし、このプロトコルでは、免疫蛍光分析のための細胞の密度とイメージング品質が優れているため、8ウェルのガラス底スライドが使用されました。
- 培養プレートをコラーゲンでコーティング
- 生物学的安全キャビネットで、滅菌済み0.01 M HCl中の酸性化コラーゲンIの50 μg/mL作業溶液を調製します。
- 100 μLのコラーゲンI溶液を8ウェルガラスボトムスライドの各ウェルにピペットで移します。スライドを傾けたり、ゆっくりと回転させたりして、コラーゲン溶液が各ウェルの底面全体を均一に覆うようにします。スライドを加湿インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートし、コラーゲンIの重合を確保します。
注:インキュベーション時間中は、ステップ8.2および8.3に進みます。 - インキュベーション後、各ウェルに残っている未重合のコラーゲンI溶液を静かにピペットで取り除きます。各ウェルを100μLのPBSですすいでください。余分なPBSをピペットで取り除き、コラーゲンが乾燥するのを防ぐために薄い残留層を残します。
注:8ウェルガラスボトムスライドは、解離したDRGが播種ステップの準備ができるまで、生物学的安全キャビネットに残すことができます。
- 酵素消化
- 抽出したDRGsを入れた15mLチューブ(ステップ6.5)を室温で200 × g で5分間静かに遠心分離し、DRGをペレット化します。ピペットを使用してHBSSを静かに取り出します。
- 予熱したサプリメント培地でDRGをすすぎ、チューブを軽くたたいてすべての内容物が洗浄されていることを確認し、200 × g で5分間遠心分離してDRGをペレット化します。
- 培地をピペットで取り出し、1 mLのパパイン溶液を加えます(図4A、 ステップ1)。穏やかに混合し、組織培養インキュベーターで37°Cで20分間インキュベートします。チューブを静かに振って、5分ごとに攪拌します。
- 20分後、4.5 mLのサプリメント培地を加え、穏やかに混合してパパインを中和します。.DRGsをペレット化するために、400 × g で5分間チューブを遠心分離します。ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。
- コラゲナーゼIV/ディスパーゼII溶液1 mLを加え、インキュベーター内で37°Cで20分間インキュベートします。チューブを5分ごとに静かに振ってください(図4A、 ステップ1)。
- 20分後、4.5 mLの添加培地を加え、穏やかに混合してコラゲナーゼIV/ディスパーゼII溶液を中和します。DRGsをペレット化するために400 × g で5分間チューブを遠心分離し、ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。
- 2 mLの添加培地を添加し、DNase Iを最終濃度0.2 mg/mLまで添加します。この時点で、DRGは完全に消化され、緩い塊として現れることがあります(図4A、 ステップ2)。
- 機械的解離
- DRGを静かに粉砕し、1000μLフィルターピペットチップを使用して4〜5回ピペッティングします(図4A、 ステップ2)。
- 200 μLのピペットチップ4-5xを使用して、2回目のトリチュレーションステップを実行します。このステップの後、サンプルは曇り、組織の塊が見える形で残っています(図4A、 ステップ2)。
- 細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーで50 mLのコニカルチューブにろ過します。ストレーナを10 mLの培地で徐々にすすぎ、ストレーナを通じて細胞が完全にろ過されるようにします(図4A、 ステップ3)。
- チューブを1,000 × g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。ペレットから培地を取り出し、500 μLの補充培地に再懸濁します(図4A、 ステップ4)。
- 8ウェルガラスボトムスライドのウェルから残留PBSをすべて取り除きます。解離したDRG懸濁液をコラーゲンコーティングウェル間に分配します。スライドを37°Cで加湿インキュベーター内で5%CO2とインキュベートします。必要に応じて培地を追加し、48時間ごとに培地を新鮮な補充培地と交換します(図4B、 ステップ5)。
注:DRG解離細胞は、血球計算盤または細胞計数チャンバーとトリパンブルー染色を使用してカウントでき、ウェルあたりの細胞数が一定であることを保証します。このプロトコルでは、約1×10個の5 細胞を各ウェルに播種した。 - 明視野顕微鏡を使用してDRG由来細胞をモニターし、生存率とニューロンの伸長を評価します(図4C および 図5)。
注:ニューロンは、定義された境界を持つ丸みを帯びた細胞体として現れ、接着するのに24時間以上かかる場合がありますが、非ニューロン細胞は通常、ニューロンの前に定着します。一部の神経突起伸長は24時間後に観察され、培養では最大7日間で時間の経過とともに増加します。解離したDRG由来細胞とホールマウントDRGを72時間プレインキュベートしてから、がん細胞を添加して共培養を確立します。
9. がん細胞懸濁液の調製と共培養の確立
注:多くの種類の付着がん細胞を使用できます。共培養用の増殖培地と細胞数は、細胞株に依存します。実験前に予備試験を行い、細胞採取のタイミングや最適な細胞播種数を決定することをお勧めします。ここに記載されているプロトコルは、ヒト膵臓癌細胞株PanC1、MiaPaCa2、および前立腺癌細胞株DU−145の使用に基づいていました。
- 細胞を無血清培地で洗浄し、2 mLのトリプシン/10 cmプレートで約3分間トリプシン化します。
- 6 mLのサプリメント培地を加えてトリプシンを中和し、ピペットで静かに上下させて、単一細胞懸濁液を確保します。血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して細胞をカウントします。
- がん細胞を2×105細胞/mLの濃度で補充培地に懸濁します(ステップ1.2)。
注:最適な細胞密度は、細胞サイズ、倍加時間、および共培養の期間によって異なる場合があり、必要に応じて調整できます。 - ホールマウントDRGとがん細胞の共培養(図6B)
- 8ウェルガラスボトムスライドで、マウントDRG培養全体から培地を吸引します。
- がん細胞懸濁液200μL(ステップ9.3)を、マウントDRG全体を含むマトリゲル液滴の上に静かにピペットで移します。
注:これにより、液滴の周囲にがん細胞が均一に分布することが保証されます。マトリゲル液滴をピペットチップで乱さないように注意してください。 - 共培養スライドを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2でインキュベートします。温めたサプリメント培地200μLで一度洗浄し、その後、各ウェルに300μLのサプリメント培地を添加して、培地を毎日リフレッシュします。
注:DRGとがん細胞の共培養を妨げないように、ピペットを使用して培地を静かに吸引します。時間が経つにつれて、共培養がより複雑で組織化されるにつれて、細胞の相互作用や共培養の完全性に影響を与える可能性のある障害の影響も受けやすくなります。 - 明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して共培養を24時間間隔でモニターし、がん細胞の挙動とニューロンの相互作用を評価します(図6B)。
注:観察頻度は、実験のタイムラインと関心のある細胞相互作用に基づいて調整できます。
- 解離DRGとがん細胞の共培養(図6C)
- 8ウェルガラス底スライドで解離した培養物から培地を吸引します。
- 200 μLのがん細胞懸濁液(ステップ9.3)を各ウェルに穏やかに分配します。ホールマウント共培養で概説されているのと同じインキュベーション、メディアリフレッシュ、およびモニタリングの手順に従います(ステップ9.4.3および9.4.4)。
注:細胞プロセスおよびがん細胞-ニューロン相互作用のより良い可視化のために、製造元のプロトコルに従って、蛍光細胞トラッカーを培養物に追加することができる。
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結果
私たちのプロトコルは、初代マウスDRG由来細胞の単離と、解離DRG培養と全マウントDRG培養の2つの相補的な培養モデルの確立を説明しています。このプロトコルの主な利点は、同じ動物から単離されたDRGを使用して両方のタイプの培養を生成できるため、動物間および実験間の変動が最小限に抑えられ、各モデルから生成された情報をより簡単に統合でき、細胞動態および細胞間相互作用のより包括的なビューを提供できることです。これらのカルチャモデルは、多くのアプリケーションに適応できます。ただし、ここでは、がんと神経の相互作用の文脈でのそれらの使用に焦点を当てています。
このプロトコルは、DRGの構造を維持し、DRG由来細胞の生存率を最大化しながら、生存可能なDRGとがん細胞のDRG解剖、抽出、および共培養のための効率的なワークフローを提供します(図1)。しかし、DRG培養物は、最初の解剖段階での毛皮のキャリーオーバ...
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ディスカッション
ここで紹介するプロトコールでは、2Dおよび3D DRG初代神経培養を確立するための改良された方法と、がん細胞との共培養におけるそれらの応用について説明しています。このプロトコルは、2 つのモデルを並行して確立することで、以前の方法よりも進歩しています。2Dモデルと3Dモデルが同時に確立されるため、同じ動物から分離された一次神経を使用すると、動物間および実験間のばらつきが最小限に抑えられ、両方のモデルからのデータをより簡単に比較または統合できるため、細胞の挙動と複雑な組織応答の補完的な観察が容易になります。私たちのプロトコルは、神経の解剖と解離の条件をさらに最適化して、腫瘍細胞を追加する前に神経突起の成長と神経環境の成熟を最大化します。また、一般的な技術的課題に対処し、汚染を減らし、培養物の確立効率を高めて条件の再現性を確保し、このプロトコルの適用性をさまざまな実験モデルに拡大するための方法論の詳細も提供します。この点で、我々はこのプロトコルを使用して、いくつかの遺伝的背景を持つマウスからの神経培養を確立することに成功しており、野生型の近交系または非近交系(C57BL/6...
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開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、Canadian Institutes for Health Research(PJT-178274)(LMM)からの運営助成金、オンタリオ大学院奨学金(LCBO)、およびCoordination for the Improvement of Higher Education Personnel-Brazil(CAPES)-Finance Code 001(ERP)からの奨学金によって支援されました。LMMは、クイーンズ大学の遺伝学および分子医学のブラッケンチェアです。一部の画像は、Biorenderを使用して部分的に生成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ツール | |||
| 70 & マイクロ;m セルストレーナー | プロジーン | 71-229483-ULT | 細胞懸濁液のろ過に使用 |
| 8ウェルガラス底スライド | IBidi、ミュンヘン、ドイツ | 80807 | |
| デュモン #5 - 細い鉗子 | ファインサイエンスツール、フォスターシティ、米国 | 11254-20 | |
| デュモン #5 鉗子 | ファインサイエンスツール、フォスターシティ、米国 | 11252-20 | |
| 細かいはさみ | ファインサイエンスツール、フォスターシティ、米国 | 91460-11 | |
| パターン鉗子 | ファインサイエンスツール、フォスターシティ、米国 | 91121-12 | |
| スプリングハサミ | ファインサイエンスツール、フォスターシティ、米国 | 91500-09 | |
| 試薬 | |||
| 1x リン酸緩衝生理食塩水 | シグマ、セントルイス、アメリカ | D8662-500MLです | 酵素の溶解に使用されます |
| B-27 サプリメント (50x) | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | 17504044 | F12培地で2%濃度で使用 |
| ウシI型コラーゲン | Corning Incorporated、ニューヨーク、米国 | 354231 | コーティングプレート、作業溶液50µに使用。g/mL(0.01 M HCl中) |
| コラゲナーゼIV型 | Sigma-Aldrich、セントルイス、米国 | C4-BIOC | PBSに1.25 mg / mLで溶解し、アリコートし、-20°Cで保存します。C |
| ディスパーゼII | Roche、バーゼル、スイス | 4942078001 | PBSに2.5 mg / mLで溶解し、アリコートし、-20°Cで保存します。C |
| DNase I | ロシュ、バーゼル、スイス。 | 11284932001 | の最終濃度で添加;解離中は0.2 mg / mL |
| ウシ胎児血清 (FBS) | Sigma-Aldrich、セントルイス、米国 | F1051 | F12培地で10%濃度で使用 |
| HBSS(ハンクの平衡塩溶液) | シグマ、セントルイス、アメリカ | H6648-500MLです | 1%ペニシリン-ストレプトマイシンで調製 |
| マトリゲル成長因子の減少 | Corning Incorporated、ニューヨーク、米国 | 356231 | 4度で解凍します。C一晩、氷の上に置いておく |
| 栄養混合物 F-12 ハム | Sigma-Aldrich、セントルイス、米国 | N6658-500MLです | 補充培地を調製するための基礎培地 |
| パパイン | ロシュ、バーゼル、スイス。 | 10108014001 | PBSに30U / mLで溶解し、アリコートし、-20°Cで保存します。C |
| ペニシリン-ストレプトマイシン(100倍) | Sigma-Aldrich、セントルイス、米国 | P4333-100MLです | 培地中で1%濃度で使用 |
| トリパンブルー溶液 | Sigma-Aldrich、セントルイス、米国 | T8154-100MLの | 細胞生存率を評価するには |
| TrypLE エクスプレス | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | 12605-028 | がん細胞の採取用 |
| 抗体 | |||
| &β;-チューブリンIII抗体 | アブカム(英国、ケンブリッジ) | AB15568 | 希釈 1:200 |
| アレクサフルオール488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | A-11008 | 希釈 1:2000 |
| アレクサフルオール594 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | A-21442 | 希釈 1:2000 |
| アレクサフルオール647 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | A-21245 | 希釈 1:2000 |
| NeuN抗体 | Sigma-Aldrich、セントルイス、米国 | MAB377 | 希釈 1:100 |
| <強力>蛍光染料&プローブ | |||
| ActinGreen 488 ReadyProbes 試薬 (ファロイジン) | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | R37110 | 希釈 1:40 |
| CellTraceカルセインレッドオレンジ | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | C34851 | 蛍光顕微鏡下でニューロンを可視化するためのセルトラッカー |
| ヘクスト 33342 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州 | H3570型 | 希釈 1:5000 |
参考文献
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