この研究では、バイオインフォマティクス分析と実験的検証を使用して、虚血性脳卒中において競合内因性 RNA (ceRNA) として機能する長いノンコーディング RNA (lncRNA) の調節的役割と根底にあるメカニズムを体系的に調査しました。
方法論記事
この研究では、バイオインフォマティクス分析と実験的検証を使用して、虚血性脳卒中において競合内因性 RNA (ceRNA) として機能する長いノンコーディング RNA (lncRNA) の調節的役割と根底にあるメカニズムを体系的に調査しました。
この研究は、虚血性脳卒中において ceRNA として作用する lncRNA の調節的役割と根底にあるメカニズムを調査することを目的としています。ceRNA仮説に基づいて、lncRNA、miRNA、およびmRNAは、脳卒中に関与する調節ネットワークの構成要素として同定されました。得られたサブネットワークから主要なlncRNAが詳細な分析のために選択されました。遺伝子オントロジーを用いた機能濃縮解析と京都遺伝子ゲノム百科事典による経路マッピングにより、lncRNA関連ceRNAネットワーク内の重要な相互作用が明らかになりました。カルシウムシグナル伝達、ギャップ結合シグナル伝達、神経活性リガンド受容体相互作用などの主要な経路は、ウェスタンブロット分析を使用してさらに検証されました。構築されたceRNAネットワークは、334のlncRNA、miRNA、およびmRNAで構成され、機能濃縮分析によりそれらの生物学的役割が予測されました。代表的なceRNAサブネットワークを構築するために、中心性が高い3つのlncRNAが選択されました。ウェスタンブロット分析により、偽グループと比較して、主要なタンパク質(CaMKII、カルモジュリン、CX36、PKC、CX43、GRIA3、GABRA6、およびNPY1R)の発現レベルがモデル群で有意にダウンレギュレートされ、CaNの発現は有意にアップレギュレートされたことが明らかになりました(P < 0.05)。これらの発見は、lncRNAが脳卒中の病因に大きく関与していることを示唆しています。結論として、ceRNA として作用する lncRNA は、虚血性脳卒中の病因において重要な調節的役割を果たします。
虚血性脳卒中は、一般的な神経障害であり、永久的な脳損傷、長期障害、または死につながります 1,2,3,4。マイクロRNA(miRNAまたはmiR)、長いノンコーディングRNA(lncRNA)、およびメッセンジャーRNA(mRNA)は、RNAを介した調節ネットワークを形成します5,6,7,8。これらの分子は、さまざまな複雑なメカニズムを通じて細胞機能を調節します 9,10 虚血性脳卒中の病態生理学への寄与者としてますます認識されています。しかし、この状態との関連性が高まっているにもかかわらず、これらのノンコーディング RNA の正確な役割は不明のままです。虚血性脳卒中の根底にある分子メカニズムを明らかにするには、新しいノンコーディングRNAのさらなる研究が不可欠です。
LncRNAは、さまざまな病的状態の開始と進行中に遺伝子発現の重要な調節因子として機能します。競合する内因性RNA(ceRNA)として機能するlncRNAは、miRNAに結合して特定の調節効果を発揮します11。Weiらは、lncRNA AK038897がmiR-26a-5pを標的とすることによってceRNAとして作用し、それによって死関連プロテインキナーゼ1(DAPK1)を調節して脳虚血再灌流障害を悪化させることを報告しています12。研究によると、長いノンコーディング RNA SNHG1 (lncRNA SNHG1) は、miR-18a との相互作用を通じて HIF-1α/VEGF シグナル伝達経路を調節することにより、脳血管疾患を調節する ceRNA として機能することが示されています13。追加の研究は、長いノンコーディングRNA母体発現遺伝子3(lncRNA MEG3)がmiR-21 / PDCD4シグナル伝達カスケードを介してニューロンのアポトーシスを調節することを示しています14。ハイスループットシーケンシングやマイクロアレイ解析により、多数のlncRNA、miRNA、mRNAが同定されていますが、脳卒中におけるこれらの分子の機能は不明なままであり、RNAを介した調節ネットワークの体系的な確立が急務となっています。
したがって、本研究では、以前に収集したデータを用いて、ceRNA仮説に基づく包括的なlncRNA-miRNA-mRNAネットワークを構築し、遺伝子オントロジー(GO)と京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮を通じて選択されたceRNAサブネットワークを解析し、lncRNAの機能をより深く理解することを目的としています。この結果は、いくつかのlncRNAがceRNAとして機能し、特定のmiRNAとその標的mRNAを調節する可能性があることを明らかにする可能性があります。GO の濃縮は、細胞発生、シグナル伝達、細胞周期調節などの重要な生物学的プロセスを強調する可能性がありますが、経路の濃縮は、脳卒中関連経路、免疫応答、代謝への関与を明らかにする可能性があります。これらの発見は、多様な細胞プロセスと疾患メカニズムにおける lncRNA の潜在的な役割を浮き彫りにする可能性があります。
虚血性脳卒中研究における既存のceRNAネットワーク解析法に比べて、関連研究との比較によって裏付けられるように、いくつかの重要な改善点が提供されています。まず、ネットワーク構築と機能経路検証を組み合わせることにより、多層検証を統合します。公開トランスクリプトームデータを使用した免疫関連ceRNAネットワークのバイオインフォマティクスプロファイリングに主に焦点を当てているLiら15とは異なり、334のlncRNA、miRNA、およびmRNAで構成されるceRNAネットワークを構築し、ウェスタンブロット分析を通じて重要なシグナル伝達経路(カルシウムシグナル伝達、ギャップジャンクションシグナル伝達、および神経活性リガンド-受容体相互作用)を検証し、Fanらに見られるようにインシリコ予測への過度の依存の限界に対処します16、circRNA関連ceRNAネットワークを構築するが、下流経路の実験的検証が欠けており、モデル群と偽群の両方でタンパク質発現(CaMKII、CX36、GRIA3など)を定量化することにより、予測されたネットワークの機能的関連性を確認します。トポロジカルの重要性が高いコア lncRNA に焦点を当て、所見の特異性を高めます。3つのlncRNA、2つのmiRNA、および24のmRNAでlncRNA-miRNA-mRNA ceRNAネットワークを構築するが、主要な調節因子を優先しないChengら17とは異なり、代表的なサブネットワークを構築するために高度な中心性を持つ3つのlncRNAを特定し、メカニズムの洞察が最も影響力のあるノードに固定され、Liらで説明されているようなより広範で焦点が絞られていないネットワークと比較して解釈可能性が向上します18、62 個の lncRNA が含まれていますが、ターゲットを絞ったサブネットワーク分析が欠けています。再現性を向上させるための詳細な実験パラメータを提供する:脳組織から抽出した500 ng〜1 μgのトータルRNA(グループあたり6匹のラット:20のMCAOモデルと20の偽操作対照)をライブラリ調製に使用し、品質を確保するためにRNA完全性番号(RIN)>8.0、circRNAバイオマーカーを検証するがRNA入力仕様を省略するWang et al.19では詳細が指定されていません。雄のSPF SDラット(220±30 g)を広く使用されているモデルであるMCAOで使用するが、その限界を明示的に指摘し、Liらで強調されているように、ヒト虚血性脳卒中の血管の複雑さや免疫応答を完全に再現しない--そして、梗塞の重症度を標準化するために、神経学的スコア(1-3)によってラットを層別化することによってこれを緩和する。研究の限界を認識する:ceRNAネットワークは翻訳後修飾を捉えることができない可能性があり、ウェスタンブロット検証のサンプルサイズ(グループあたりn = 6)は拡大される可能性があり、将来的にはこれらのギャップに対処するためのより大きなコホートとプロテオミクス分析を含む研究があります。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
動物実験は安徽中医薬大学実験倫理委員会(ライセンス番号:AHUCM-rats-2024006)によって承認され、施設のガイドラインとJoVEの動物使用基準に従って実施されました。この研究では、40 匹の雄の SPF グレードの SD ラット (220 g ± 30 g) を使用しました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。
1. 実験動物
2. ラットにおける中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの誘導
3. RNAハイスループットシーケンシング
4. 長鎖ノンコーディングRNA、マイクロRNA、メッセンジャーRNAの差次発現解析
5. 異次発現マイクロRNAの長鎖ノンコーディングRNAおよびメッセンジャーRNA標的の予測
6. 長いノンコーディングRNA-マイクロRNA-メッセンジャーRNA調節ネットワークの構築
7. 機能強化分析
8. lncRNA - ceRNA関連経路に関与する主要なタンパク質の発現レベルを検出するためのウェスタンブロット分析
9. 統計分析
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ラットモデルの各グループの成功率検証実験結果を 図1に示します。モデリング後、ラットで神経機能スコアリングを実施しました(図1A)。モデル群は重度の神経障害を示し、スコアが1〜3のモデル群はその後の実験に含まれました。 図1B とCはTTC染色結果を示しており、赤は正常な脳組織を表し、白は梗塞領域を示します。モデル群は重度の脳梗塞を示した。これらの発見は、虚血モデルの確立が成功したことを確認し、その後の実験での使用を検証します。edgeRを用いた差次発現解析により、MCAO群で920個のDEMと710個のDELが明らかになりました。さらに、16のmiRNAが異常な発現パターンを示しました。
LncRNAは、miRNAに競合的に結合することにより、ceRNAとして作用することができます。全体として、16個のmiRNAと121個のlncRNAを含む717個のlncRNA-miR相互作用ペアが同定されました(<...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
脳卒中の病因の根底にある分子メカニズムを調査し、潜在的な診断および治療標的を特定するために、MCAO後のラットの脳組織に対してRNA-Seqおよび低分子RNA-Seq(sRNA-Seq)分析を実施しました。この研究は主に、lncRNA、miRNA、およびmRNAが関与する複雑な調節ネットワークを調査することを目的としています。MCAO誘導ラット脳組織のRNA-SeqおよびsRNA-Seqデータセットを網羅的に解析し、lncRNA-miRNA-mRNA調節ネットワークを解明しました。lncRNA、miRNA、およびmRNA間の調節関係を説明するために広範なネットワーク相互作用が構築され、それによって脳卒中の病因の根底にあるRNAを介したメカニズムの理解が進みました。ceRNAネットワークの解析により、「白血球接着」、「インテグリン介在細胞接着の調節」、「コラーゲン線維組織化」、「インテグリン介在細胞接着」、「虚血性脳卒中後のシグナル伝達のカルシウム依存性正調節」、「異球細胞間接着」、「単球走化性」などの生体プロセスに関連する344のタンパク質コード遺伝子が明らかになりまし...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者らは、競合する利益は存在しないと述べている。
この原稿は、安徽省学術リーダー予備候補者資金提供プロジェクト(No.2022H287)、安徽省衛生研究重点プロジェクト(参照:AHWJ2022a013)、安徽省大学自然科学研究重点プロジェクト(NO.2023AH050745)、および安徽省衛生衛生優秀人材プロジェクト(NO.ahsjhmypygc20230074)の支援を受けました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2%(w/v)TTC染色液 | 北京康楽クローンバイオテクノロジー株式会社 | 20230805 | TTC染色 |
| 4%(w / v)パラホルムアルデヒド溶液 | ビヨタイム | P0099 | 固定脳組織 |
| 40 オスの SPF グレード SD ラット | Hagzhou Ziyuan 実験動物繁殖有限公司 | SCXK [zhe] 2024-0004 | 実験動物用 |
| 5%脱脂粉乳 | 科学的物理学 | PH1519 | WBの |
| アガロース電気泳動システム | 北京六義バイオテクノロジー株式会社 | DYCP-44P | WBの |
| 自動露光装置 | 上海培清科技有限公司 | JS-M6P | WBの |
| 自動露出計 | 上海培清科技有限公司 | JS-M6P | WBの |
| 自動製氷機 | 常熟市雪科電化有限公司 | IMS-20 | WBの |
| カルモジュリン | 親近感 | 49B2443 | WBの |
| カムキイ | 親近感 | 14G0796 | WBの |
| 遠心機 | 海門麒麟バイアー機器製造有限公司 | LX300 | WBの |
| clusterProfiler パッケージ | 生体伝導体 | clusterProfiler_4.17 | エンリッチメント分析 |
| CX36 | ゼンビオ | N24AP24 | WBの |
| CX43 | ゼンビオ | M08NO01 | WBの |
| ECL超高感度化学発光キット | バイオシャープ | BL520B型 | WBの |
| 電気サーモスタット空気乾燥オーブン | 上海三発科学機器有限公司 | DHG-9070 | WBの |
| 電気泳動装置 | Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (タノン) | EPS300 | WBの |
| 電気泳動装置 | 上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社 | EPS300 | WBの |
| 電気泳動タンク | 上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社 | VE-180 | WBの |
| ガブラ6 | 親近感 | 46V5371 | WBの |
| ヤギ抗マウスIgG | Zs-BIOの | 142637 | WBの |
| ヤギ抗ウサギ IgG | Zs-BIOの | 139931 | WBの |
| グリア3 | 親近感 | 0C33051 | WBの |
| 高速冷凍遠心分離機 | 安徽嘉文計器設備有限公司 | JW-3021HR型 | WBの |
| HiSeq 2500システム | イルミナ | / | RNAハイスループットシーケンシング |
| ImageJソフトウェア | 国立衛生研究所 | 画像J 1.54k | TTC染色 |
| 磁気加熱撹拌機 | 常州市と楽器工場 | JJ-79-1 | WBの |
| マイクロピペット | ドイツ エッペンドルフ | / | WBの |
| 常温マイクロ遠心分離機 | 海門 Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300 | LX300 | WBの |
| NPY1R型 | 親近感 | 2D38248 | WBの |
| ピペット | エッペンドルフ | 0.5-10ul | WBの |
| PKCの | 親近感 | 17E3745 | WBの |
| 染色済みタンパク質マーカー | バイオシャープ | BL712C | WBの |
| PVDF用メンブレン | ミリポール | IPVH00010 | WBの |
| Ribo-Zero rRNA除去キット | イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国 | / | RNA抽出 |
| RIPAライセート | バイオシャープ | BL504A型 | WBの |
| ペントバルビタールナトリウム | 北京シンクファーテクノロジー株式会社 | メルク | 麻酔剤 |
| トランスファーメンブレン器具 | 上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社 | VE-186 | WBの |
| 膜貫通装置 | Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (タノン) | VE-186 | WBの |
| &β;-アクチン | Zs-BIOの | 19AW0505 | WBの |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト
許可をリクエスト