新生児の子豚に適用するために、冠状または矢状面を切断する拡張可能な脳マトリックスを構築する革新的な方法が記載されています。この予算に優しいアプローチは、アガロースゲル脳成形のテンプレートを使って彫刻したアクリル板を使用し、複数の種に適用でき、脳の成長に対応するための拡張を可能にします。
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この記事について
サマリー
要約
新生豚を新生児の発達や病理の研究モデルとして用いる関心が高まる中、組織学的切片を正確に取得するための脳マトリックスの必要性が高まりました。しかし、新生児の脳の急速な成長により、市販のマトリックスの利用は発達段階の狭い範囲に限られています。そのため、可変可能な脳マトリックス構築法が開発されました。まず、ガラス容器を濡れた氷の上に置き、底に4%アガロースジェルの層を敷きました。次に、ホルマリン固定脳をこの層に置き、4%アガロースゲルを埋め込みました。ゲルが固まった後、脳の上のゲルを慎重に取り除き、脳を摘出しました。空洞は4%のアガロースジェルと2%のインディアンインクで充填されました。固化後、ゲルブロックを取り出し、所定の厚さ(2mmまたは5mm)と向き(冠状または矢状面)に切り分けて、脳型をスケール紙に印刷しました。テンプレートは透明なアクリル板(厚さ2mmまたは5mm)にコピーされ、バンドソーで切り出されました。最後に、プレートは組み立てられ、事前に開けられたアライメント穴を通して3組のボルトとナットで固定され、カスタマイズされた脳マトリックスを構築しました。新生児5日目の子豚脳(ステップ2mm)および出生後32〜38日目の脳(ステップ5mm)のコロナマトリックスと矢状行列の両方の構築が示されています。適切なアクリルプレートを追加または削除することで、マトリックスは子豚の脳のさまざまなサイズに適応するように調整されました。そのため、大型動物のさまざまなサイズに対応した脳行列をカスタマイズする簡単かつコスト効率の高い方法が神経学研究コミュニティに紹介されます。
概要
子豚の脳の発達は人間に非常に似ています 1,2,3,4。したがって、神経発達障害、新生児および小児疾患、外傷の前臨床研究に子豚を用いる関心が高まっています(図1A,B)5,6,7,8,9,10。図1に示すように、新生豚の子豚は大型動物モデルとして、頭蓋骨と脳の大きさが早産のヒト胎児に近いもの(図1A,B)である一方、成体のマウスやラットの頭蓋骨は少なくとも2倍小さい。
しかし、より広く使われているマウスモデルと比べて、生物医学研究における大型哺乳類の使用には課題があります。新生児の子豚の脳は、生まれてから最初の3ヶ月で急速に成長します。生後5週間で、子豚の脳は体重がほぼ倍増し、体積も3倍になります(図1C)4,11,12,13。p5からp38にかけての期間、脳回および溝の成長と発達が顕著でした(図1C)。p5子豚の脳の重量と体積は29.5gと18.9 mL、2つのp32脳はそれぞれ51.4gと52.6 g、49.6 mgと53.5 mLでした。38日目には脳が53.7g、52.5mLに成長し、p5から重量が80%増加、体積が170%増加しました。新生豚の脳の急速な成長は、異なる年齢、系統、性別の子豚の脳を単一のマトリックスで正確に組織学的に断片することに課題をもたらしています。
市販の子豚用脳マトリックスは、1つあたり約1,000ドルから3,600ドルの範囲で、2週間以下の子豚向けに設計されたサイズのみの選択肢があります。3Dスキャンと3Dプリント技術を用いてゼブラフィッシュ、マウス、鳥類のさまざまな脳マトリックスを作成している論文はいくつかありますが、それらのマトリックスは比較的小規模です。新生児子豚、特に2週間以下の脳に関するMRI画像診断や詳細な成長チャートは確立されていません。そこで、5日目から38日目の間に収集した脳を用いて複数の脳スライステンプレートを作成し、調整可能な脳マトリックスシステムを確立しました。
このプロトコルは、新生児子豚の脳テンプレートを構築し、アクリルプレートを用いたカスタマイズ可能な脳マトリックス構築を開発する革新的な手法を説明しており、これはさまざまなサイズの脳の冠状または矢状体切片に利用できます。
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プロトコル
本記事では、4匹の子豚脳を採取し、ケンタッキー大学の動物ケア・利用委員会(IACUC)が別研究のために承認したプロトコルに従い、人道的安楽死後に組織学的染色のために準備されました。動物被験者に対するすべての処置が承認され、治療や安楽死に伴うストレスや痛みを最小限に抑えるために適切なケアが行われました。
1. 動物
- 遺伝的背景が62.5%ランドレース、25%ラージホワイト、12.5%ヨークシャーの幼い新生児(出生後4日目、p4)の幼いオス豚4頭(体重1.5〜1.8kg)を取得します。
- 動物たちは豚小屋の専用の部屋に一緒に収容し、ヒートランプとタオルで敷かれた床で支えられます。最初の1週間は 自由に ミルク代替品で与え、2〜3週間で徐々にペレットフードに移行させてください。
- 生理活動と体重を監視し、イソフッ化麻酔下で週に一度MRIスキャンを行います。
- ペントバルビタール過剰投与で安楽死させ、ヘパリン化生理食塩水で心裏灌流し、その後10%中性緩衝ホルマリンを投与します。
- 頭蓋骨から脳を切り離し、ホルマリンで一晩固定し、その後PBSに30%ショ糖を浸して3日間冷凍保存します。
2. アガロースジェル成形
- ガラス容器を湿った氷の入ったバケツに半分の高さまで浸します(図2A)。
- 容器のライナーとして厚手のプラスチックストリップを使い、底と側面は完全に覆い、両端は上端から少なくとも5cm上に保ちましょう。
- ガラスビーカーで150mLのPBSを90°Cまで加熱し、磁石かき混ぜ棒を使った加熱板で、徐々に6gのアガロースを加えて溶解させ、PBS中の4%アガロースゲルを作ります。
- ガラス容器に0.5〜1cmの厚さの層を注ぎ込み(図2B)、固まるまで待ちます。
- 脳に薄くミネラルオイルを外用に塗り(図2C)、脳をジェル層の上に置きます(図2D)。
- アガロース溶液を50°Cまで冷やします。 冷却したアガロースゲル(図2E)で脳を埋め込み、固化させます(図2F)、通常は湿った氷上で約10分かかります。
- 外科用プローブで脳の上にあるアガロースゲルの最上層を慎重に除去し(図2G)、固化した型から脳を抽出します(図2H,I)。
- 別のガラスビーカーで98mLのPBSを、マグネット攪拌器付きの攪拌ホットプレートで90°Cまで加熱し、アガロース4gとインディアインク2mLを加えてよく混ぜます。抽出した脳の空洞に4%のアガロースと2%インディアインクを注ぎ(図2J)、満杯になるまで注ぎ、湿った氷の上で15分間固化させます(図2K)。
- プラスチックストリップの張り出した部分を使って、プラスチックストリップを持ち上げてアガロースブロック全体を容器から取り出します(図2L)。
3. アガロースブロックスライスとテンプレートの縮尺用紙へのコピー
- スライス作業中に紙を湿気から守るために、厚さ0.76mm(0.03インチ)の透明アクリル板2枚の間にスケール紙1枚を挟み(図3A)、ラミネート紙とアクリル板をベンチの端近くに置きます。
- 角の角をクランプでベンチに適切な位置に固定し、厚さ5mmのアクリルプレート2枚を立たせ、その間にジェルブロックを所望の向き( 図3の矢状状)でしっかりと固定します。各垂直アクリル板の端がスケール紙の同じ線に沿って揃っているか確認し、ジェルブロックのスライス基準として使ってください。重りを使って、スライスが行われる場所とは反対側の端にジェルブロックを固定します(図3B)。
- 下のスケール紙をガイドとして、アクリルプレートの間からジェルブロックを所望のステップ(2mmまたは5mm)で前に移動させ、両手でミクロトームブレードを持ち、アクリルプレートの前端より先の部分を切ります(図3B)。
- 各スライスを集め(図3C)、別の縮尺用紙(図3D)に置き、インドインク染色された鋳型部分をスケール紙に優しく押し当てて輪郭を転写します(図3E)、ペンでゲル部分全体の輪郭をなぞり、ゲル部分を取り除き、ペンでインドインク印刷の輪郭を描きます(図3F)。各スライスの向きとコピーしたテンプレートの向きを一貫させるように注意してください。
- ステップ2.3と2.4を繰り返し、すべてのジェルピースが目盛り紙にコピーされ、順番に番号付けされます。スライスとそのプリントを再確認してください(図3G,Hの冠状スライスとプリントの代表画像)。
4. アクリル版彫刻
- 大きなアクリル板にフレキシガラスの切断ナイフで溝を切り、10×8.5cmの大きさの板に割ります。
注:総数は脳の大きさ、希望するスライス厚さ、切る方向によって異なります。一般的に、新生児子豚の脳には冠状または矢状マトリックス用に25枚の2mmアクリルプレートを、より大きな脳には取り扱いやすくするために5mmプレートを15枚準備します。 - 左下隅から測定したアクリル板のx、y座標に3つのアンカー穴(mm単位)を示す:(11, 42);(45, 15);および(88, 42)。
- アクリル板は、ドリルプレスのプラットフォーム上の角角とクランプで固定します。アクリル板ドリルビット(図4A)で、前述の座標に3つのアンカー穴を開けます。すべてのプレートの右側に色の線を引いて向きを示します。
- アクリル板から保護フィルムを剥がし、スケール紙のテンプレートの上に貼り、アクリルプレートの上端をテンプレートの上端線と合わせます。永久マーカーペンで脳の輪郭をアクリル板になぞります(図4B)。テンプレート通り、プレートに順番にラベルを付けてください。
- バンドソーのアクリル板をテンプレートラインに沿って切ります(図4C)。あるいは、多目的カッティングキットと木彫りの先端を組み合わせた回転工具を使って不要な部分を取り除く方法もあります。
- 研磨用の研磨先端を使った回転工具で切断面を研磨し、切断工具の残ったエッジを滑らかにします(図4D)。
- アクリル板の切断部分を目盛り紙のテンプレートと照らし合わせて確認してください(図4E)。必要ならトリミングやポリッシュも行います。
- カットプレートを順番に積み重ねてマトリックスを組み立て、プレートの配置を確認します(図4F)。
5. 脳マトリックスの組み立てと拡張
- アクリル板の間に3枚のワッシャーを置き、それぞれ1つのアンカー穴を中心に配置します(図5A)。組み立て時間を短縮するために、すべてのアクリル板の同じ側に瞬間接着剤でアンカー穴の周りを接着します(図5A)。
- アクリル板を順番に積み重ね、各アンカー穴にステンレスボルトを差し込んでマトリックスを組み立て、ナットを締めて固定します(図5A)。
- 脳に接触する切断面を最終研磨してプレートを滑らかにします。
- マトリックスの上部を色分けして、スライス中の手順を識別しやすくします。プレートの上端を交互に黒、赤、そして白紙で塗ってパターンを作ります。この工程を繰り返し、すべてのプレートが同じパターンで色分けされるまで続けます(図5)。
- 形状を調整したり、特定の脳に適合するキャビティサイズを変更したい場合は、異なる脳サイズに適応するために選択されたアクリル板(図5B)を取り外したり追加したりすることで、これらのマトリックスの柔軟性が大幅に向上し、材料や労力の節約にもつながります。
6. 脳の冠状または矢状切断
- 高プロファイルなクライオスタットブレードの一端を、少なくとも2cmの長さのラボテープで巻いて、ユーザーの手を保護します。脳をマトリックス腔にしっかりと収めろ。刃の巻きついた端を持ち、慎重に刃をマトリックスのアクリル板の間に挟み、脳を冠状または矢状状にスライスし、脳をもう一方の手で支え固定します(図6A,B)。
注意: 注意:1) ホルマリン固定後の脳の各部位の質感が異なるため、刃に均等な圧力をかけるよう注意してください。 2) さらに、子豚の脳は大きいため、直接的な「押し下げ」切断よりも切断動作で脳を切る方が良い。 3) 切断時には、脳が傾いたり向きの変化を避け、もう一方の手で支えながらマトリックスにぴったりと収まることが非常に重要です。脳に過度な圧力をかけてマトリックスにかかることは常に避けるべきです。 - すべてのスライスをPBS入りの6ウェルプレートまたはステンレストレイに入れます。スライスを同じ向きに丁寧に並べ(図6C,D)、必要に応じて保存または進行してください。
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結果
1頭の子豚はp5歳の時にペントバルビタール過剰投与で安楽死されました。他の3匹は正常な生理活動と同等の体重増加(7.44〜8.4kg)を示しました。2頭の子豚はイソフルラン麻酔下で週に一度MRIスキャンを受け、p32で安楽死されました。4頭目の子豚は38ページで安楽死されるまで未熟なままでした。
子豚と人間の胎児の頭部サイズの類似性は 図1A、Bで示されており、これは齧歯類よりも少なくとも2桁大きいです。最初の数週間で子豚の脳の顕著な成長と皮質の発達が図 1Cに示されています。
図2は、インク染めアガロースゲルを用いた脳の各段階を示しています。鉱物油でコーティングされた脳はまずアガロースゲルに埋め込まれ、その後除去されました。その空洞はインタインク染...
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ディスカッション
このプロトコルは、子豚の脳や他の大型動物種を所望の向きと厚さで切断するのに用いられる、手頃で容易に作成できる脳行列を作成する方法論を提示します。重要なのは、限られた脳サイズ範囲でしか動作しない商用「固定サイズ」行列とは異なり、この方法はマトリックスを幅広い脳サイズに合わせて便利に調整・拡張できることです。本報告では、30gの子豚脳用に構築されたマトリックスが、80%大きな脳を収容できるように拡張し、正確な脳切断を可能にするぴったりとした設計に成功しました。矢状面切断マトリックスの脳の正中方向を維持するために、アクリルプレートの追加または除去は対称的に行うことが推奨されますが、脳領域間の成長比率が比較的不均一であるため、冠状マトリックスの場合は必ずしもそうとは限りません。さらに、このマトリックス製造法はサル、羊、イヌ科、猫、フェレットなど他の大型動物にも適用可能です。
現在の方法では、ブレインキャストを使ってテンプレートを作成します。代替案としては、MRI画像を使ってシリアルテンプレートを作成する方法があります。本研...
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は国立衛生研究所(NIH) #R21-NS114771(K.E.S.)、#R56-NS117587、#R01-EB028792、#R01-HD101508、#R21-HD091118、#R41-NS122722、#R42-MH135825(G.Y.)、アメリカ心臓協会(AHA)#16GRNT30820006(G.Y.)、#14SDG20480186(L.C.)、およびケンタッキー大学神経科学研究優先領域(L.C.)によって支援されました。幼稚なオスの新生豚は、ケンタッキー大学農学部の豚センターから実験動物資源局(DLAR)を通じて購入されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1/4インチ-20 x 3-1/2インチ ステンレスプラストラスヘッドマシンネジ(25個個)、粗ねじ、18-8(304)ステンレス、ボルトドロッパー製 | ボルトドロッパー | https://www.amazon.com/ Stainless-Phillips-Machine -Bolt-Dropper/dp/B07D1L8 7VB/ref=sr_1_2?crid=38M PNERXG39Q3&キーワード =1%2F4%22+3.5+インチ+ ステンレス+ボルト&qid=16427 82626&s=インダストリアル&sprefix =1%2F4+3.5+inch+stainless +bolts%2Cindustrial%2C62 &SR=1-2 | |
| 8×10インチ10パックPETシート/プレキシグラスパネル 0.03インチシック | カルパルミー | https://www.amazon.com/dp /B084P4YSST/?coliid=I1S59 82XD9P6CB&コリッド=XJ78FAX D85BF&PSC=1&ref_=lv_ov_lig_dp_it | |
| 3パック 3/16インチ(4.5mm)クリアアクリルシート 8インチ x 12インチ キャストプレキシグラス(0.177インチ)厚い公称サイズ AZM | AZMディスプレイ | https://www.amazon.com/4-5mm -アクリル-プレキシガラス-ノミナル-AZM /dp/B082CGYSCK/ref=sr_1_12? dchild=1&キーワード=アクリル+シート %2C+4.5mm&qid=1617572206&SR=8-12 | |
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| アガロース | アヴァンター | 97062-244 | |
| バンドソー | スキル | ||
| バースライトミルクリプレイサー(パイプストーン) | パイプストーン | SKU 8229 | https://pipevet.com/birthright-baby-pig-milk-replacer |
| バケツ | アヴァンター | 89233-340 | |
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| ガラスビーカー X 2 | アヴァンター | 470335-854 | |
| ガラス容器 | ウィートン染色皿 | ウィートン®nbsp;900303 | |
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| ハッカー・インスツルメンツ ミクロトームナイフブレード | ハッカー・インスツルメンツ | ||
| 重厚なプラスチックストリップ | アヴァンター | 89072-136 | |
| インディア・インク | スピードボール・スーパー・ブラック | ||
| アーウィンクイックグリップ クランプ、片手用、ミニバー、6インチ、4パック(1964758) | アーウィン | https://www.amazon.com/IRWIN -クイックグリップ-1964758-ワン- ハンデッドクランプ/dp/B001DSY4 QO/ref=sr_1_5?crid=3NJ320 86LJCS6&dchild=1&キーワード =clamps+for+woodworking&QID =1617634545&sprefix=clamp% 2Caps%2C184&SR=8-5 | |
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| ラボテープ | アヴァンター | 76276-016 | |
| ロックタイト1363589 4グラムボトル スーパーグルーウルトラジェルコントロール接着剤、3パック | ロックタイト | https://www.amazon.com/Loctite- 1363589-4-Gram-Control-Adhesive/ dp/B01HPT0AWQ/ref=sr_1_13? キーワード=superglue+power+glue +for+plastic&qid=1642782991&s 接頭辞=superglue%2Caps%2C83&SR=8-13 | |
| マイクロトーム用ハイプロファイル使い捨てブレード | 最適科学 | https://www.amazon.com/Optimal -Scientific-Microtome-High-Profile -Disposable/dp/B08MCSN6SL/ref =sr_1_1?dchild=1&キーワード=HIG h+プロファイル+クライオスタット+ブレード&qid=16 17592221&SR=8-1 | |
| 鉱物油 | シグマ・オルドリッチ | M8410-100ml | |
| PBS | アヴァンター | 97062-818 | |
| 研磨用サンディングチップ | カーバイドバービット20個 1/8インチシャンク | ||
| プレスターターペレット ノンメッド - #50(パイプストーン) | パイプストーン | SKU 8228 | https://pipevet.com/pre-starter-pellet-non-med-50-hubbard |
| レッドデビル 1170 プレキシガラス切断ツールカード | レッドデビル | https://www.amazon.com/dp /B000BZZ1D0/?coliid=I3C0K3 AKD3TS75&コリッド=XJ78FAXD8 5BF&PSC=1&ref_=lv_ov_lig_dp_it | |
| シャーピーの永久マーカー |チゼルチップマーカー | シャーピー | https://www.amazon.com/ シャーピー・パーマネントマーカー -Chisel-Classic/dp/B00006IFI A/ref=sr_1_8?crid=2GD78WJ5COF NN&キーワード=permanent+marker s+assorted+colors&qid=16427831 06&sprefix=permanent+markers% 2Caps%2C129&SR=8-8 | |
| かき混ぜるホットプレート | コーニング | 100493-718 | |
| かき混ぜるマゼント | VWR | 58948-138 | |
| STYLEZONE 10ピース 透明透明アクリルシート 8 x 10インチ 0.08インチ 厚さ2mmのアクリルボード | スタイルゾーン | https://www.amazon.com/dp/ B08GJYS4TT/?coliid=I11RLE V42BKEFB&コリッド=XJ78FAX D85BF&PSC=1&ref_=lv_ov_lig_dp_it | |
| 手術トレイ | アヴァンター | 10193-194 | |
| ウェットアイス | ラボメイド | ||
| 木彫りの先端 | 回転工具用の木彫り工具 | https://www.amazon.com/ stores/page/28E50A85-D8C 1-4669-8272-D5D435EA126F |
参考文献
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