方法論記事

スペクトル共焦点顕微鏡を使用したハイプレックスイメージングにより、非特異的組織蛍光を最小化

DOI：

10.3791/68644

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2025年10月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity(IBEX)は、ヘパリンブロッキングを追加して非特異的結合を最小限に抑え、スペクトル検出と計算アンミキシングを活用して自家蛍光を抑制することで、基本的なIBEX技術に基づいて構築されています。このアプローチにより、バックグラウンドの発生源を減らしながら画像取得を高速化し、堅牢なマルチラウンド、高パラメータ空間プロテオミクス解析が可能になります。

要約

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高度に多重化されたイメージングにより、機能的に多様な細胞とその固有の組織環境内のニッチの研究が可能になります。IBEX(Iterative Bleaching Extends Multiplexity)は、同じ組織切片上で複数のマーカーを視覚化できるサイクリック免疫標識および蛍光色素不活性化技術です。キャプチャされた画像は、その後分析して単一細胞データを取得し、細胞クラスター、その局在、および隣接する細胞タイプを定義できます。これらのデータの解釈は、蛍光顕微鏡に固有のバックグラウンドのソースから真のマーカー発現を区別する能力に依存しています。IBEXプロトコルを適応させたスペクトルIBEXは、スペクトル共焦点検出と計算アンミキシングを統合し、ヘパリンブロッキングを組み込んで電荷ベースのオフターゲット結合を低減します。この組み合わせにより、シグナル対バックグラウンド比が向上し、組織の自家蛍光が抑制され、ブリードスルーが最小限に抑えられると同時に、従来のマルチトラック共焦点イメージングと比較して取得時間が短縮されます。ヒト鼻ポリープ組織への応用は、高い好酸球含有量と強い自家蛍光を特徴とするモデルであり、6回のイメージングラウンドにわたって、構造、免疫、および細胞状態コンパートメントにわたる26のマーカーの信頼性の高いイメージングを実証しました。結果として得られるワークフローは、複雑な組織構造と細胞ニッチをキャプチャする、高次元の空間分解プロテオミクス情報を生成します。この最適化されたアプローチは、多重イメージングに堅実で広く適用可能な戦略を提供し、特に自家蛍光と非特異的染色が従来のアプローチを制限する組織に適しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組織は、3次元構造に組織化され、相互作用を通じて生命に必要な生物学的プロセスを調整する特殊な機能を持つ多様な細胞で構成されています。病理学は、細胞組成または組織構造の破壊がこれらの相互作用を妨げ、組織の恒常性を損なうときに発生します1。人間の健康と病気の根底にある生物学を理解するには、多数の特殊な細胞型が組織内でどのように局在し、相互作用するかについての知識が必要です。

トランスクリプトーム、エピゲノム、プロテオミクスレベルでの単一細胞プロファイリング技術の進歩により、特殊な細胞型の並外れた多様性が明らかになりました。2,3 シングルセルRNAシーケンシングやスペクトルフローサイトメトリーなどの技術は、これらの不均一な集団を特徴付けるために必要なパラメータの数を測定できます。しかし、これらのアプローチは、細胞を天然の組織環境から単一細胞懸濁液に解離させる必要があるため、空間情報を欠いています4,5。そのため、さまざまな疾患の状況に関連する細胞型が特定されていますが、組織内でのそれらの相互作用と疾患の永続化への寄与は不明のままです。

これらの制限のいくつかに対処するために、各細胞の位置を維持しながら、組織内の細胞の不均一性を捉えるためのいくつかの空間オミクス技術が開発されています6。例えば、遺伝子転写は、組織切片(例えば、Visium)を横切るラスタライズされたスポットでRNAを増幅することによって、または単一細胞分解能で画像化された特定の遺伝子のパネル(例えば、Xenium)を標的とするRNAハイブリダイゼーションプローブを使用することによって測定することができる7,8。これらの方法は、組織内の転写パターンや調節機構を追跡するのに効果的です。しかしながら、転写プロファイルはタンパク質発現との相関性が低いことが多く、これは細胞9の機能的能力をより直接的に反映する。タンパク質発現は、蛍光顕微鏡10,11によって検出できる蛍光色素に結合した特異的抗体を用いて同定することができる。従来の蛍光顕微鏡を使用すると、6つ以上の抗体結合蛍光色素の離散イメージングが可能になります。しかしながら、これらの蛍光色素の励起および発光プロファイルが重複しているため、任意の特定のチャネル12における蛍光シグナルの起源に関して不確実性が生じる。

Iterative Bleaching Extends multipleXity(IBEX)は、蛍光顕微鏡13、14、15のこの制限を克服するために開発されたハイコンテントイメージング法です。IBEXは、水素化ホウ素リチウム(LiBH4)を使用して、イメージング後に蛍光色素を化学的に不活性化し、再イメージングの前に同じ組織サンプルを後続の蛍光色素結合抗体で再染色できるようにします。IBEXは組織の完全性を維持し、同じ組織切片上の理論的には無制限の数のマーカーを視覚化するために、何ラウンドのイメージングも可能にします。取得した画像の計算アライメントは、空間データを保存して細胞ニッチを明らかにしながら、単一細胞の解像度でオミクスレベルの特性評価を提供します。このデータは、推定細胞相互作用を明らかにすることもできますが、これらは他の技術を使用して検証する必要があります16。IBEXは、市販の蛍光色素と互換性のあるオープンソースの方法であり、アクセシビリティ、迅速な導入、および高品質のデータ生成を促進するために試薬を検証し、データを公開している研究者の国際的なコミュニティによってサポートされています17,18。

この研究では、IBEXの修正プロトコルは、組織自家蛍光と蛍光色素結合抗体プローブの非特異的結合(総称してバックグラウンドと呼ばれる)という、この技術の2つの主要な課題を克服するように設計されています。自家蛍光は、組織に内因性の蛍光分子の励起が、抗体結合蛍光色素19,20から得られた目的のシグナルと重なる光を放出するときに発生します。蛍光色素結合抗体のオフターゲットまたは非特異的結合は、標的タンパク質を発現しない細胞または構造から蛍光を発します21,22。これらのアーティファクトにより、細胞が実際には発現していないマーカーを発現しているという不正確な結論が得られる可能性があり、計算分析と正確な細胞型の割り当てが複雑になる可能性があります。スペクトルIBEXは、オフターゲット信号のヘパリンベースの電荷中和と、フルスペクトル取得および計算アンミキシングを組み合わせることで、ブリードスルーを大幅に低減し、信号対バックグラウンド比(SBR)を改善し、ラウンドあたりの取得時間を半分に短縮します。

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プロトコル

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この研究で使用された鼻ポリープ組織は、ハミルトン統合研究倫理委員会からの倫理的承認を得て、ハミルトンヘルスサイエンスでの副鼻腔手術中に収集されました。すべての参加者からインフォームドコンセントが得られました。

1. サンプル採取

  1. 慢性副鼻腔炎患者に対して行われる日常的なポリープ切除術中にサンプルを採取します。外科的に除去したら、サンプルを氷上の医療用生理食塩水の入ったバイアルに入れて輸送し、組織の完全性を維持するためにすぐにイメージング用に処理します。

2. 試薬の調製

  1. 得られた固定および透過処理溶液をPBSで1:4に希釈して、固定および透過処理溶液を調製します。PBS中の30%スクロースとして凍結保存溶液を調製します。希釈バッファーをPBS中の0.1%v / v Triton X-100として調製します。
  2. BSAブロック試薬を希釈バッファー中の1%w / vウシ血清アルブミンとして調製します。ヘパリンブロック試薬を10KUヘパリンナトリウム塩として1mLのPBSで調製します。BSAブロック試薬でヘパリンブロック試薬(1:50)とFcブロック試薬(1:100)を混合してブロッキングバッファーを調製します。
  3. ブロッキングバッファーで適切な希釈液で滴定された抗体として染色ミックスを調製します。10 mLの超純水に10 mgのLiBH4 を加えて漂白液を調製します。

3. 組織処理とグロス加工

  1. 解剖顕微鏡で組織を検査し(通常は~15倍の倍率ですが、サンプルと顕微鏡によって異なる場合があります)、鉗子とメスで脂肪と骨を除去します。組織を最大限に保存するには、清潔な器具を使用し、冷たく濡れた表面で作業し、処理時間を最小限に抑えます。
  2. 厚さ0.5 cmの肉眼大組織>メスで4〜5 mmのスライスにします23。スライスを固定および透過処理溶液に浸漬し、°Cで16時間回転させます。
    注:この溶液とステップ3.3の他の溶液の容量は、適切なサイズのチューブ内で、サンプルの体積の約20倍である必要があります。
  3. 組織をPBSに移動し、5分間すすぎます。組織を凍結保存液に浸し、°Cで16時間インキュベートします。このステップの後は、組織に水が再び入り込むため、洗わないでください。

4.組織凍結

  1. 各ウェルの上に実験とサンプルの詳細を記載した6ウェルプレートにラベルを貼り、-20°Cの冷凍庫に入れて少なくとも20分間冷却します。
  2. 適切なサイズのクライオモールドに最適切断温度(OCT)コンパウンドを充填します。OCTに気泡を作らないようにしてください。大きな気泡は、ニードルまたはピペットチップを使用してクライオモールドの端までドラッグします。
    注:クライオモールドは、小さな平底のバイアルまたはチューブにアルミホイルを巻き付けて作成できます。
  3. 凍結保存液から組織を取り除きます。凍結を損なう可能性があるため、糸くずの出ないティッシュワイプにティッシュを軽くたたいて余分な液体を取り除きます。
  4. 250 mLのビーカーに約100〜150 mLのイソペンタンをヒュームフードに入れ、液体窒素で部分的に満たされたフォームボックスまたはクーラーに入れます。
    注:イソペンタンは、2時間以上開いたままにすると蒸発します。開封後すぐにご使用ください。イソペンタンは、組織の均一かつ迅速な凍結を促進します。イソペンタンは時間の経過とともにゆっくりと凍結する可能性があります。固形で凍った場合は、液体窒素からビーカーを取り出し、解凍します。イソペンタンは、キャップ付きのガラス瓶に注ぐことができ、最大5回再利用できます。イソペンタンのレベルは、ビーカーが浮いたり転倒したりするのを防ぐために、液体窒素よりも高くする必要があります。
  5. 解剖顕微鏡下でOCT内で必要に応じて組織の向きを調整します。
    注:鼻ポリープ組織の場合、通常、サンプルを長軸に沿って配向して、可能な限り最大の断面積をキャプチャする対称的な断面を取得します。最適な包埋方向については、目的の組織の組織学マニュアルを参照してください。
  6. クライオモールドの底をイソペンタンに浸します。組織の中心が完全に白く不透明になったら、イソペンタンからクライオモールドを取り除きます。クライオモールドを完全に水没させないでください。ブロックにひびが入り、切片化が損なわれる可能性があります。
  7. 背面に圧力をかけてブロックをクライオモールドからそっと取り出し、-20°Cで予冷した6ウェルプレートに入れます。 すべてのサンプルを凍結した後、プレートを-80°Cの冷凍庫に移して長期保存します。
    注: これは一時停止ポイントです。組織は-80°Cで何年も保存できます。

5. スライドの準備と凍結切片

  1. 10〜1 μLのクロムミョウバンゼラチン接着剤をスライドにピペットでかけます。均一に広げ、15分間自然乾燥させます。最適な接着のために、クロムミョウバンゼラチン接着剤をチャンバー付きカバーガラスに2x〜3回塗布し、塗布ごとに5 μL(合計15 μL)を加えます。
  2. 乾燥後、スライドを80°Cのオーブンに1時間入れて、完全に乾燥させます。チャンバー付きカバーガラスを使用する場合は、プラスチックが80°Cで溶ける可能性があるため、37°Cで一晩乾燥させてください。
    注:スライドをコーティングして乾燥させたら、使用するまで室温で数日間保存できます。ほこりを避けるために覆う必要があります。
  3. 組織を-80°Cから-20°C(または切断温度でクライオスタットに)移して平衡化し、切片化前に1時間予備冷却します。クライオスタット24で10〜2μmの切片を切断します。
    1. チャンバー付きカバーガラスに切片化する場合は、アンチロールプレートを持ち上げた後、鉗子を使用してセクションをそっと持ち上げます。絵筆を使用して、チャンバー内のガラスの上に平らに置きます。カバーガラスの底にあるサンプルの下に親指を押して、セクションをガラスに溶かします。
  4. スライドを3°Cで1時間、または室温で24時間乾燥させます。
    注:スライドをすぐに使用する場合は、スライドボックスに室温で一時的に保管して、染色の準備をしながらほこりから保護することができます。ただし、すぐに使用しない場合は、組織の完全性を保つために-80°Cで保管してください。これは一時停止ポイントです。スライドが-80°Cで保存されている場合は、ここでプロセスを一時停止できます。

6. ブロッキングと抗体免疫標識

  1. PAPペンを使用して組織の周りのガラスに円を描き、染色またはその他のステップ中に液体を含む疎水性バリアを作成します。OCTが溶けると疎水性インクが洗い流されるため、OCTの上に描かないでください。
    注:壁がウェル内の液体を保持するため、チャンバー付きカバーガラスにはこのステップは必要ありません。
  2. 各組織に~100 μLのPBSを加え、室温で~2分間インキュベートして組織を再水和し、OCTを洗い流します。チャンバー付きカバーガラスには~1 mLのPBSを使用します。
    注:組織がガラスから浮き上がらないように、液体をサンプルに直接ピペットで入れないでください。
  3. PBSを吸引し、100 μLのブロッキングバッファーを加えます。屋根付きの湿度チャンバーで室温で1時間インキュベートします。チャンバー付きカバーガラスには~400 μLのブロッキングバッファーを使用します。
  4. ブロッキングバッファーを吸引し、100 μLの染色混合物を加えます。蓋付きの湿度チャンバーでインキュベートし、冷蔵庫(4°C)内に一晩置きます。チャンバー付きカバーガラスには~400 μLの染色混合物を使用します。パネル内の蛍光色素の1つだけで染色された切片と、染色のないネガティブコントロールを準備して、蛍光色素のスペクトルと組織の自家蛍光を定義します。
    注:抗体希釈液は、1:50、1:100、1:200に滴定するか、必要に応じて別の希釈液に滴定することにより、実験的に最適化する必要があります。最適なシグナルを生成する抗体の最小量を選択してください。スペクトルの混合解除効果を最大化するために、パネル内のすべての抗体の強度がほぼ同等になるようにします。このステップを超える光からサンプルを保護して、蛍光色素の光退色を最小限に抑えます。
  5. 染色ミックスを吸引し、PBS(10 μL、各2分)で3回洗浄し、各洗浄の間に液体を吸引します。チャンバー付きカバーガラスには~1 mLのPBSを使用します。
  6. 各セクションに~10 μLの封入剤を追加します。イメージング中に光学収差を引き起こす気泡を避けるために、ゆっくりとピペットを踏み入れてください。ピペットを使用して形成された気泡を吸引します。チャンバー付きカバーガラスの場合は、各ウェルに1 mLの封入培地を追加します。
    メモ: チャンバー付きカバーガラスには、次の手順 6.7 と 6.8 は必要ありません。
  7. No.1 22 mm x 50 mmのカバーガラスを試料の上にそっと置きます。
    注:カバーガラスの一端を封入媒体にしっかりと押し付け、ガラスをサンプルに落とし、媒体を均一に広げることで、気泡を最小限に抑えることができます。カバーガラスの厚さは、対物レンズの仕様と一致する必要があります(たとえば、ほとんどの高開口数対物レンズの#1.5カバーガラス)。対物レンズに補正カラーがある場合は、正しいカバーガラスサイズに調整されていることを確認してください。間違った太さやカラーの設定を使用すると、球面収差が発生し、画像がぼやけたり歪んだりする可能性があります。
  8. スライドを裏返し、糸くずの出ないワイプをそっと押し下げて、余分な封入剤を押し出します。
    注意: スライドに力を入れすぎて押し下げないでください。過度の力を加えると組織が損傷したり変形したりする可能性があり、イメージングラウンド間の位置合わせに影響を与える可能性があります。

7. 顕微鏡のセットアップとイメージング

注:このプロトコルは、特にZEISS LSM980およびその他のZEISSシステムを指します。これらの手順は、他のシステムでは異なる場合があります。2つのワークフローが詳細に説明されています:従来の共焦点+アンミキシング(計算スペクトルアンミキシングポストホックによるマルチトラック取得)は、スペクトル検出器が利用できない場合に使用できますが、取得時間が長く、ブリードスルーが残っています。フルスペクトル検出(シングルパス、34チャンネルスペクトル取得)は、最高のSBR、ほぼゼロのクロストーク、および最速のイメージング時間を提供するため、推奨される方法です。

  1. 従来の共焦点顕微鏡
    1. イメージングの約30分前に顕微鏡システム(レーザー、検出器、コンピューターを含む)の電源を入れます。
    2. 顕 微鏡>対物レンズをクリックして到達する顕微鏡コントロール画面で、適切な対物レンズ(20x 0.8 NAなど)を選択し、必要に応じてレンズセーフワイプで洗浄します。
    3. サンプルをステージにしっかりと取り付けます。ガラスまたはカバーガラスチャンバーをスライドホルダーの同じ角/端に合わせて、連続したラウンドのX-Y位置合わせを容易にします。これは、取り付けられているホルダーによって異なります。
    4. GFP、YFP、またはRFP照明の接眼レンズを使用してサンプルに焦点を合わせ、コンピューター画面の[取得]タブに切り替えます。
      注:DAPI染色をUV光にさらすと(DAPIフィルターキューブを使用)光変換され、緑色蛍光分子に光変換されるため、接眼レンズを使用してサンプルに焦点を合わせるときにDAPIフィルターを使用しないでください(補足図1A)。
    5. オーバーラップとクロスレーザー励起を最小限に抑えるイメージングトラックを設定します(補足表1、 補足表2 は、ここに示す従来の共焦点顕微鏡実験の取得設定を報告します)。
      メモ:理想的な組み合わせには、DAPIまたはAF488とAF594、AF647、またはAF700など、明確な励起ピークと発光ピークが含まれます。
      1. 各トラックに最適な励起レーザーを割り当てます。最適な光学セクショニングのために、各トラックのピンホールサイズを1AUまたはAiryユニットに調整します。
      2. トラック内の各チューナブル検出器の取得波長範囲を、トラックの蛍光色素に応じて個別に調整します。
      3. レーザー出力と検出器ゲインの設定を調整して、SBRを最大化します。最大強度に達するピクセルがほとんどないことを確認します。
        注意: 検出器の光退色や露出オーバーを避けるために、レーザー出力をできるだけ低く保ちます。抗体希釈を最適化して、バックグラウンドより上で強いシグナルを検出します。
    6. 連続スキャンモードボタンを押してサンプルをプレビューし、スキャンパラメータ(スキャン速度、解像度、必要に応じて平均化)を設定します。
      注:小さなタイルの場合、背景を最小限に抑えるために、0.2〜0.3μsの滞留時間、1〜2回の平均ラウンドをお勧めします。セグメンテーションと単一セルの解像度を維持しながら速度を最大化するには、平均化を行わずに最速のスキャン速度を使用し、ピクセルサイズを0.2〜0.μm/ピクセルにします。たとえば、20x/0.80 NA対物レンズを使用してタイルあたり2048 x 2048ピクセルでイメージングすると、424.26 x 424.2 μm2フィールドで0.20 μm/ピクセルが得られます。
    7. 各トラックのテストスキャンを実行して、クロストークやブリードスルーをチェックします。
      1. すべてのマーカーで染色されたスライドで、連続スキャンモードで、各レーザーを低出力で開始し、マーカーが飽和せずにはっきりと見えるまでのみレーザーを上げます(LUT/彩度インジケーターを使用)。
        注:可能であれば、実験サンプルをイメージングする前に、複製サンプルまたは望ましくない領域を使用して顕微鏡設定を最適化することをお勧めします。これは、DAPI(光変換のリスクを回避するため)または光退色が速い蛍光色素(PEなど)で染色する場合に特に重要です。
      2. その蛍光色素の単一染色コントロールに移動します。レーザー出力と検出器ゲインを調整して、信号が明るく不飽和になるようにします。
      3. 同じ単一染色スライドで、他のすべての検出チャネルをスキャンします。オフチャネル強度がバックグラウンドを超える場合は、検出ウィンドウを狭めるか、励起/ゲインを下げます。
      4. 蛍光色素ごとに7.1.7.1-7.1.7.2を繰り返します。調整後、以前に最適化された染色を簡単にチェックして、特に共局在するマーカーの場合、強度を同等に保ちます。
    8. タイル機能を有効にし、タイル取得領域を定義します。
      1. 組織の中心にあるタイル取得領域の焦点を最適化します。一意の特徴 (特定の配置のセルのセット) を、後のラウンドでの配置の参照として見つけます。
    9. Z-stack機能を有効にし、[Z-stack]タブに移動します。[中央] タブに移動します。Zスタック内のスライスの数を少なくとも6に設定し、スライス間の間隔を少なくとも1μmにします。次に、 中央 ボタンをクリックして、現在のフォーカスポイント(手順6.1.8.1で決定)をスタックの中央スライスとして配置します。
    10. [ 実験の開始 ] ボタンをクリックして、画像の取得を開始します。取得設定を保存し、画像サムネイルを右クリックして [名前を付けて保存]を選択して、画像データをバックアップします。次に、ファイルの場所を選択し、画像に名前を付けます。
    11. タイル領域の取得から同じ最適化された設定を使用して画像をアンミックスし、ステップ6.4で準備した各単一染色コントロールからスナップをキャプチャして真のシグナルスペクトルを取得し、未染色コントロールからバックグラウンド/自家蛍光をキャプチャします。
      1. これらの画像は、スペクトルの混合解除に使用されます。多重化されたサンプルから真の信号を選択しないでください。最初に強度/形態が未染色コントロールのバックグラウンドに存在しないか、同等であることを確認し、次にマーカーの予想される局在化(例えば、膜 vs 核 vs 細胞質 vs 分泌パターン)を一致させることにより、選択した領域が真にシグナルを表していることを確認します。
      2. スナップ画像を開きます。[ Unmixing ]タブをクリックします。Unmix toolsタブの領域選択ツールの1つを使用して、正の信号の周囲にROIを描画します(その領域のスペクトルが表示されます)。各蛍光色素のスナップ画像ごとにこれを繰り返して、アンミキシング用の参照スペクトルを作成します。
        1. このスペクトルを蛍光色素の理論スペクトルと比較して、選択した領域が真のシグナルを表していることを確認します。各蛍光色素に従ってスペクトルに名前を付け、スペクトルデータベースに保存します。
          注:自家蛍光のスペクトルは、他のシグナルから混合を解除するために、別の蛍光色素として識別および処理することができます。パネルの最適化が完了すると、同じプロトコルと組織タイプが使用されている限り、同じ設定を再利用できるため、新しいリファレンスの取得は必要ありません。
      3. タイル化された画像をロードし、アンミキシングツールに移動します。+ボタンを使用して、各蛍光色素の参照スペクトルをアンミキシングリストに追加し、[ リニアアンミキシング] ボタンをクリックします。
    12. 後で分析するために、混合されていない画像を保存します。
      注:出力は、すべてのマーカーのチャンネルを持つマルチタイル画像です。続行する前に、ここで実験を一時停止できます。
    13. シェーディング参照画像を取得する
      1. サンプルのイメージングに使用したのとまったく同じ設定を使用して、DAPIキャリブレーションスライドの画像を取得します。画像を保存し、シェーディング参照として機能するDAPIチャネルのみを抽出します。出力はフラットフィールド画像です(補足図1B)。
        注:すべてのサンプルに対して参照画像を取得する必要はありません。同じ設定で同じ機器が使用されている限り、基準は同じである必要があります。 補足図1Cに示すように、取得した画像にシェーディングアーティファクトがない場合は、この参照は必要ありません。
  2. スペクトル共焦点顕微鏡
    1. 顕微鏡システム(レーザー、検出器、コンピューターを含む)の電源を入れます。適切な対物レンズ(20x 0.8 NAまたはその他の対物レンズなど)を選択し、必要に応じて清掃します。
    2. サンプルをステージにしっかりと取り付けます。カバーガラスが対物レンズに面していることを確認してください。
    3. 明視野またはDICを使用してサンプルに焦点を合わせ、蛍光モードに切り替えます。スペクトル取得を設定します。 補足表3は 、ここに示すスペクトル共焦点顕微鏡実験の取得設定を報告しています。
      1. 正しいレーザーを割り当てます。
        注:一部のレーザーは、複数の蛍光色素を励起することができます。したがって、蛍光色素ごとに固有のレーザーを使用する必要はないかもしれません。
      2. 使用するレーザーラインに適したビームスプリッターを選択してください。すべての検出器が可能な限り多くのスペクトルをキャプチャできるようにします。最適な光学セクショニングのために、ピンホールサイズを1AUに調整します。
    4. レーザー設定の最適化
      1. すべてのマーカーで染色されたセクションを使用して、低出力のレーザーで連続スキャンモードを開始します。良好なSBRでマーカーを識別できるようになるまで、各レーザーの強度を調整します。
        注:これにより、スペクトル的に重なり合う蛍光色素を正確に調整することはできませんが、単一染色されたスライドを顕微鏡に切り替える必要がある回数を最小限に抑えるのに役立ちます。
      2. 単一染色切片を使用して、各蛍光色素のレーザー強度を微調整します。各マーカーのシグナルが過飽和することなく視覚化できるようになるまで、単一染色セクションからすべてのマーカーを含むセクションに繰り返し切り替えます。
        注:レーザー強度またはゲイン設定が調整されるたびに、以前に最適化されたシングルステインスライドを再確認して、信号が最適な状態に保たれるようにします。最適なアンミキシングを行うには、シグナル強度レベルはマーカー間、特に共局在するマーカー間で可能な限り類似している必要があります。可能であれば、実験サンプルをイメージングする前に、複製サンプルまたは望ましくない領域を使用して顕微鏡設定を最適化することをお勧めします。これは、DAPI(光変換のリスクを回避するため)または光退色が速い蛍光色素(PEなど)で染色する場合に特に重要です。
    5. 手順 7.1.8 から 7.1.14 を実行します。

8. カバーガラスの取り外し (スライドにのみ適用され、チャンバー付きカバーガラスには適用されません)

  1. スライドをPBSに沈め、カバーガラスを外します。カバーガラスを無理に外そうとすると、組織が変形し、その後のイメージングラウンドで位置合わせの問題が発生したり、スライドから完全に剥がれたりする可能性があるため、避けてください。スライドに収まる十分な大きさの容器を使用し、PBS に完全に浸すことができることを確認してください。

9. 蛍光色素の漂白とサイクリング

  1. チャンバー付きカバーガラスのみ:組織を損傷しないように注意しながら、ピペットを使用してできるだけ多くの封入剤を吸引します。
    注意: チャンバーを横に傾けると、吸引が容易になります。
  2. 封入剤が完全に除去されるまで、~1 mL(チャンバー付きカバーガラス)または~100 μL(スライド)のPBSで2分間3回洗浄します。
  3. ドラフト内に漂白液を準備します。マイクロスパチュラを使用して、10 mg LiBH4 を乾いたビーカーに直接秤量します。LiBH4 を含むビーカーに10mLの超純水を直接慎重に加え、完全に溶解するまで混合して漂白液を作ります。
    注:反応性を最大限に高めるために、使用直前に準備してください。
    注意: LiBH4 は非常に可燃性であるため、このステップでは細心の注意が必要です - ヒューム フードが適切に使用されていること (つまり、適切な高さのサッシ、適切な PPE など)、一度に <10 mg の LiBH4 のみを使用して作業してください。LiBH4 を追加する前に、ビーカーが完全に乾燥していることを確認してください - そうしないと火災の原因となります。
  4. ガラス製パスツールピペットを使用して、~100 μLの漂白液を各組織切片に加え、ヒュームフードで室温で15分間インキュベートします。チャンバースライドには2mLの漂白液を使用します。
  5. BV色素(BV421、BV510など)を漂白する場合は、ウェルを落射蛍光顕微鏡に慎重に移動させます。DAPIフィルターを選択し、サンプルに焦点を合わせ、フルパワーで照らします。
    1. 5倍の対物レンズを使用すると、より広い照明フィールドが得られます。対物レンズやハウジングへの損傷を防ぐために、ステージをできるだけ低く下げてください。
  6. ガラスパスツールピペットを使用してLiBH4 溶液をウェルからデカントし、LiBH4 溶液のビーカーに戻します。
    注:これは現在、無駄なLiBH4です。溶液は、将来の使用のために保存することはできません。
  7. スライドを希釈バッファーで3回洗浄し、~3分間インキュベートします。チャンバースライドの総容量は2mLです。
  8. 抗体ミックスを加え、通常のプロトコルに従って染色します(ステップ6.3〜6.8)。
  9. ヒュームフード内の廃LiBH4に2N H2SO4を滴下し、定期的に混合します。
    注意:LiBH4は積極的に泡立ちます。これらの気泡は、LiBH4から放出されるH2ガスです。H2は非常に可燃性であるため、このステップでは細心の注意を払い、H2SO4を非常にゆっくりと添加してください。
  10. 溶液が泡立たなくなったら、吸収性のあるアンダーパッドに注ぎます。ビーカーを超純水ですすぎ、吸収性のあるアンダーパッドに注ぎます。
    注意: 吸収性アンダーパッドを化学薬品/バイオハザードバッグに入れ、固定し、地域の化学的危険ガイドラインに従って廃棄してください。

10. 画像取得後処理

  1. Zenソフトウェアで参照画像(手順7.1.14から)を開き、ファイル >開く>参照画像を選択します。
    注:取得後の画像処理ステップは、オープンソースのソフトウェアパッケージで実行することもできます。(例: ImageJ)。
  2. 明るさとコントラストを調整してダイナミックレンジを最適化するには、[ 処理>強度]> [コントラストストレッチ]> [自動>適用]をクリックします。
  3. [ 画像の処理]> [ピクセル タイプを 32 ビット (浮動小数点数)に変換] をクリックして>ピクセル >タイプを 32 ビットに変更します。
  4. [強度 >処理]> [正規化(彩度ピクセル = 0%)] >[適用]をクリックして、参照画像を正規化します。
  5. [ 処理]>[ガウス>スムージング ]をクリックして、半径(2〜5 px) > 適用>入力して、参照画像を滑らかにします(補足図1B)。
    注:ガウスぼかし半径を最適化するには、さまざまな値を試してください。正しい値を知るには、生の参照画像を処理された画像で割って(画像>処理計算機)、結果の画像は均一な強度(すべてのピクセルがほぼ同じ値)を持つ必要があります。
  6. [ファイル]>[開く]をクリックして、修正するマルチタイル画像を開き >マルチタイル画像を選択します。
  7. 次のパラメータで [処理] > [ステッチング ] をクリックして、処理された参照を使用してステッチングとシェーディング補正を適用します。
    1. ブレンドボックスにチェックを入れます。正しいシェーディングボックスにチェックを入れ、ドロップダウンメニューから処理された参照画像を選択します(ステップ10.5)。他のすべてのパラメータは同じままにします。
      注:最良の結果を得るには、パラメータの調整が必要な場合があります。
    2. [入力/出力]メニューで、マルチタイル イメージを入力として選択し、シェーディング参照を参照として選択します。
    3. 上部の [適用] ボタンを押すと、ステッチとシェーディングが補正された新しい画像が生成されます(補足図1D)。
      注:ステッチ補正(補足図1I-J)は、プロセスの後半で画像アライメントの精度を確保するために必要です。
    4. [ ファイル] > [保存] > [フォルダーの選択] をクリックして、修正した画像を保存します。

11. 画像の配置

  1. Imaris File Converter ツールを使用して、処理された画像を任意の形式 (.czs、.tif など) から Imaris 形式に変換します。
    注:このツールは、このWebサイト(https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)の指示に従ってダウンロードしてインストールできます。
  2. Imaris 拡張機能登録ツールを起動して、すべてのラウンドの画像をすべてのチャンネルの 1 つの画像に登録 (整列) します。
    メモ: ツールをインストールして画像を正常に整列させるには、次の Web サイト (https://github.com/niaid/imaris_extensions) の指示に従ってください。
  3. Imaris Extensions ボタンをクリックします。[SimpleITK ユーティリティ] > [チャネル設定を CSV にエクスポート] を選択します。
  4. [ 参照] をクリックし、(ラウンドの 1 つから) .ims 画像に移動して選択し、[ 開く] をクリックします。
  5. [エクスポート] をクリックし、CSV ファイルを保存する場所を選択します。名前を入力し、[保存] をクリックします。
  6. 保存した CSV ファイルを開き、チャンネル名が正しいことを確認します。必要に応じて編集します。
  7. 編集が行われた場合は、 Imaris Extensions > SimpleITK Utilities > Batch Configure Channel Settings に移動します。
    注: 前の手順で編集が行われていない場合は、この手順は必要ありません。
  8. [ 参照] をクリックし、CSV ファイルに移動して選択し、[ 開く] をクリックします。[ 次へ] をクリックし、もう一度 [参照] をクリックして同じ .ims 画像を選択し、[ 開く] をクリックします。
  9. [設定] をクリックして変更を適用します。異なるラウンドのすべての画像に対して、手順11.3〜11.8を繰り返します。
  10. チャネルに正しく名前が付けられたら、 共通チャネルを使用したZスタックのアフィン登録>SimpleITKアルゴリズム>Imaris Extensionsに移動します。
  11. [ 参照] をクリックし、すべてのラウンドを含むフォルダーに移動し、すべての画像を選択して、[ 開く] をクリックします。
  12. [次へ] をクリックし、登録チャネル (基準チャネル) を選択します。このプロトコルでは、DAPI チャネルが使用されました。次に、固定画像を選択します。
    注:ラウンド間で一定に保たれ、化学的または光退色に耐性のあるチャネル/マーカーを選択してください(DAPIなどの核色素など)。次に、固定画像を選択します。
  13. [高度なレジストレーション設定]をクリックし、[自動マスク]を除くすべてのボックスにチェックを入れ、[ガウス平滑化シグマ]を 5.0 に設定します。
  14. [完了]をクリックし、[登録]をクリックして位置合わせを実行します。登録が完了したら、[リサンプルして結合画像を保存]をクリックします。
  15. リサンプリング後、基準チャネルを選択し、[ 相関の計算] をクリックします。出力ファイルには、整列された output.ims 画像、登録前後の整列品質を示す 2 つの PDF、登録に使用された設定を含む JSON ファイル、およびプロセス全体のログを含む TXT ファイルが含まれます。

12. 画像の配置

  1. CellPoseを使用したセル/オブジェクトのセグメント化(v2.5)25
  2. シングル染色データセットごとに、マーカー独自の検出チャネルから1つのセグメンテーションマスクを生成します(例:CD20シングル染色の場合、AF488検出チャネル(CD20の目的のチャネル)からマスクを生成します)。
  3. ステップ2のセグメンテーションマスクを同じデータセット内のすべてのチャネルに適用します(CD20の例では、AF488由来のマスクをAF488に適用して真の信号を測定し、他のすべての検出チャネルに適用してブリードスルーを測定します)。
  4. scikit-image(regionprops_table)とNumPyを使用して、Pythonでオブジェクトごとの強度と面積を抽出します。
  5. 信号対バックグラウンド比(SBR)
    1. マーカーの意図した検出チャネル内のすべてのセグメント化されたROIの平均物体強度を計算します。
    2. バックグラウンド強度は、ゼロ値のパディングまたは範囲外のピクセルを除く、同じ視野内の ROI の外側のすべてのピクセルの平均強度として定義します。
      SBRを次のように計算します。
      figure-protocol-1
    3. バイオリンプロットでSBR分布を視覚化し、オブジェクトごとの値をポイント(または示されている場合はフィールドごとの値)として表示します。
  6. ブリードスルー定量化
    1. 意図しないチャネルごとに、手順 12.2 のマスクから同じ ROI を使用してブリードスルー (%) を計算します。
      figure-protocol-2
    2. 注:シングルステイン画像の意図したチャネルでは、分子と分母が同一であるため、対角線のエントリは100%に等しくなります(独自のチャネルで測定された真のマーカー信号)。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫蛍光イメージング技術が直面する2つの基本的な課題は、蛍光色素結合抗体プローブの非特異的結合と組織自家蛍光です。このプロトコルは、真のシグナルとバックグラウンドを区別して、多重免疫蛍光技術を最適化するように設計されています。

ヘパリンブロッキングは、シグナルを維持しながら非特異的蛍光色素結合を減少させます

顆粒球は、マーカー26,27の予想される形態学的分布と一致しない高強度のオフターゲット蛍光で有名です。例えば、慢性副鼻腔炎患者の鼻ポリープ組織において、膜リンパ球マーカーCD3、CD4、およびCD20で染色したと...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IBEXプロトコルを適応させたスペクトルIBEXは、免疫蛍光イメージングにおける2つの重要な問題である非特異的結合と自家蛍光にうまく対処します。好酸球性の高い組織をヘパリンで処理し、スペクトルアンミキシングを使用してチャネル間の自家蛍光とスペクトルの重複を排除すると、バックグラウンドを超える真のシグナルの検出が大幅に増加しました。すべてのマーカーを1回のパスでキャプチャすると、取得時間が短縮され、IBEXサイクルの速度が向上する可能性があります。スペクトル検出器が利用できない場合では、計算アンミキシングによる従来の共焦点取得を使用できますが、感度を最大化し、ブリードスルーを実質的に排除し、ラウンドあたりのイメージング時間を半分に短縮するため、フルスペクトル検出が推奨されます。多様な研究環境での複数の IBEX モダリティの実装をサポートするために、提案、考慮事項、およびデータを含む Spectral IBEX の詳細なプロトコルがここで提供されます。

組織の自家蛍光は、蛍光イメージングの大きな制限です。FFPEのよ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK、MJはALK Abello A / Sから資金提供を受けています。JFEKはメリダバイオサイエンスから相談料を受け取ります。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andrea Radtke博士とZiv Yaniv博士がIBEXのオンボーディングとイテレーションをサポートしてくださったことに感謝します。顕微鏡検査のサポートとトラブルシューティングを提供してくれたJoão Bronze de Firmino博士とMouhanad Babi博士、および顕微鏡にアクセスしてくれたMcMasterのCentre for Advanced Light Microscopyに感謝します。技術サポートを提供してくれた Tina Walker、Jianping Wen、Rangana Talpe Guruge に感謝します。この研究は、CIHR感染免疫研究所(CIHR-III)、CIHR循環器呼吸器健康研究所(CIHR-ICRH)、およびカナダアレルギー、喘息、免疫学財団(CAAIF)が共同で資金提供する査読済みの食物アレルギー研究助成金によって支援されています。この研究は、カナダ衛生研究所 (PJT-198169;JFEK)、JPビッケル財団医学研究助成金(JFEK)、カナダアレルギー喘息免疫学財団(JFEK、MJ)、カナダアレルギー臨床免疫学会(VO、MJ)、シュローダー財団(JFEK、SW、MJ)、食物アレルギーカナダ(JFEK、SW、MJ)、ALK Abello A/S(JFEK、MJ)、ザイッチファミリー(SW、MJ)、バックレルファミリー(JFEK)、オンタリオ大学院奨学金(SD)、およびマクマスター大学(VO)の健康科学プログラムの学士号。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2N硫酸(H2SO4)溶液該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
500 mL ビーカー該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
6ウェルプレート該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
Bcl-6 - アレクサ・フルー 647BDバイオサイエンス561525希釈係数 1:100
BDサイトフィックス/細胞孔固定/透過化キットBDバイオサイエンス554722
ベンチトップ解剖顕微鏡該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
牛血清アルブミン(BSA)シグマ・オルドリッチA4503
CD11c - アレクサ・フルー 700BDバイオサイエンス561352希釈係数 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEバイオレジェンド356503希釈係数 1:200
CD20 - アレクサ・フルー488インビトロジェン53020282希釈係数 1:100
CD21 - アレクサ・フルー 532ノバスバイオNBP2-60733AF532希釈係数 1:100
CD23 - PEバイオレジェンド338507希釈係数 1:200
CD3 - iFluor 594AATバイオクエスト100320C0希釈係数 1:100
CD31 - アレクサ・フルオ 700バイオレジェンド303134希釈係数 1:100
CD34 - iFluor 594AATバイオクエスト103400C0希釈係数 1:100
CD38 - アレクサ・フルー 700バイオレジェンド303523希釈係数 1:100
CD4 - アレクサ・フルー 647バイオレジェンド300520希釈係数 1:100
CD45 - Alexa フルオ 532サーモフィッシャー・サイエンティフィック58045942希釈係数 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647バイオレジェンド353113希釈係数 1:100
クロムラムゼラチン接着剤ニューカマー・サプライ1033A
クライオモールドフィッシャー・サイエンティフィック NC9511236また、より大きなサンプルについてはカタログ番号50-465-347も参照してください
DAPIキャリブレーションスライドアガー・サイエンティフィックAG2273
DAPI溶液、1 mg/mLサーモフィッシャー・サイエンティフィック62248希釈係数 1:3000
E-カデリン/CD324 - Alexa Fluor 647バイオレジェンド147307希釈係数 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594バイオレジェンド324228希釈係数 1:100
エッペンドルフ/ファルコンチューブ該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
フルオロマウント-Gサザンバイオテック0100-01
鉗子該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
FoxP3 - eFluor 660サーモフィッシャー・サイエンティフィック50577382希釈係数 1:100
フロステッドエンド顕微鏡スライドケムサイエンスGEW45-2575-W
GL7 - アレクサ・フルー488サーモフィッシャー・サイエンティフィック53590282希釈係数 1:100
ヘパリンナトリウム塩シグマ・オルドリッチH339310KU
HLA-DR - PEノバスバイオNB100-77855PE希釈係数 1:200
ヒトTruStain FcX(Fc受容体遮断ソリューション)バイオレジェンド422302希釈係数 1:100
湿度チャンバー該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
蓋付きのアイスバケツ該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
IgD - アレクサ・フルオナ488バイオレジェンド348215希釈係数 1:100
IL4Ra/CD124 - PEバイオレジェンド144803希釈係数 1:200
イマリスファイルコンバーターオックスフォードの楽器該当なし任意の画像ファイル形式を.ims形式(https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)に変換する方法
イソペンタン(2-メチルブタン)該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
Ki-67 - アレクサ・フルー488BDバイオサイエンス558616希釈係数 1:100
キンバリークラーク プロフェッショナル キムテックサイエンス キムワイプ 繊細な作業用ワイパー、1プライキムテック・サイエンス06-666
大きな(すなわち長さ25cm)の鉗子該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
液体窒素該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
ホウ化リチウム(LiBH4)シグマ・オルドリッチ222356
MECA-79 - アレクサ・フルー488インビトロジェン53603680希釈係数 1:100
顕微鏡スライドカバーガラスNo.1 22x50mmフィッシャー・サイエンティフィック 12-542A
ミリQ水該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
MUC2 - アレクサ・フルオ 488ノバスバイオNB120-11197AF488希釈係数 1:100
Nunc Lab-Tek チャンバー付きカバーガラスサーモフィッシャー・サイエンティフィック155380
PAPペンアブカムAB2601
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)溶液該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
メス該当なし該当なし研究室で使えるものを何でも使っています
SimpleITK Imaris拡張該当なし該当なし異なるラウンドの画像を整列するためのソフトウェア(https://github.com/niaid/imaris_extensions)
ショ糖シグマ・オルドリッチS0389
ティッシュテックO.C.T.コンパウンドサクラ・ファインテックUSA4583
トライトン X-100シグマ・オルドリッチX100
ツァイスLSM 980ツァイス顕微鏡該当なし本研究で使用された画像診断システム
禅ブルーツァイス顕微鏡該当なしポスト取得画像処理に使用されるソフトウェア

参考文献

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