サイトカイン処理歯周靭帯幹細胞における歯周炎に関連する候補バイオマーカーのバイオインフォマティクス同定

サマリー

本研究は、サイトカイン処理された歯周靭帯幹細胞におけるバイオインフォマティクス解析を通じて調節不全遺伝子を探ることを目的としています。これらの細胞では、上位調節されたERC2-IT1およびダウンレギュレーションされたEPB41L4A-AS1が重要な分子として同定され、歯周炎に関連する可能性のある候補バイオマーカーとして機能する可能性があります。

要約

本研究の主な目的は、サイトカイン誘導性歯周靭帯幹細胞(PDLSC)の潜在的な分子メカニズムを調査することでした。GSE260558データセットのマイクロアレイデータは遺伝子発現オムニバス(GEO)データベースから取得されました。正規化後、調節不全の遺伝子が特定されました。次に、異なる発現したmRNA(DE-mRNA)に対して遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析が行われました。その後、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークに基づいてハブ遺伝子をスクリーニングしました。最後に、ENCORIのウェブサイトを利用して、ハブ遺伝子を含む競合的な内因性RNA(ceRNA)調節ネットワークが確立されました。Rプログラミング言語のlimmaパッケージを用いて、合計739種類の異なる発現lncRNA(DE-lncRNA)と809種類の異なる発現mRNA(DE-mRNA)が同定されました。その後、GOおよびKEGG解析により、DE-mRNAがサイトカイン処理PDLSCにおける炎症および細胞外マトリックス形成と密接に関連していることが示されました。DE-mRNA向けにタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを構築し、度合いを評価してハブ遺伝子を得ました。合計で12のアップレギュレーションされたハブ遺伝子と12のダウンレギュレーションされたハブ遺伝子がスクリーニングされました。これらのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされたハブ遺伝子は、それぞれceRNA調節ネットワークを構築するために用いられました。これらのネットワークでは、上位化されたERC2-IT1とダウンレギュレーションされたEPB41L4A-AS1が歯周炎の重要なlncRNAと考えられていました。結論として、バイオインフォマティクス解析により、サイトカイン誘導PDLSCの進行に関与する複数の主要遺伝子とceRNA調節ネットワークが明らかになりました。本研究では歯周炎に関連する複数の候補バイオマーカーが特定されましたが、動物モデルや臨床サンプルでのさらなる実験的検証が必要です。

概要

世界保健機関(WHO)によると、歯周炎は人間の中で6番目に多く、遍在し、かつ不可逆的な慢性炎症性疾患として認識されています^1,2。現代において、世界人口の約15%に影響を及ぼしています^1,2,3。歯周炎は年齢、性別、口腔衛生習慣、喫煙状況、民族、低い社会経済的地位、そして全身性疾患の範囲(^2,3,4,5)など、さまざまな要因と強く相関していることが報告されています。歯周炎は高齢者に顕著に高い有病率を持ち、歯に付着する歯肉下微生物叢の不均衡変化によって病理的に引き起こ^{されます。}治療せずに放置すると、最終的に骨の破壊、歯の動き、そして不幸な歯の喪失へとつながります⁸.したがって、歯周炎の分子メカニズムの包括的な理解と、この疾患の診断マーカーの特定が緊急に求められています。

歯周組織の構造的かつ相互作用の複雑さは、歯周再生の過程で直面する大きな困難に寄与する重要な要因の一つと広く認識されています ^9,10。歯周再生のために用いられる多様な間葉質幹細胞(MSC)の中で、歯周靭帯幹細胞(PDLSCs)は生体内環境における新たなセメント質様構造形成において非常に信頼性の高い供給源であることが十分に示されています^11,12。最近実施された前臨床研究では、PDLSCsを用いた治療法が組織再生の分野で非常に有望な結果を示している^13,14。患者の歯肉組織と比較して、PDLSCのトランスクリプトミクス解析では、より強い機能的指向性と治療的転換の可能性が示されました^13,14。

バイオインフォマティクス技術およびバイオインフォマティクス解析手法は、研究者がプロテオミクス、ゲノム、メタボロム統計と関連する可能性のある生物学的プロセスや関連を特定する力を得ます。^15,16。さらに、バイオインフォマティクス技術のハイスループット特性により、次世代シーケンシングやマイクロアレイ実験など、大規模な生物学的データセットの解析も可能に^{しています。}この能力により、疾患診断や予後のための潜在的なバイオマーカーの特定が可能になります^19,20。例えば、歯周炎患者の歯肉組織において、ディスインテグリンおよびメタロプロテナーゼ28(ADAM28)およびディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼドメイン(ADAMTSL3は、バイオインフォマティ^{クス技術に基づく}包括的な解析により、歯周炎患者の歯肉組織において新規バイオマーカーとして同定されました。さらに、核受容体共アクティベーター4(NCOA4)、溶質キャリアトランスポーター1A5(SLC1A5)、熱ショックタンパク質B1(HSPB1)など、フェロトーシス関連遺伝子の方が歯周炎²²においてより良い診断価値を持つと報告されています。しかし、歯周炎の分子メカニズムはさらなる調査に値します。本研究では、バイオインフォマティクス技術を活用してサイトカイン誘導PDLSCのハブ遺伝子を調査し、歯周炎に関連する生物学的プロセスや経路の特定を目指しています。サイトカイン処理PDLSCのバイオインフォマティクス解析は、PDLSC機能障害に関連する炎症駆動の転写プログラムを捉え、PDLSC機能障害と歯周炎の間のギャップを埋めます。これらのサイトカイン誘導PDLSCのコア遺伝子と経路は、歯周炎の統一メカニズムに関する貴重な洞察を提供します。

プロトコル

1. データセット

この分析は公開データを使用し、機関およびJoVEの倫理ガイドラインに準拠した、人間や動物の被験者を含まなかった。使用されたプラットフォームに関するすべての情報は 、材料表に記載されています。

1. バイオインフォマティクス解析のために、GSE260558データセット(国立バイオテクノロジー情報発現オムニバス、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558)から合計6つのサンプル(GSM8119437、GSM8119438、GSM8119439、GSM8119440、GSM8119441、GSM8119442)を選択します。
2. これらのサンプルでは、歯周靭帯幹細胞(PDLSCs)を正常培地または炎症性サイトカインを含む培地で7日間培養します。
3. PDLSCから全RNAを抽出し、高スループットシーケンスにかけます。バイオインフォマティクス解析のプロセスは図1に示されています。

2. DEGの識別

1. ^前述のLimmaソフトウェア(バージョン:3.46.0)を用いてlncRNAおよびmRNAの発現プロファイルを解析します。
2. サイトカイン群と正常群のペアワイズ比較を行う。
3. 標準カットオフ<0.05の誤発見率(FDR)補正を用いて、有意に発現に差をつける遺伝子を特定します。調整p値(FDR)を用いて、統計的に有意な結果の中で偽陽性の割合を制御します。
4. 調整済みP値カットオフ<0.05、折りたたみ変化閾値を>1として、著しく調節不全のlncRNAまたはmRNAを特定します。
5. Rソフトウェア(バージョン4.0.4)で生成された火山プロット(ggplot2: バージョン3.4.1)における差異遺伝子発現を示します。
6. 表に上位10の調節不全のlncRNAおよびmRNAを一覧に示します。

3. 機能的濃縮解析

1. DAVIDオンラインデータベース(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/)を用いてDE-mRNAのGO濃縮解析を行います。
   1. 調節不全遺伝子をウェブサイトに提出し、分子機能(MF)、生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)などのGO用語を選択してGO解析を行います。
   2. 調節不全の遺伝子をCytoscape(バージョン:3.8.2)プラグインのClueGO [16]+およびCluepediaアプリに提出してください。
   3. 複数比較に対してベンジャミニ・ホッホバーグ補正を適用し、有意性閾値を調整後P値<0.05に設定します。
   4. Cytoscapeから結果をダウンロードしてください。P値に基づいて濃縮物を降順にランク付けし、各カテゴリーの上位5つの濃縮物を提示します。
2. 京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)は、生物システム(http://www.genome.jp/kegg/)の高レベルの機能と影響を理解するための貴重なデータベース資源です。
   1. 同様に、ウェブサイトでKEGG-PATHWAYを選択してKEGG分析を行います。
   2. 有意の閾値を調整後P値<0.05に設定し、本研究における上位10の濃縮を提示します。報告された研究に基づいてこれらの濃縮分析を行う ^25,26。

4. PPIネットワーク

1. 相互作用遺伝子検索ツール(STRING、バージョン12.0)を用いて、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークを予測・構築します。
2. PPIネットワークを構築するために、318個のアップレギュレーションmRNAまたは465個のダウンレギュレーションmRNAをSTRINGウェブサイトに提出してください。
3. PPIネットワークから相互作用データをエクスポートし、Cytoscapeソフトウェアにデータを提出します。
4. PPIネットワーク内で個々のノードを非表示にしてください。本研究に含まれるPPIネットワークをダウンロードしてください。
5. CytoscapeのプラグインであるCentiScaPeアプリを使って、次数分布を含むネットワークのトポロジー的特性を計算します。
6. 各遺伝子の局所位相を隣接遺伝子の数を合計して定量化し、与えられたノードの相互作用をカウントします。
7. PPIネットワークのすべての遺伝子を結合度に基づいて降順にランク付けします。
8. このランキングリストから、上位12個のアップレギュレーション遺伝子とトップ12のダウンレギュレーション遺伝子をハブ遺伝子として選択します。

5. miRNA-mRNA調節ネットワーク

注:ENCORIデータベース(バージョン12.0、https://rnasysu.com/encori/)は、マイクロRNA(miRNA)とDE-lncRNA(またはハブ遺伝子)間の調節関連を予測するために使用されました。

1. アップレギュレーションされたハブ遺伝子またはダウンレギュレーションされたハブ遺伝子をENCORIに提出し、予測解析のためにPITA、RNA22、miRmap、miRanda、PicTar、TargetScanを含む合計6つのプログラムのカットオフ基準プログラム≥5を設定します。
2. 予測されたmiRNAをダウンロードし、ENCORIに提出して潜在的なlncRNAを取得します。
3. 予測されたlncRAをダウンロードし、ステップ5.2から 図2の間に重複するlncRNAを特定します。
4. ハブ遺伝子、セクション5.1で得られたmiRNA、ステップ5.3で得られたlncRNAをCytoscapeソフトウェア(バージョン3.4.0)に提出し、ceRNAネットワークを構築します。

結果

DEGの識別
Limma RソフトウェアはlncRNAおよびmRNAの差異発現プロファイル解析に用いられました。両群間の差異は非ペアt検定によって決定されました。火山図(図2)に示すように、合計739種類の異なる発現したlncRNA(DE-lncRNA、p値<0.05、|log2FC|>1)が同定されました。これらのDE-lncRNAのうち、サイトカイン群では正常群と比べて340のアップレギュレーションlncRNAと399基のダウンレギュレーションlncRNAが確認されました。さらに、合計809種類の異なる発現mRNA(DE-mRNA、p値<0.05、|log2FC|>1)が同定されました。これらのDE-mRNAのうち、正常群と比較してサイトカイン群で334のアップレギュレーションmRNAと475のダウンレギュレーションmRNAが同定されました(図3A–B

ディスカッション

歯周靭帯幹細胞(PDLSC)は、歯周炎の進行および回復期の両方で歯周損傷を抑制する重要な役割を果たす重要な細胞と考えられ^{ています。}炎症状態下での潜伏がPDLSCs^の老化を著しく加速させる可能性があることは、かなり多くの証拠が明確に示^{しています。}しかし、炎症性潜伏に反応した細胞老化現象とそれが細胞機能障害に寄与する要因については、さらなる詳細な調査と探究が必要であることに注目に値します。11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
R	R統計計算財団	4.0.4	統計計算のためのコアオープンソース環境。以降のすべての解析の基盤となります。通常はRStudioと併用されます。
リマ	バイオコンダクター・コミュニティ(リード開発:ウォルター&エリザ・ホール研究所)	3.46.0	マイクロアレイおよびRNA-seq. の微分発現解析専用パッケージ;
サイトスケープ	サイトスケープ・コンソーシアム	3.8.2	ネットワーク可視化のためのオープンソースプラットフォーム。別途インストールが必要;App Store経由でClueGOやcytoHubbaなどのプラグインをサポートしています。
ストリング	ヨーロッパ分子生物学研究所	12	予測および既知のタンパク質間相互作用(PPI)に関する世界最大のデータベース。ウェブまたはCytoscapeプラグイン経由でアクセス;信頼スコアを提供します。
エンコリ	中山大学	3	ceRNAネットワーク(miRNA-mRNA-lncRNA)に焦点を当てた公開データベース。