薬物スクリーニングのための三次元脳腫瘍スフェロイドの代謝プロファイリングの進歩

サマリー

ここでは、3次元(3D)神経膠腫スフェロイドと細胞外フラックス分析によるイメージングベースの正規化を統合した代謝プロファイリングプラットフォームを確立します。このアプローチにより、薬物治療に対する腫瘍代謝反応をより正確に評価できるようになり、耐性の潜在的なメカニズムについての洞察が得られます。

要約

脳腫瘍、特に神経膠腫は、その攻撃的な性質、複雑な腫瘍微小環境、および従来の治療法に対する耐性のため、治療が困難です。従来の二次元 (2D) 細胞培養では、真の腫瘍環境を再現できないことが多く、薬効の予測が不正確になります。細胞外フラックス分析技術は、通常、2D 培養におけるリアルタイム代謝分析に使用され、細胞外酸性化速度 (ECAR) や酸素消費速度 (OCR) などの主要な代謝パラメータを測定し、細胞代謝に関する洞察を提供します。3D モデルの使用は、生 体内 の腫瘍環境をより正確に模倣するため、大きな進歩を表しています。細胞外フラックスアナライザーは、3次元(3D)神経膠腫細胞モデルに適合し、解糖や酸化的リン酸化などの重要な代謝経路を、より生理学的に関連性の高い状況で分析することを可能にしました。

U87細胞を96ウェルの低付着プレートに適切な密度で播種し、5日間培養しました。5日目に、ハイコンテントイメージングによって3Dスフェロイド形成が観察されました。次に、正常に形成されたスフェロイドを、代謝分析のためにポリ-L-リジンでコーティングされた代謝アッセイプレートに移しました。これらの測定の精度を向上させるために、ハイコンテント イメージング システムが 3D 細胞サイズを評価し、細胞外フラックス データの正確な正規化を可能にし、細胞サイズの違いによる代謝変動を最小限に抑えます。この統合アプローチにより、薬物治療に対する神経膠腫細胞の代謝応答のより信頼性の高い分析が可能になり、薬剤耐性の潜在的なメカニズムが明らかになります。最終的に、この方法論は神経膠腫の代謝動態に関する貴重な洞察を提供し、臨床的に関連する新しい治療戦略の開発をサポートします。

概要

神経膠腫は、脳腫瘍の蔓延した攻撃的な形態であり、その急速な進行、非常に不均一な腫瘍微小環境、および従来の治療法に対する顕著な耐性のために、重大な臨床的課題を引き起こします¹。これらの複雑さにより、治療評価の精度を向上させるには、より生理学的に関連する実験モデルが必要です。従来の2次元(2D)細胞培養システムは、in vivo腫瘍の構造と細胞間相互作用を再現^{できず2、}薬効と腫瘍生物学に関して誤解を招く結論につながる^{ことがよくあります3。}

これらの制限に対処するために、3 次元 (3D) 腫瘍モデルが優れた代替手段として登場し、in vivo で腫瘍の構造的および機能的特徴を模倣することにより生物学的関連性が強化されています ^4,5。同時に、代謝リプログラミングは、神経膠腫の進行と治療抵抗性の特徴としてますます認識されています ^6,7,8。細胞外フラックス分析は、細胞外酸性化速度(ECAR、主に解糖乳酸産生によるプロトン流出の測定)や酸素消費率(OCR、酸化的リン酸化におけるミトコンドリア酸素利用の定量化)などの主要な代謝パラメータをリアルタイムで測定するために広く採用されている技術となっており、解糖および酸化リン酸化経路に関する重要な洞察を提供します9,10,11。

この研究では、細胞外フラックス分析を 3D 神経膠腫スフェロイドの分析に適応させ、 in vivo 腫瘍の状態によく似た状況での代謝経路の調査を可能にしました。U87神経膠腫細胞を、透明な丸底超低付着96ウェルプレートにウェルあたり1,500細胞の密度で播種し、スフェロイド形成を促進するために5%CO₂ で37°Cで5日間培養しました。ハイコンテントイメージングを使用して、スフェロイドの形態を確認し、細胞サイズを評価しました。代謝分析に先立ち、直径約220μmの高密度で円形の3D細胞スフェロイドを、ポリ-L-リジンでプレコートされたアッセイプレートに移し、接着性と測定の安定性を確保しました。重要なのは、スフェロイドサイズに基づく代謝データの正規化が統合されたハイコンテントイメージングによって実施され、ばらつきが減り、データの信頼性が向上したことです。

3D 培養、細胞外フラックス分析技術、イメージングベースの正規化を組み合わせたこの統合プラットフォームにより、治療介入に対する神経膠腫の代謝反応をより正確に評価できます。この研究は、薬剤耐性の代謝基盤を研究するための堅牢な枠組みを提供し、神経膠腫のより効果的で臨床的に翻訳可能な治療戦略の開発に貢献します。

プロトコル

注:すべての試薬と消耗品の完全な仕様は、 材料表に詳述されています。

1. 2D細胞培養

1. U87細胞を、無菌条件下で10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)を添加した最小必須培地(MEM)に維持します。細胞が80%のコンフルエンスに達したら、標準的な継代手順を実行します。
   注:培養プロセス全体を通じて、細胞の状態を注意深く監視し、異常な増殖または形態学的変化を示す細胞を後続の実験から除外します。
2. U87細胞を10 cmの細胞培養皿に播種し、5%(v/v)CO₂ 、相対湿度90〜95%の37°Cの滅菌細胞培養インキュベーターでインキュベートします。
   注:最適な増殖条件を維持するために、培地は定期的に交換する必要があります。

2. 3D細胞スフェロイド形成

1. 実験準備
   1. 実験手順を開始する前に、 図 1 のワークフロー全体を確認してください。
      注意: 細胞の健康を確保し、汚染を防ぐために、実験全体を通して無菌技術を厳守してください。
2. 細胞解離と計数
   1. 使用済み培地を細胞培養皿から取り出し、U87細胞を9 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(洗浄ごとに3 mL)で3回洗浄します。使用済みの試薬を20〜25%(v / v)の漂白剤溶液に廃棄して、すべての生理活性物質を不活化します。
   2. 1 mLのトリプシン溶液を皿に加え、37°Cで2〜3分間インキュベートします。顕微鏡観察下ですべての細胞が剥離されたら、37°Cに予熱した10%FBSを含む2 mLのDMEMでトリプシンを中和します。
   3. 細胞懸濁液を15 mL遠心分離管に移し、200 × g で3分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを10%FBSを添加した1mLのDMEMに再懸濁します。細胞を穏やかにピペットで移動して、均一な細胞懸濁液を確保します。次に、血球計算盤または自動細胞計数器を介してカウントし、最初の細胞数を記録します。
      注:機械的損傷を避けるために、洗浄および培地の追加中はセルを慎重に扱ってください。ピペッティング力を制御して、細胞の生存率や計数精度に影響を与える可能性のある気泡の形成を防ぐことができます。
3. 細胞懸濁液希釈
   1. 未使用の培地を37°Cに予熱します。 細胞懸濁液を室温(RT;25±2°C)で30分間維持します。
   2. 初期細胞数に基づいて、細胞懸濁液を10%FBSを含むDMEMで最終容量20mLに希釈し、約200,000個の細胞を確保します。
      注:最終希釈の前に、沈降を防ぐために細胞懸濁液を静かにピペットで移動します。未使用の培地を37°Cに維持し、細胞懸濁液をRTでインキュベートした。ウェルあたり1,500個の細胞を含む96個のウェルを播種した場合、過剰分を考慮して総容量22 mLを調製しました。希釈した細胞懸濁液を50mLの滅菌遠心分離管に移し、完全に混合した。
4. 超低付着96ウェルプレートでの細胞播種
   1. 最終細胞懸濁液を200 μLピペットで完全に混合します。200 μLの懸濁液(1,500細胞/ウェル)を、透明な丸底超低付着96ウェルプレートの各ウェルに端に沿ってゆっくりと加えます。
      注:効率を高めるために、マルチチャンネルピペットの使用を検討してください。
   2. 汚染を防ぐために、すべてのウェルが満たされた後、残りの懸濁液を廃棄します。
5. 遠心分離
   1. 遠心分離中の漏れを防ぐために、プレートをパラフィルムでしっかりと密封します。混合物を200× g で2分間遠心分離し、各ウェルの底にある細胞をペレット化します。
   2. プレートを遠心分離機から取り出し、パラフィルムを慎重に取り除き、プレートを37°C、5%CO₂ インキュベーターに入れます。

3. 代謝アッセイプレートのポリ-D-リジンコーティング

注:代謝アッセイマイクロプレートは、細胞外フラックス分析中の細胞スフェロイド接着用に設計された特殊なマイクロプレートです。

1. 50 mLの滅菌水に5 mgのポリ-D-リジンを溶解してコーティング溶液を調製します。よく混ぜます。
2. 代謝アッセイプレートの各ウェルに30 μLのコーティング溶液を加えます。余分な溶液を軽く振ったり吸引したりして、気泡がないことを確認します。
3. プレートをインキュベートし、RTで20分間覆います。コーティング溶液を吸引し、ウェルを200 μLの滅菌水で2回洗浄します。
4. プレートを少なくとも30分間自然乾燥させた後、CO₂ を含まない37°Cで30分間加熱してコーティングを安定させます。
5. 各ウェルに175 μLの予熱培地を加え、細胞スフェロイド移送の準備が整うまで、プレートを_CO2フリーインキュベーターで37°Cに保ちます。

4. スフェロイド成長のモニタリング

1. 5日間の培養後、スフェロイドプレートをハイコンテントイメージングシステムに移します。
2. 構成イメージングパラメータ:温度を37°C、CO₂ を5%に設定し、プレートの種類、チャンネル、焦点範囲を調整します。
3. 10倍の対物レンズとイメージングソフトウェアを備えた共焦点顕微鏡を介してスフェロイド画像を取得します。
4. 無傷のスフェロイドを含むウェル(図2A-Cなど)を特定し、移送する位置を記録します。不規則な回転楕円体を持つウェルを除外します(例:図2D)。

5.スフェロイド処理

注:代謝反応を評価するために、成熟した3Dスフェロイドに対して薬物治療を実施しました。

1. スフェロイドグループの割り当て
   1. 無傷の回転楕円体を2つのグループに割り当てます。
      対照群:6つの複製ウェル
      治療群: 6 つの複製ウェル (フェノフィブラート治療)
2. 薬液調製
   1. フェノフィブラート作業溶液を、新鮮な予熱培地中で最適な濃度(例:100 μM)で調製します。
      注:処理群を100%DMSOで再構成してストック溶液を作成し、その後、新鮮な予熱培地で希釈しました。対照群には、薬物処理されたサンプルに存在するのと同じ最終濃度のDMSO(0.1%v / v)が投与されました。最終濃度は用量反応アッセイによって決定されました。
3. 中程度の交換
   1. 各ウェルから100 μLの培地を壁に沿ってゆっくりと吸引します。
      注:スフェロイドの乱れを防ぐために、ウェルの底に接触しないようにしてください。
   2. 100 μLの新鮮な培地をコントロールウェルに加えます。
   3. 100 μLのフェノフィブラート作業溶液を処理ウェルに加えます。
4. 処理後のインキュベーション
   1. プレートを5%CO₂ インキュベーターで37°Cに静かに戻します。72時間培養。
5. 形態学的評価
   1. ステップ4のイメージング手順に続いて、スフェロイドの完全性を評価します。

6.細胞スフェロイドの移動

1. スフェロイドを含む低付着プレートをイメージングシステムから慎重に取り外し、バイオセーフティキャビネット内の無菌面に置きます。poly-L-lysineでコーティングされたアッセイプレートを互いに隣り合わせに配置して移送します。
2. 20 μLピペットの先端をトリミングして、損傷することなく細胞スフェロイドを穏やかに吸引できるようにします。
3. ウェルの底から各無傷のスフェロイドを穏やかに吸引し、セルプレートの対応するウェルに移し、20秒間沈降させます。10×顕微鏡下で浮遊破片がないことによる接着性を確認します。
4. すべてのスフェロイドについて繰り返し、手順4で説明したイメージングシステムを介して転写効率を確認します。

7. 代謝アッセイ

1. サンプル脱気
   1. 薬物処理されたスフェロイドアッセイプレートを、CO₂を含まない事前平衡化された37°Cの水和チャンバーに入れます。
      注:代謝測定精度を確保するために、厳格な環境管理下で1時間連続脱気を行いました。
2. 試薬調製と薬物投与
   1. 試薬を並行して調製し、1時間の脱気期間中に薬剤をロードします。
      注:この実験の主な目的は、ミトコンドリアストレスを評価することです。すべての手順は、この目標に細心の注意を払って調整する必要があります。データの正確性と信頼性を保証するために、異なる実験タイプに対して特定のプロトコルに従う必要があります。
   2. 薬の調製:次の化合物を使用してください。
      オリゴマイシン(ミトコンドリア複合体V阻害剤)
      シアン化カルボニル-4(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP、アンカプラー)
      ロテノン(複合体I阻害剤)と抗マイシンA(複合体III阻害剤)の混合物
      注: 薬物は、この研究で使用されたミトコンドリア ストレス テスト キットから入手されました。一部の化合物はバイオハザードです。厳格なバイオセーフティプロトコル(個人用保護具と緊急時への備え)を使用する必要があります。
   3. 製剤
      1. 表1に示すように、粉末薬物の原液を調製します。
      2. 原液を 表2に指定された使用濃度に希釈します。
         注:溶液は、濃度勾配全体で均一性を確保するために、完全にボルテックスまたは撹拌されます。
3. 検出プローブカートリッジへの化合物のロード
   注:検出プローブカートリッジは、酸素とpHをリアルタイムで測定するためのバイオセンサープローブを含む使い捨てカートリッジです。
   1. プローブカートリッジの起動(コンパウンドの装填に先行する必要があります):
      注意: 使用の少なくとも12時間前にこれらの手順を完了して、センサーが作動するようにしてください。
      1. 200 μLの校正溶液を水和プレートの各ウェルに加えます。
      2. 検出プローブカートリッジをハイドレーションプレートに慎重に配置し、すべてのプローブが校正液に完全に浸されるようにします。
      3. 組み立てたユニットを37°CのCO₂フリーインキュベーターで12〜24時間インキュベートし、センサーを活性化します。
         注:不完全な浸漬または不十分な水分補給は、測定ドリフト(±15%OCR誤差)を引き起こします。
   2. マルチチャンネルまたは電動ピペットを使用して、ウェルの端に液滴が残らないように、正確な量をウェルに供給します。
      注:急性薬物刺激は必要ないため、標準的な負荷シーケンスに従ってください。
   3. 輸送中の妨害を防ぐために、積み込み後はプローブプレートを安定した表面に置きます。
      注:読み込み精度は結果に大きく影響します。
4. ソフトウェア構成
   1. ソフトウェアを起動し、ミトコンドリアストレステストアッセイプロトコルを選択します。
   2. 事前定義された実験グループに従ってグループを割り当てます。
   3. ファイル名を設定し、[実行の開始] をクリックします。
5. 検出プローブカートリッジの校正
   1. システムプロンプトに従って、ロードされたプローブプレートを装置スロットにそっと挿入します。
   2. キャリブレーションを開始します(15〜20分)。安定した状態を維持します。振動を避けてください。
   3. キャリブレーション後すぐにハイドレーションプレートを取り外します(画面上の指示に従って)。
      メモ:校正する前にプレートの蓋を取り外してください。
6. 3Dスフェロイドの代謝プロファイリング
   1. 脱気した3Dスフェロイドアッセイプレートを装置の測定スロットに移します。以下を確認して、プローブアレイとの正確な位置合わせを確保します。(i) プレートコーナーマッチスロットガイド。(ii) 井戸 A1 がインデックス位置に位置合わせされます。(iii) プレートと器具表面の間に目に見える隙間がない
   2. [ 開始 ]をクリックして、ミトコンドリアストレスアッセイを開始します(所要時間:~1.5時間)。機器のパラメータを全体的に監視します。
      注:測定前に3Dスフェロイドアッセイプレートの蓋を取り外してください。
7. データ分析
   1. 画像解析
      1. 3Dスフェロイドアッセイプレートをハイコンテントイメージングシステムに移します。
         注:画像は、手順4で説明したように取得されました。イメージングにより、 図3に示すように、スフェロイドの大部分は無傷のままでしたが、少数のスフェロイドは移動プロセス中に損傷を受けたことが明らかになりました。
      2. ステップ7.7.1.3-7.7.1.7に従って、Harmonyソフトウェアバージョン5.2を介して細胞スフェロイドの形態学的データ(面積、長さ、幅など)を分析します。
      3. テ クスチャ領域 モジュールを大まかに適用して、画像内のオブジェクトのテクスチャ特徴に基づいて画像コンテンツを 3 つのクラスターに分割することで、3D スフェロイドを背景から分離します。
      4. Find Image Region モジュールを適用して、体積ベースのサイズ特性を介して事前に分離された3Dスフェロイドの分離を微調整し、不純物を除去し、無傷のスフェロイドを保持します。
      5. Morphology Propertiesモジュールを介して3Dスフェロイドの形態学的パラメータを測定します。
      6. Select Population モジュールを適用して、最終的に本物の3D細胞スフェロイドを除外します。
      7. 表3に示すように、形態学データの結果をエクスポートします。
   2. データ処理
      注:実験アーティファクトを最小限に抑えるために、イメージング出力からのパラメータを介して細胞データを正規化します。
      1. 分析ソフトウェアを介して生の代謝データを開きます。
      2. 正規 化オプション を選択して、正規化モードの編集インターフェイスにアクセスします。
      3. アッセイプレートの対応する各ウェルに含まれるスフェロイドの断面積を 「正規化値 」フィールドに入力します。
      4. スケール係数パラメーターを 1,000,000 に設定します。
      5. [ 適用] ボタンをクリックして、正規化プロセスを完了します。最終結果を 図4に示します。

8. 廃棄物処理

1. すべての実験廃棄物(培地、試薬、消耗品、細胞懸濁液)は、バイオハザードおよび実験室廃棄物管理プロトコルに従って処分してください。環境汚染を防ぐために、廃棄前に生物活性廃棄物をオートクレーブまたは化学的に消毒します。

結果

3D細胞スフェロイドのエネルギー代謝検出プロセスにおいて最も重要な3つのステップは、3D細胞スフェロイドの培養、スフェロイド転移プロセス、検出後のスフェロイドのイメージングと定量化です(図1)。さらに、細胞スフェロイドの状態を観察することは非常に重要です。上記の実験手順に従って実験を行うと、^5日目 にスフェロイドが検出され(図2)、スフェロイドは平均面積約50,000μm²まで成長しました(表3)。細胞スフェロイドの成長時間を延長したい場合は、7〜10日に延長することができます。代謝アッセイプレートの底部領域によって制限されるため、検出される細胞スフェロイドは大きすぎてはいけません。細胞スフェロイドを移す過程で、スフェロイドが適切かつ正確に捕捉されないと、スフェロイドの損失も発生し、実験結果に影響を与えます。したがって、実験後、細胞外フラックス測定値を校正し、実験結果の信頼性を確保するために、ハイコンテント分析(図3

ディスカッション

細胞外フラックス分析を 3D 神経膠腫モデルに適応させることは、腫瘍細胞代謝の研究における重要な方法論的進歩を表しています。従来の2D培養は長い間、 in vitro 実験の基礎として機能してきましたが、空間構造、細胞間および細胞間および細胞-マトリックスの相互作用、 およびin vivo 腫瘍に特徴的な酸素と栄養素の勾配を捉えることができません¹²。これらの特徴は、代謝リプログラミングが腫瘍の進行と治療抵抗性に重要な役割を果たす神経膠腫に特に関連します¹³。

細胞外フラックス分析を 3D 培養に適用する際の注目すべき課題は、代謝パラメーターの正確な正規化です。2D単層とは対照的に、3Dスフェロイドは細胞数、サイズ、および形状の点で大きな変動性を示し、補正しないとECARおよびOCRデータの解釈に重大な誤差をもたらす可能性があります14,...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cm皿	コーニング	430167
15 mL遠心分離管	コーニング	430791
50 mL遠心分離管	コーニング	430828
カルセイン、AM	インビトロゲン	C1430
伯爵夫人3	サーモフィッシャー		自動セルカウンター
ウシ胎児血清	ギブコ	A5669701
ハーモニー 5.2	パーキンエルマー		イメージングソフトウェア
ヘクスト 33342	ソーラービオ	C0031
MEM EBSS媒体	ハイクローン	SH30024.01
オペレッタCLS	パーキンエルマー		ハイコンテント画像解析システム
PBSの	ハイクローン	SH30256.01
Poly-D臭化水素酸リジン	シグマ	P7280
丸底超低付着96ウェルプレート	コーニング	4515
Seahorse Waveデスクトップソフトウェア	アジレント
タツノオトシゴXFe96	アジレント		体外代謝試験機
ソルバルST8R	サーモフィッシャー		遠心機
トリプシン 0.25% EDTA	ギブコ	25200072
U87MG細胞株	細胞資源の国家インフラ
XF 1.0 M グルコース溶液、50 mL	アジレント	103577-100
XF 100 mM ピルビン酸溶液、50 mL	アジレント	103578-100
XF 200 mM グルタミン溶液、50 mL	アジレント	103579-100
XF 校正液 500 mL	アジレント	100840-000
XF細胞水戸ストレステストキット	アジレント	103015-100
XF DMEM 培地、pH 7.4、500 mL	アジレント	103575-100
XFe96/XF Pro Fluxpak検出プローブアレイ	アジレント	103792-100
XFe96/XF Pro Fluxpak-メタボリックアッセイプレート	アジレント	103792-100