腫瘍内金ナノロッドによる近赤外光の光熱変換によるマウス腫瘍モデルにおける標的軽度温熱療法の誘導

サマリー

このプロトコルは、固形腫瘍モデルにおける標的温熱療法に必要な技術と方法論を提示します。このアプローチは、腫瘍内に注入された金ナノロッドによる近赤外光の光熱変換を利用して、腫瘍微小環境内で局所的な加熱を誘導します。

要約

軽度の温熱療法 (42-48 °C) は、制御された腫瘍細胞死を誘導し、抗がん免疫応答を刺激できる確立された治療法です。しかし、周囲の健康な組織を温存しながら腫瘍組織に正確に熱を届けることは、依然として重大な課題です。孤立した四肢灌流などの従来の温熱療法は、複雑で侵襲的な処置を必要とし、局所毒性と患者の罹患率の重大なリスクを伴います。対照的に、近赤外線 (NIR) 光によって活性化される金ナノ粒子を使用した光熱療法は、局所的な温熱療法を達成するための有望で侵襲性の低い戦略として浮上しています。特に金ナノロッド (GNR) は、調整可能な光学特性と高い光熱変換効率を示し、腫瘍部位の正確な熱変調に理想的な候補となります。この技術は、特に表在性腫瘍やアクセス可能な腫瘍に対してかなりの期待が寄せられていますが、再現性のある送達、空間的制限、および安全性は依然として改良の活発な領域です。このプロトコルでは、生体適合性 GNR の腫瘍内注射とそれに続く短時間の標的 NIR レーザー曝露を使用して、局所的で軽度の温熱療法を達成するための検証済みで最適化された方法を紹介します。このアプローチにより、治療範囲内で迅速かつ制御可能な加熱が可能になり、免疫原性腫瘍細胞死が促進され、免疫学的に「冷たい」腫瘍に特に関連するメカニズムである自然免疫応答が刺激されます。リアルタイムの温度監視とローカルデリバリーにより、再現性、安全性、全身への曝露を最小限に抑えます。この合理化されたプロトコルは、前臨床研究のための堅牢でアクセスしやすいプラットフォームを提供し、がん免疫療法で軽度の温熱療法を利用するための広範な取り組みをサポートします。

概要

がん治療には、薬剤耐性、免疫回避、オフターゲット毒性などの重大な課題が残っており、これらはすべて従来の治療法の長期的な成功を損ないます。これらの制限により、健康な組織への巻き添え損傷を最小限に抑えながら耐性メカニズムを克服するように設計された補完的な治療戦略の開発が推進されています。組織温度を42〜48°Cに上昇させることとして定義される軽度の温熱療法は、標準的ながん治療の効果的な補助として長い間認識されてきました¹。歴史的に、軽度の温熱療法は、腫瘍灌流を増加させ、間質構造を破壊し、悪性細胞を細胞毒性物質に感作することにより、これらの治療法の有効性を高めるために、手術、化学療法、または放射線療法と組み合わせて使用されてきました¹。最近では、腫瘍学における免疫療法の成功に伴い、軽度の温熱療法の固有の免疫調節の可能性を活用して抗腫瘍免疫応答を改善することへの関心が高まっています ^1,2,3。

臨床上の利点が実証されているにもかかわらず、腫瘍温熱療法の広範な応用は、オフターゲット組織損傷を回避しながら腫瘍の局所的、制御可能、再現性のある加熱を達成するという課題があるため、依然として限られています⁴。局所四肢灌流や全身的に送達されるナノ粒子ベースのアプローチなどの現在の臨床的および実験的温熱療法技術は、多くの場合、空間精度の制限、腫瘍の取り込みの変動、および全身毒性の可能性に悩まされています 2,5,6,7,8,9 .標的温熱療法は、このがん治療分野における新たなモダリティであり、周囲の健康な組織への損傷を最小限に抑えながら腫瘍温度を選択的に上昇させるように設計されています。より具体的には、金ナノロッド (GNR) の標的送達は、軽度の腫瘍温熱療法の精度と毒性の現在の限界を克服するための有望な方法です。GNRは、NIR領域での調整可能な表面プラズモン共鳴、高い光熱変換効率、および他の金ナノ構造と比較して良好な生体内分布プロファイルにより、光熱アプリケーションに特に適しています^10,11。NIR 波長に対する応答性により、周囲の構造への損傷を最小限に抑えながら、より深い組織でも効率的な光吸収と局所的な加熱が可能になります。そのため、GNR は温熱療法における有効性、標的化、安全性を向上させることができます。

この方法の目標は、固形腫瘍において軽度の金ナノロッドを介した温熱療法を達成するための、非常に効率的でリソース集約的で再現性のあるプロトコルを提供することです。GNR を介した標的温熱療法 (THT) と呼ばれるこの技術は、腫瘍内直接 GNR 注射と外部 NIR 光活性化を組み合わせることにより、従来の温熱療法アプローチの主要な制限に対処します。これにより、局所ナノ粒子濃度が高くなり、特に全身的に送達される薬剤を効率的に蓄積できない可能性のある小さな腫瘍や血管新生が不十分な腫瘍の再現性と安全性が向上します。さらに、GNR の直接腫瘍内注射とそれに続く近赤外 (NIR) 光への曝露を採用することで、従来の局所温熱技術に関連する全身曝露、毒性、およびオフターゲット効果を最小限に抑えながら、腫瘍の正確で制御された局所的な加熱が保証されます。

多くの癌は、免疫逃避の複雑で多様なメカニズムを示しており、最も明白なのは、腫瘍微^{小環境2,4,5}内の免疫細胞浸潤が不十分であることを通じて、さまざまな手段を通じて免疫療法に抵抗することを可能にする。軽度の温熱療法は、免疫療法と組み合わせて使用すると相乗効果のあるソリューションを提供します。直接的な細胞毒性作用に加えて、軽度の温熱療法は免疫原性細胞死(ICD)を優先的に誘導し、腫瘍関連抗原(TAA)および損傷関連分子パターン(DAMP^)の放出につながります^1,2。これらのシグナルは、自然免疫経路を活性化し、腫瘍抗原提示を強化し、樹状細胞の成熟を促進し、T細胞のプライミングを強化し、最終的に腫瘍微^{小環境への}免疫細胞の浸潤を増加させます^1,6,12。私たち自身の前臨床モデルでは、このGNRを介したTHT技術は、局所免疫応答を活性化し、腫瘍免疫浸潤を強化するように機能しました¹³。腫瘍内インターロイキン-2 (IL-2) 療法または全身抗 PD1 チェックポイント阻害と組み合わせると、この GNR を介した THT 技術は抗腫瘍免疫をさらに増強し、乳がんおよび黒色腫モデルにおいて単剤療法単独よりも優れた成績を収めました¹³。これらの結果は、乳がん^14、15、16、脳腫瘍^17、18などの固形腫瘍におけるナノ粒子を介した温熱療法と免疫療法の相乗効果を裏付ける証拠の増加と一致しています。要するに、免疫学的に「冷たい」腫瘍を「熱い」腫瘍に変換することにより、GNRを介したTHTは、チェックポイント阻害剤^を含む免疫療法に対する反応性を向上させることができます^1,2,12。

ここで紹介するGNRを介したTHTプロトコルは、リソースが少なく、技術的に簡単で、皮下腫瘍または表在腫瘍に広く適応できます。この技術は、黒色腫や乳がんなどの皮下腫瘍または表在性腫瘍のマウスモデルを扱う研究者に特に適しています。ただし、わずかな変更を加えると、他の腫瘍の種類や解剖学的部位に拡張される可能性があります。さらに、この技術は、空間制御された温熱療法を前臨床がん研究、特に免疫療法増強戦略を調査するがん研究に統合し、免疫療法治療に対する治療反応を改善したり、免疫療法に対する耐性を克服したりするために軽度の温熱療法を探求しようとしているがん研究に統合するための多用途のプラットフォームを提供します。さらに、この技術の実装に必要な知識と機器は、さまざまな医療現場にアクセスし、適応できるため、より広範な臨床使用における実現可能性が高まります³。

この原稿では、860 nmで動作するNIRレーザーシステムを使用してマウスモデルにGNR媒介THTプロトコルを実装するための詳細なステップバイステップの手順を提供します。このプロトコルの成功は、適切な波長の近赤外光を使用した金ナノロッドの効率的な深部組織活性化にかかっています。また、マウス腫瘍モデルにおいて、一貫した、安全かつ効果的な軽度の温熱投与を達成するための手順上の考慮事項(手順全体にわたる腫瘍内部温度の正確なリアルタイムモニタリングなど)も強調します。この方法は、以前に報告されたナノ粒子温熱療法アプローチの側面に基づいて構築され、統合され、前臨床がん研究のための包括的で検証済み、高精度で再現性のある代替手段を提供します。全体として、このプロトコルは、腫瘍に局在する温熱療法を実施するための生物学的に安全で費用対効果が高く、毒性の低い方法を提供し、既存のがん免疫療法の有効性を高め、腫瘍学における温熱療法の臨床的有用性を拡大する強い可能性を秘めています。

プロトコル

すべての実験プロトコルは、カナダ動物管理評議会の倫理基準のガイドラインに基づいて、ダルハウジー大学の実験動物に関する大学委員会によって承認されました。動物の世話と使用に関して適用されるすべての国際的、国内的、および制度的ガイドラインが遵守されました。このプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. レーザーと治療施設の要件

1. 最大4,000 mAの強度で860〜10 nmの波長の光を照射できる完全に校正されたレーザーシステム±安全にアクセスできます。レーザー システムに適切なシャットダウン機構があることを確認してください。
   注:この研究では、カスタム設計のレーザーを利用しました。このプロトコルで使用されるモデルには、レーザーイネーブルキー、緊急停止ボタン、およびインターロックジャンパーがあります(接続されたジャンパーは、クラス4レーザールームへのドアアクセスなど、安全コンプライアンスに使用される安全スイッチに配線することもできます)。
2. 適切な熱電対記録ソフトウェアを介してライブ温度データを送信できる腫瘍内温度モニタリング用の挿入可能な校正済み温度プローブを取り付けます。
3. レーザークラスに必要な安全基準を満たす指定されたレーザー室を準備します。遮るもののない作業エリアがあり、換気が良好で、適切な照明があり、すべての反射面が覆われていることを確認してください。意図しない暴露を防ぐために、レーザー操作中は部屋へのアクセスを制限します。研究に関与するすべての担当者がレーザー操作と安全プロトコルについて十分な訓練を受け、適切な PPE と目の保護具を着用していることを確認してください。
4. レーザー ルーム内に、レーザー セットアップのすぐ近くに麻酔器を収容できる作業スペースを確立します。レーザーがしっかりと取り付けられているが、調整可能であり、実験対象をレーザービーム源から約1〜2 cmの位置に配置して、腫瘍部位を正確に標的にすることができることを確認してください。
5. 三脚に熱画像カメラを使用し、レーザー露光中、被写体の表面から温度の読み取り値をキャプチャするように配置します。

2. 細胞培養・接種(腫瘍細胞注射)

1. 標準化された実験室細胞培養の調製および維持技術に従って、目的の腫瘍の種類に基づいて適切なマウスモデルを選択します。このプロトコルに従うには、CT26 腫瘍接種のために 6-8 週間齢の雌 BALB/c マウスを選択します。
   注:研究要件に応じて、さまざまな年齢および系統の免疫能力のあるマウスまたは免疫不全マウスを使用する場合があります。
2. 10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および2 mMグルタミンを添加したRPMI 1640培地でCT26がん細胞株を培養します。細胞を5%CO₂の加湿雰囲気で37°Cに維持します。培地を2〜3日ごとに更新し、1:4〜1:10の分割比を使用して、細胞を70〜80%のコンフルエントで継代培養します。初期継代(例:≤10継代)内で細胞を使用して、一貫した増殖と接種効率を確保します。必要に応じて培養を増殖し、接種に必要な数の細胞を取得します。
   注:マウスあたり必要な細胞数はモデルによって異なりますが、たとえば、CT26マウス結腸直腸癌モデルでは、マウスあたり5×10⁵細胞が必要でした。
3. トリプシン処理を使用して接着細胞を剥離し、滅菌1x PBSで2回洗浄します。滅菌1x PBS溶液に再懸濁して、5×10⁶細胞/mLの所望の濃度を達成します。細胞懸濁液を無菌の2 mL微量遠心チューブに氷上で最大1時間保存してから注入します。
4. 注射前に、4%気化イソフルランを0.8 L / minの流速で誘導チャンバーを使用してマウスを麻酔します。麻酔したら、イソフルランを2%に減らし、接種手順中はノーズコーンで麻酔を維持します。つま先ピンチテストを使用して麻酔の深さを確認し、痛みの反応がないことを確認します。乾燥を防ぎ、レーザーによる損傷の可能性を最小限に抑えるために、両目に目の潤滑剤を塗布します。
5. 電気シェーバーを使用して注射部位(この異所性CT26モデルの場合は左脇腹など)を剃り、アルコールワイプでその部分を洗浄して破片を取り除き、皮膚を消毒します。注射部位の皮膚をつまんで、26 G針と1 mLシリンジを使用して、100 μLの細胞懸濁液を5×10⁶細胞/mLで皮下注射します。注射後、マウスをノーズコーンから取り外し、ケージに戻して、保温ブランケットの上で1時間回復します。

3. 腫瘍の増殖と測定

1. 腫瘍測定キャリパーを使用して、通常は注射後 7 日目から毎日の腫瘍測定を開始します。幅、長さ、高さの 3 つの軸で腫瘍の寸法を測定し、長さ×幅×高さの π/6 ×楕円体の腫瘍体積式を使用して腫瘍体積を計算。
2. 腫瘍がおおよそ 50 mm³ (± 20 mm³) の体積に達したら、GNR 媒介 THT を開始することを計画します。
   注:CT26モデルの場合、この腫瘍体積は腫瘍細胞注射後10日目から12日目の間に達成されました)。
3. レーザー治療の前に、マウスを対照群と治療群にランダムに割り当てます。治療群は腫瘍内GNR注射を受け、その後レーザー照射を受けます。対照群は、GNR の代わりに腫瘍内 PBS 注射 (GNR 注射と同じ量) を受け、その後レーザー照射を受けます。

4. 腫瘍内GNRを用いた近赤外光の光熱変換

1. 滅菌生物学的安全キャビネットでは、31 Gの針が付いた0.3〜1 mLのシリンジを使用して、各腫瘍の体積に基づいて適切な量のGNRを抽出します。
2. がん細胞注射と同じ方法でマウスを麻酔します(ノーズコーンで2%イソフルランを0.8 L / minの流速で送達し、つま先ピンチテストを使用して適切な麻酔深度を確認します)。
3. 麻酔したら、イソフルランを2%に減らし、ノーズコーンを使用して麻酔を維持しながら、マウスをレーザープラットフォーム上の腹臥位に置きます。乾燥を防ぎ、レーザーによる損傷の可能性を最小限に抑えるために、両目に目の潤滑剤を塗布します。
4. 必要に応じて、腫瘍の周りの余分な毛皮を剃り、皮膚表面がレーザーにさらされるようにします。エタノールを使用して腫瘍表面を消毒し、毛皮や破片を拭き取ります。
   注:この研究では、860 nmでの吸収に最適化されたGNRを使用しました。ここで提案されているものとは異なるGNR製品を使用する場合は、レーザーNIR波長の供給がGNRの吸収スペクトルに従って最適化されていることを確認してください。
5. レーザー照射の前に、腫瘍体積の 1 μg/mm³ の濃度で GNR を腫瘍内に注射します。必要に応じて、2つの腫瘍内部位に注射を分割して、腫瘍内のGNRの効率的な分布を確保します。
   注:このプロトコルビデオでは、2 μg/μLの濃度のGNRを使用しました。したがって、50 mm³ 腫瘍の場合、25 μL の GNR を腫瘍に注入しました。それぞれの注射後は、皮膚表面の余分なGNRを必ず拭き取ってください。
6. 対照群マウスの場合、GNR注射群に使用される同等の体積の滅菌PBSを腫瘍内注射します(例えば、50 mm³腫瘍の場合は25 μLのPBSを注射します)。
7. 腫瘍内温度プローブをエタノールで消毒し、腫瘍塊の中央にそっと挿入します。
8. 皮膚潰瘍を防ぎ、治療中の熱損傷のリスクを最小限に抑えるために、腫瘍表面に厚さ約 5 mm のアロエベラ ジェルの均一な層を塗布します。
9. レーザーが腫瘍の中央の真上に揃うように調整されていることを確認します。放射照度ルックアップテーブル(表1)を使用して、腫瘍表面積をカバーするために必要なレーザービーム直径に基づいて適切なレーザー高さを決定します。腫瘍の直径に基づいてレーザーの高さを最適化し、一貫したエネルギー供給を確保します。
   注:私たちの実験では、直径1.3cmの腫瘍には1.5cmのレーザー高さが必要でした。
10. レーザーと魔法熱電気冷却(TEC)ソースのスイッチを入れ、レーザーシステムを電源に接続します(メーカーのプロトコルに従って調整)。魔法瓶の電気冷却源をオンにします。青色LEDが点灯し、30秒後にレーザーのTEC光源の温度が25°Cに安定するのを待ちます。
11. 放射照度ルックアップテーブル(表1)を使用して、レーザー電流出力を調整することにより、1 W / cm²±0.2 W / cm²の目標放射照度を達成します(レーザー光源ノブを目的の電流設定値に回します)。
    注:私たちの実験では、レーザーの高さ1.5 cm、ビーム直径1.3 cm、および1,800 mAのレーザー電流により、放射照度値は0 .82 W / cm²になり、この腫瘍モデルに最適化されました。
    この時点以降、レーザー手術室のすべての人が、使用する光の波長に対して認定されたレーザー安全メガネを着用するようにしてください。
12. レーザー処置中の皮膚表面温度を監視するために、マウスに向けられたレーザープラットフォームに隣接するサーモカメラをセットアップします。
13. 熱電対記録ソフトウェアで、新しいファイルを作成し、 記録 ボタンをクリックします。腫瘍内部の温度と時間のグラフがリアルタイムで表示されていることを確認します。
14. 安全キーを回して、レーザー光源の出力を有効にします。フットペダルを踏んでレーザー投与を開始します。
    注:このプロトコルでは、Raspberry Piコントローラはフットペダルとレーザー光源の間の内部インターフェースです。
15. GNR注入された腫瘍がレーザービームにさらされると、コンピューターソフトウェアが腫瘍温度の上昇を検出することを確認します。
    注:腫瘍内部温度はレーザー開始時に上昇し始め、腫瘍モデルのサイズと種類に応じて、42°Cの目標温熱範囲に入るまでに約15秒から2分かかります。
16. 腫瘍内部温度を温熱範囲(42°C〜48°C)に5分間維持します。腫瘍内部の温度を継続的に監視し、48°Cに近づいたら、ペダルから足を離し、温度を下げます。この温度の低下を、温度対時間表示グラフでリアルタイムで探してください。腫瘍内部の温度が~43°Cに下がったら、ペダルをもう一度踏んでレーザー投与を再び有効にします。このオン/オフレーザーペダルサイクルのパターンを継続して、腫瘍内部温度を適切な温熱範囲に5分間維持し、温度対時間表示グラフを監視します。
    1. 5分間の温熱療法期間中のいずれかの時点で腫瘍温度が42°Cを下回った場合は、失われた時間を補うために温熱療法の時間を増やしてください。たとえば、温度が42°Cを20秒下回った場合は、最初の5分間の時間の終わりに20秒を追加します。GNRを注入した腫瘍の中には、48°Cに達しない場合があり、レーザーのオン/オフサイクルは必要ありません。
       注:PBSを腫瘍内に注射した対照マウスでは、腫瘍は温熱範囲に達しません。必要に応じて、対照マウスのレーザーのオン/オフサイクルは、温熱反応の欠如が予想されるにもかかわらず、GNR治療グループで確立されたのと同じパターンに従う必要があります。
17. 腫瘍温熱療法の維持中は、皮膚表面温度を継続的に監視して、50°C未満にとどまることを確認します。 腫瘍内部の温度に関係なく、皮膚表面温度が50°Cに達した場合は、レーザーをオフにして冷却します。皮膚温度が50°Cを超えずに内部温度が望ましい温熱範囲に達することができない場合は、レーザー出力を下げるか、腫瘍部位に追加のアロエベラを塗布して熱を放散します。温熱範囲で5分後、フットペダルを放してレーザー投与を停止し、腫瘍内部温度を~37°Cまで下げ、レーザー安全キーをオフにします。
    注:皮膚温度を50°C未満に保つことにより、腫瘍潰瘍につながる可能性のある皮膚損傷を最小限に抑えることが重要です¹⁹。
18. 内部腫瘍温度プローブを監視し、腫瘍温度を約37°Cまで下げます。 温度プローブを腫瘍からそっと取り外し、腫瘍表面に残っているアロエベラゲルを拭き取ります。
19. マウスをノーズコーン麻酔薬から取り外し、ケージに戻す前に動物の覚醒を監視します。手順後の回復期間中、ケージを37°Cのヒートパッドに部分的に置き、マウスが体温を調節するために必要に応じて暖かい場所と涼しい場所の間を移動できるようにします。各マウスを監視して、飼育施設に戻す前に通常の動作に戻っていることを確認します。

結果

このGNRを介したTHTプロトコルの目標は、固形腫瘍を42〜48°Cの望ましい穏やかな温熱範囲まで一貫して確実に加熱することです。 この手順の主な手順を 図 1 に示します。このプロトコルの成功は、特定の固形腫瘍モデル内で制御された再現性のある軽度の温熱療法を確立し、維持するかどうかにかかっています。使用したGNRは、特許取得済みのCTABフリー法を用いて合成され、独自の界面活性剤溶液で金塩を還元し、棒状の結晶成長を促進しました。合成後、生体適合性を高めるために、天然界面活性剤を低分子量PEGに大部分置き換えました。得られたGNRは、サイズが均一で(51.1 ± 10.8 nm x 12.2 ± 1.9 nm)、最適な励起波長は860 ± 10 nmで、検出可能なエンドトキシンが含まれていませんでした。

適切な腫瘍加熱と正確な温度追跡を確保するには、腫瘍内温度プローブを腫瘍の中心に挿入する必要があります。さらに、サーマルイメージャーを使用して処置全体を通して皮膚表面温度を監視することも重要です。特に体積が小さい腫瘍の場合、腫瘍内に注射されたGNRが腫瘍周囲および/または腫瘍周囲の皮下腔に拡散する可能性があります。近赤外光にさらされると、皮膚が基本的な生理学的レベルを超えて加熱される可能性があり、皮膚が軽度の温熱レベル(50°C以上)を超える温度に達すると、かさぶたや潰瘍などの皮膚損傷につながる可能性があります¹⁹。腫瘍の表面にアロエベラゲルの層を塗布することは、皮膚表面温度を調節し、近赤外レーザー照射中の熱損傷を防ぐための重要な予防措置です。いずれにせよ、THT 後 48 時間にわたって潰瘍の兆候がないか治療部位を監視することをお勧めします。 図2 は、腫瘍温度管理を最適化するために提案されたセットアップを視覚的に表現し、NIRレーザープローブに対する内部腫瘍温度プローブとアロエベラゲル層の位置を示しています。

この実験プロトコルの相対的な成功は、レーザー操作全体を通して腫瘍内部温度対時間グラフを観察することから判断できます。GNRを腫瘍内に注射したマウスの場合、腫瘍は15秒から2分以内に軽度の温熱範囲(42〜48°C)に加熱されると予想されます。腫瘍内部温度が軽度の温熱範囲に入ると、適切な範囲内でプラトーになるか、腫瘍内部温度が48°Cを超えないようにレーザー投与のオン/オフサイクルが必要になると予想されます( 図3Aを参照)。5分間の軽度の温熱療法の維持が成功すると、肯定的な結果と見なされます。PBSを腫瘍内に注射したマウスの場合、腫瘍が温熱範囲まで加熱されることは予想されません。860 nmの波長のNIR光への曝露だけでは、組織を軽度の温熱範囲に加熱させるのに十分ではなく、対照腫瘍は約39〜40°Cで頭地変動すると予想されます。 図3B は、5分間の手順全体を通して、GNRと対照(PBS注射)マウスの間の腫瘍内部温度対時間グラフを示しています。GNR 注射された腫瘍が NIR 光にさらされても温熱範囲に到達できない場合、または適切な温熱範囲に 5 分間維持できない場合、これは陰性の結果と見なされます。

この GNR を介した THT プロトコルの成功を判断するための追加の下流分析には、処置後の腫瘍体積の変化の測定が含まれます。GNRを介したTHTの実施に成功すると、標的を絞った腫瘍細胞死と抗がん免疫応答の活性化が引き起こされ、腫瘍の退縮とそれに伴う腫瘍体積の減少につながります¹³。 図4 は、2つの皮下脇腹マウスがんモデル(B16-黒色腫およびCT26-異所性結腸直腸がんモデル)および1つの乳腺脂肪パッドマウスがんモデル(4T1-乳がん)のGNR媒介THT後の腫瘍体積の変化を示しています。各モデルでは、対照と比較して腫瘍体積の有意な減少が、GNR を介した THT 手順の 48-72 時間後に明らかです。処置後の腫瘍体積減少のタイムラインと規模は、マウスの系統とがんモデルによって異なると予想されます。腫瘍の減少に加えて、GNRを介したTHTの48時間以内に強力な自然免疫応答を観察し、STING-cGAS経路に関与する遺伝子の発現の増加と、B16F10および4T1モデルの両方における樹状細胞、マクロファージ、およびNK細胞のアップレギュレーションと活性化を特徴とします¹³。特に、両側性 4T1 腫瘍モデルでは、未治療の対側腫瘍への CD8⁺ T 細胞の浸潤の増加によって証明されるように、GNR 対応 THT が全身性免疫応答を誘導しました¹³。これらの発見は、直接的な細胞毒性効果とより広範な免疫調節抗がん効果の両方を引き出すこのアプローチの可能性をさらに裏付けています。

表1:放射照度ルックアップテーブル。 さまざまなレーザー電流出力設定(mA)と作動距離(cm)の放射照度値(W/cm²)を示す表。この表は、腫瘍表面を覆うために必要なビーム直径に基づいて適切なレーザー高さを決定し、1 W/cm² ± 0.2 W/cm² の目標放射照度を達成するために使用されます。緑色で強調表示された値は、1 W/cm² 付近の最適な放射照度レベルを示します。この放射照度表はLDXレーザーに固有のもので、メーカーから提供されたものです。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

図1:GNRを介したTHT手順のグラフィカルな概略図。 マウスモデルにおける皮下脇腹腫ように対する金ナノロッド介在標的温熱療法の方法論触知可能な腫瘍(約50 mm³)を確立し、マウス麻酔した後、(1)1 μg/mm³の濃度で腫瘍内にGNRを注入し、(2)腫瘍塊の真ん中に腫瘍内温度プローブを挿入し、(3)腫瘍表面にアロエベラゲルの~5 mm層を塗布し、(4)NIRレーザー投与を開始し、(5)腫瘍内部温度を穏やかな温熱範囲(42°C-48°C)に5分間維持します。略語:GNR =金ナノロッド;THT = 標的温熱療法;NIR = 近赤外線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:実験セットアップの視覚的表現。 腫瘍内温度プローブを中央に挿入し、近赤外レーザービームへの曝露の真下に局所アロエベラゲル層を塗布した異所性結腸直腸腫瘍を有するBALB/cマウス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:リアルタイムの内部温度グラフ。 NIR レーザーへの腫瘍曝露中に内部温度プローブによって記録された、時間の経過に伴う代表的な内部腫瘍温度プロファイル (ミリ秒単位)。(A)GNR注射マウスのオン/オフNIRレーザーサイクルパターンは、腫瘍内部温度を軽度の温熱範囲(42°C〜48°C)に5分間維持する必要があります。これは、処置全体を通じて低体温範囲を維持するために、腫瘍内部温度を綿密に監視し、レーザー投与を繰り返すことの重要性を強調しています。(B)5分間のNIRレーザー曝露中のGNR注入(n = 15)マウスと対照(PBS注入)マウス(n = 8)の間の腫瘍内部温度の平均差。PBS注射マウスの腫瘍は、腫瘍が42〜48°Cの高熱温度に達するGNR注射群と同じ長さのNIRレーザー照射を受けたにもかかわらず、軽度の低体温範囲に加熱されず、約39〜40°Cでプラトーになります。 略語:GNR =金ナノロッド;NIR = 近赤外線。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:GNRを介したTHT後の腫瘍体積グラフ。 GNR を介した THT は、治療後 48-72 時間以内に複数のマウスがんモデルにわたって腫瘍体積縮小を誘発します。(A) GNR 媒介 THT 後の 4T1 (乳がん) モデルにおける腫瘍体積測定 (n= 24 PBS、n = 28 THT)。(B) GNR 媒介 THT 後の B16-F10 (黒色腫) モデルにおける腫瘍体積測定 (n = 19 PBS、n = 23 THT)。(C) GNR 媒介 THT (n = 9 PBS、n = 9 THT) 後の CT26 (結腸直腸癌) モデルにおける腫瘍体積測定。治療後48〜72時間以内の腫瘍体積増大の減少または減速は、肯定的な結果を示しています。「24 時間前」の時点での CT26 モデルの腫瘍体積データはマージされず、値は類似しており、重複しています。エラーバーはSEMを表します。* p < 0.05。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ
このGNRを介したTHT技術の設計と実装は、 in vivoで固形腫瘍の標的を絞った、正確で、資源集約的で再現性のある加熱を行う能力を提供する。このシステムの主な利点は、周囲の組織に損傷を与えることなく局所的な治療を可能にする空間精度と熱制御にあります。光熱変換を成功させるための重要なステップの 1 つは、使用する GNR と NIR 光源の間の互換性を確保することです。本研究では、860nmでの吸収に最適化されたGNRを使用しました。この波長では、光は組織を効果的に透過し、GNR を含む腫瘍では熱が選択的に生成されますが、周囲の健康な組織は生理学的温度付近にとどまります²⁰。さらに、このプロトコルを実行する場合、穏やかな温熱範囲が達成され、治療が一貫して提供されていることを確認するために、腫瘍内部温度の正確なリアルタイムモニタリングが重要です。 図2に示すように、腫瘍内温度プローブを配置すると、 図3Bに示すように、腫瘍の熱線量をリアルタイムで監視できます。

手法のトラブルシューティング
in vivo モデルと腫瘍の種類によっては、結果を最適化するためにプロトコルにわずかな変更が必要になる場合があります。たとえば、図4で参照されているマウス黒色腫、結腸直腸癌、および乳癌モデルでは、GNRから腫瘍への体積濃度を1μg/^mm3に最適化しました。また、この注射と治療タイミングを0.5、1、4、18、または24時間の長い間隔と比較した場合、治療効果に違いは観察されなかったため、GNR注射の直後にNIRレーザー露光を行うことにより、このプロトコルの効率を最適化しました。腫瘍の病態生理学または身体局在の点で当社のモデルと異なる腫瘍モデルの場合、異なる時点で注射された異なる GNR 濃度が、温熱範囲を達成および/または維持するのに最適である場合があります。この手順に続いて、腫瘍体積の変化を記録するために、毎日の腫瘍体積測定を実行する必要があります。2〜3日以内の腫瘍の退縮は、治療の成功の肯定的な指標です。

レーザープロトコルの性質上、表在性皮膚の火傷や潰瘍は、特に色素沈着した皮膚や敏感肌では潜在的な危険因子となります。使用する in vivo モデルによっては、皮膚表面と腫瘍内部温度の間の適切なバランスを維持するために、レーザー電流出力の調整が必要になる場合があります。例えば、皮膚²¹、C57Bl/6マウスの水分含有量やメラニン色素の違いにより、皮膚温度を50°C以下に保つために、BALB/cマウスに比べて低電流でNIRレーザー投与が必要であることがわかりました。 レーザー電流出力を変更する場合は、レーザービームの直径で腫瘍表面の大部分を覆いながら、ターゲット放射照度を 1 W/cm² ± 0.2 W/cm² に保つように、レーザーの高さを適切に調整してください。あるいは、アロエベラジェルを追加で塗布すると、腫瘍内部の温度に大きな影響を与えることなく、処置中の皮膚温度を下げることができます。この治療の潜在的な副作用として観察されている潰瘍のリスクを最小限に抑えるためには、必要な変更によって適切な皮膚表面温度を維持することが重要です。アロエベラゲル層を変更する場合は、NIRレーザービームの投与を一時的に停止してください。レーザープロトコルの数日間は、マウスが火傷や潰瘍の可能性について注意深く監視されていることを確認してください。

GNR媒介THTの限界
この手順を実行する際に対処しなければならない主な安全上の懸念は、レーザー操作中に使用される光の波長に対して認定されたレーザー安全メガネを使用することです。レーザー システムには、偶発的な作動を防ぐために、キー付きインターロックなどの安全機能が組み込まれている必要があります。ただし、反射または散乱されたビームによる潜在的な曝露から保護するために、追加の個人用保護具、特に適切なレーザー安全メガネが必要です。目はレーザービームによる損傷に対して最も脆弱であり、網膜火傷はNIR^{レーザー22}で大きな懸念事項です。最後に、レーザーを操作するすべての担当者は適切なトレーニングを受ける必要があります。

このプロトコルは、全身注射よりも GNR の腫瘍内注射を選択して、システム毒性を最小限に抑え、肝臓、脾臓、腎臓などのオフターゲット臓器でのナノ粒子分布を制限し、温熱治療の精度、有効性、および安全性プロファイルを強化しました。ただし、このプロトコルは GNR の腫瘍内注射を必要とするため、特定の腫瘍モデルで温熱療法を誘導する能力が制限される可能性があります。これまでに、皮膚表面近くに存在し、GNR 注入と NIR 光への曝露の点で容易にアクセスできる皮下および乳腺脂肪パッド腫瘍において、この方法の有効性が証明されています。腹膜などの体腔内に存在する腫瘍を標的とする場合、または原発腫瘍の転移部位を標的にしようとする場合、ロジスティクス上の困難が生じる可能性があります。このプロトコルの潜在的な変更には、NIR曝露前に腫瘍部位に効率的に蓄積するようにナノ粒子が操作または修飾されている場合、全身GNR注入が含まれる可能性があります²³。さらに、腫瘍内 GNR 注射により腫瘍内のナノ粒子の分布が不均一になり、加熱の均一性に影響を与える可能性があります。しかし、このGNRを介したTHTプロトコルの主な結果が抗がん免疫を活性化するためのICDの誘導であることを考えると、不均一な腫瘍加熱は治療効果の程度に大きな影響を与えるとは予想されていません。最後に、腫瘍内温度の読み出しは、腫瘍内の温度プローブの位置に依存します。腫瘍の中央は、プローブが腫瘍全体の平均温度を正確に反映するのに最適な位置です。ただし、腫瘍の大きさや形状により、中央プローブの挿入を確実におよび/または確認することが困難な場合は、異なる場所で 2 つ以上の温度プローブを使用して記録する必要がある場合があります。

既存の方法に関する意義
この原稿は、固形腫瘍および表面的にアクセスできる腫瘍におけるGNR媒介THTの包括的で最適化された再現性のあるプロトコルを提供します。温熱療法を誘導する他の方法と比較して、この技術には、リソース集約的で、空間的に正確であり、全身毒性が最小限に抑えられているという明確な利点があります。光熱療法における GNR の使用は十分に文書化されていますが、これらのプロトコルがどのように実装されるかについては、文献全体で大きなばらつきが残っています。NIR照射の持続時間、熱監視ツール(熱電対プローブまたはサーマルカメラ)の選択、GNR溶液の調製、GNR注入方法などの主要な手順要素は、多くの場合、研究によって異なります。

たとえば、他の方法では、私たちと同様の結果を得るために、より長い(20分)²⁴または複数回投与(4 x 15分)²⁵のNIR曝露が必要でした。さらに、ほとんどのプロトコルは熱電対プローブまたはサーマルカメラのいずれかを使用しますが、両方のツールを組み合わせることはめったにありません^26,27。さらに、GNR溶液はCTAB28,29,30で調製されることが多く、それらの送達方法は、全身注射^24,30と腫瘍内注射³¹の間で異なり、TME内での分散/位置に影響を与える可能性があります。そのため、現在のプロトコルを最適化および改善する、GNR を介した THT の包括的で適応性のある方法はまだ確立されていません。

私たちのプロトコルは、文献から最も効果的で再現性のあるコンポーネントを単一の標準化されたアプローチに統合することにより、これらの欠点に対処します。具体的には、デュアル熱モニタリング (熱電対とサーマル カメラの両方) を使用して、正確で安全な熱供給を保証します。CTABフリーGNRの腫瘍内注射を採用して、腫瘍の局在化を最大化し、毒性を最小限に抑えます。また、表面的な皮膚の火傷から保護するために、アロエベラジェルの使用を取り入れています。さらに、このプロトコルで使用されるGNRは、860 nm NIRでの効率的な光熱変換に最適化されており、数秒以内に穏やかな温熱温度を迅速に達成できます。この温度範囲に達すると、5分間の治療期間を安定して維持することができ、免疫原性細胞死と免疫活性化を誘導するのに十分であると判断しました。860 nm の NIR 波長自体も、組織の浸透深さと安全性のバランスが取れており、この方法の治療ウィンドウがさらに強化されます。

要約すると、私たちのプロトコルは、既存のGNRを介した温熱療法アプローチに代わる統合され、検証された、生物学的に効果的な代替手段を提供し、前臨床がん研究および併用療法の開発に適した完全に詳細で適応性のある方法を提供することにより、この分野の重大なギャップを埋めます。

この技術の将来の応用
最後に、このプロトコルはさまざまながん治療と簡単に組み合わせることができますが、抗がん免疫を刺激する THT の固有の能力を考慮すると、免疫療法の有効性を高めるのに特に適しています。GNRを介したTHTは、免疫原性細胞死を誘導し、腫瘍特異的抗原の放出を促進し、治療後48時間以内にTMEに動員される自然免疫細胞の数を増やすことにより、免疫学的に冷たい腫瘍を免疫系による検出と攻撃に「再感作」するのに役立ちます¹³。その結果、この技術は、以前に耐性を発達させた可能性のあるがんの治療における免疫療法の有効性を改善するために使用でき、がん治療の障壁と疾患の進行を克服するための潜在的な戦略を提供します¹³。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200-056
10 mLストライベット	フィッシャーサイエンティフィック	7200574
15 mL ファルコンチューブ	コーニング	352095
1mLシリンジ	BDバイオサイエンス	3331431
28G針	BDバイオサイエンス	1298811
4T1乳がん細胞株	アメリカンタイプカルチャーコレクション	CRL-2539
5 mLストライペット	フィッシャーサイエンティフィック	7200573
50 mL ファルコンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-432-22
70%エタノール	業務用アルコール	36195
アロエベラジェル	ライフブランド	57800985495
B16-F10 黒色腫細胞株	アメリカンタイプカルチャーコレクション	CRL-6475
バイオレンダー	バイオレンダー	該当なし
バイセーフティキャビネット	ヌエア	該当なし
クラス4レーザー安全ゴーグル	レーザービジョン	F22です。P5P18.5000	P22フレームにP5P18フィルターを採用
CO2 インキュベーター (37 &g;C、5% CO2)	ヌエア	該当なし
コーニング 1-200 & マイクロ;L ユニバーサルフィットラックピペット ヒント	コーニング	4865
コーニングフィルターピペット チップ、30 & マイクロ;L	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-265
CT26マウス結腸直腸細胞株	アメリカンタイプカルチャーコレクション	CRL-2638
DPBSの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010-049
エッペンドルフチューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	3451
メスのBALB/cマウス	チャールズ・リバー研究所(カナダ・モントリオール)	028
メス C57Bl/6	チャールズ・リバー研究所(カナダ・モントリオール)	027
ウシ胎児血清	サーモフィッシャー サイエンティフィックインビトロジェン	12483020
GNRの	ソナナノテック株式会社	該当なし
腫瘍内温度プローブ	オメガ	HYP1-30-1/2-TG-60-SMP-M	熱電対プローブ HYP-1型
アイソチップ 1000 & マイクロ;L ユニバーサルフィルター付きピペット ヒント	コーニング	4809
LDXレーザー(モデル:LDX-3520-860-HHLFC)	ミネトロニクス	該当なし	最大設定値4600mAのレーザー電流
Optixcareアイ潤滑剤	アベンティックス	該当なし
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140148
プリズム 10.6.0	グラフパッド	該当なし
RPMI 1640 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11875119
TC-08熱電対データロガーソフトウェア	ピコテクノロジー	ピコログ v5.25.3
サーマルカメラ	ハイクマイクロ	EA-1086922
組織培養皿 100 x 20 mm	フィッシャーサイエンティフィック	877222
トリパンブルー溶液 0.4%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061
腫瘍測定キャリパー	ジャイルズサイエンティフィックミツトヨ株式会社	500-321