方法論記事

lncRNA,miRNA,およびmRNA発現に基づく中大脳動脈閉塞ラットにおける競合する内因性RNAネットワークの解析

666 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/68876

⸱

2025年10月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

この記事について

サマリー

この研究では、バイオインフォマティクス分析と実験的検証を使用して、虚血性脳卒中において競合内因性 RNA (ceRNA) として機能する長いノンコーディング RNA (lncRNA) の調節的役割と根底にあるメカニズムを体系的に調査しました。

要約

この研究は、虚血性脳卒中において ceRNA として作用する lncRNA の調節的役割と根底にあるメカニズムを調査することを目的としています。ceRNA仮説に基づいて、lncRNA、miRNA、およびmRNAは、脳卒中に関与する調節ネットワークの構成要素として同定されました。得られたサブネットワークから主要なlncRNAが詳細な分析のために選択されました。遺伝子オントロジーを用いた機能濃縮解析と京都遺伝子ゲノム百科事典による経路マッピングにより、lncRNA関連ceRNAネットワーク内の重要な相互作用が明らかになりました。カルシウムシグナル伝達、ギャップ結合シグナル伝達、神経活性リガンド受容体相互作用などの主要な経路は、ウェスタンブロット分析を使用してさらに検証されました。構築されたceRNAネットワークは、334のlncRNA、miRNA、およびmRNAで構成され、機能濃縮分析によりそれらの生物学的役割が予測されました。代表的なceRNAサブネットワークを構築するために、中心性が高い3つのlncRNAが選択されました。ウェスタンブロット分析により、偽グループと比較して、主要なタンパク質(CaMKII、カルモジュリン、CX36、PKC、CX43、GRIA3、GABRA6、およびNPY1R)の発現レベルがモデル群で有意にダウンレギュレートされ、CaNの発現は有意にアップレギュレートされたことが明らかになりました(P < 0.05)。これらの発見は、lncRNAが脳卒中の病因に大きく関与していることを示唆しています。結論として、ceRNA として作用する lncRNA は、虚血性脳卒中の病因において重要な調節的役割を果たします。

概要

虚血性脳卒中は、一般的な神経障害であり、永久的な脳損傷、長期障害、または死につながります 1,2,3,4。マイクロRNA(miRNAまたはmiR)、長いノンコーディングRNA(lncRNA)、およびメッセンジャーRNA(mRNA)は、RNAを介した調節ネットワークを形成します5,6,7,8。これらの分子は、さまざまな複雑なメカニズムを通じて細胞機能を調節します 9,10 虚血性脳卒中の病態生理学への寄与者としてますます認識されています。しかし、この状態との関連性が高まっているにもかかわらず、これらのノンコーディング RNA の正確な役割は不明のままです。虚血性脳卒中の根底にある分子メカニズムを明らかにするには、新しいノンコーディングRNAのさ....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

動物実験は安徽中医薬大学実験倫理委員会(ライセンス番号:AHUCM-rats-2024006)によって承認され、施設のガイドラインとJoVEの動物使用基準に従って実施されました。この研究では、40 匹の雄の SPF グレードの SD ラット (220 g ± 30 g) を使用しました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 実験動物

  1. 動物実験センターに標準的な実験条件で動物を収容します。12時間の明暗サイクルを維持し、寝具を毎日交換し、食べ物と水を自由に入手できるようにします。
  2. 実験の最後に、腹腔内注射 を介して 150 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを投与して深い麻酔状態を誘導することにより、動物を安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従って)。足を挟むことに対する反射的反応がないことで深い麻酔を確認し、呼吸を監視してバイタルサインが完全に失われていることを確認し、その後斬首を進めます。

2. ラットにおける中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの誘導

  1. 1% ペントバルビタール ナトリウムを 40 mg/kg

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

ラットモデルの各グループの成功率検証実験結果を 図1に示します。モデリング後、ラットで神経機能スコアリングを実施しました(図1A)。モデル群は重度の神経障害を示し、スコアが1〜3のモデル群はその後の実験に含まれました。 図1B とCはTTC染色結果を示しており、赤は正常な脳組織を表し、白は梗塞領域を示します。モデル群は重度の脳梗塞を示した。これらの発見は、虚血モデルの確立が成功したことを確認し、その後の実験での使用を検証します。edgeRを用いた差次発現解析により、MCAO群で920個のDEMと710個のDELが明らかになりました。さらに、16のmiRNAが異常な発現パターンを示しました。

LncRNAは、miRNAに競合的に結合することにより、ceRNAとして作用することができます。全体として、16個のmiRNAと121個のlncRNAを含む717個のlncRNA-miR相互作用ペアが同定されました(<.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

脳卒中の病因の根底にある分子メカニズムを調査し、潜在的な診断および治療標的を特定するために、MCAO後のラットの脳組織に対してRNA-Seqおよび低分子RNA-Seq(sRNA-Seq)分析を実施しました。この研究は主に、lncRNA、miRNA、およびmRNAが関与する複雑な調節ネットワークを調査することを目的としています。MCAO誘導ラット脳組織のRNA-SeqおよびsRNA-Seqデータセットを網羅的に解析し、lncRNA-miRNA-mRNA調節ネットワークを解明しました。lncRNA、miRNA、およびmRNA間の調節関係を説明するために広範なネットワーク相互作用が構築され、それによって脳卒中の病因の根底にあるRNAを介したメカニズムの理解が進みました。ceRNAネットワークの解析により、「白血球接着」、「インテグリン介在細胞接着の調節」、「コラーゲン線維組織化」、「インテグリン介在細胞接着」、「虚血性脳卒中後のシグナル伝達のカルシウム依存性正調節」、「異球細胞間接着」、「単球走化性」などの生体プロセスに関連する344のタンパク質コード遺伝子が明らかになりまし.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する利益は存在しないと述べている。

謝辞

この原稿は、安徽省学術リーダー予備候補者資金提供プロジェクト(No.2022H287)、安徽省衛生研究重点プロジェクト(参照:AHWJ2022a013)、安徽省大学自然科学研究重点プロジェクト(NO.2023AH050745)、および安徽省衛生衛生優秀人材プロジェクト(NO.ahsjhmypygc20230074)の支援を受けました。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2%(w/v)TTC染色液北京康楽クローンバイオテクノロジー株式会社 20230805TTC染色
4%(w / v)パラホルムアルデヒド溶液ビヨタイムP0099固定脳組織
40 オスの SPF グレード SD ラットHagzhou Ziyuan 実験動物繁殖有限公司SCXK [zhe] 2024-0004実験動物用
5%脱脂粉乳科学的物理学PH1519WBの
アガロース電気泳動システム北京六義バイオテクノロジー株式会社DYCP-44PWBの
自動露光装置上海培清科技有限公司JS-M6PWBの
自動露出計上海培清科技有限公司JS-M6PWBの
自動製氷機常熟市雪科電化有限公司IMS-20WBの
カルモジュリン親近感49B2443WBの
カムキイ親近感14G0796WBの
遠心機海門麒麟バイアー機器製造有限公司LX300WBの
clusterProfiler パッケージ生体伝導体clusterProfiler_4.17エンリッチメント分析
CX36ゼンビオN24AP24WBの
CX43ゼンビオM08NO01WBの
ECL超高感度化学発光キットバイオシャープBL520B型WBの
電気サーモスタット空気乾燥オーブン上海三発科学機器有限公司DHG-9070WBの
電気泳動装置Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (タノン)EPS300WBの
電気泳動装置上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社EPS300WBの
電気泳動タンク上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社VE-180WBの
ガブラ6親近感46V5371WBの
ヤギ抗マウスIgGZs-BIOの142637WBの
ヤギ抗ウサギ IgGZs-BIOの139931WBの
グリア3親近感0C33051WBの
高速冷凍遠心分離機安徽嘉文計器設備有限公司JW-3021HR型WBの
HiSeq 2500システムイルミナ/RNAハイスループットシーケンシング
ImageJソフトウェア国立衛生研究所画像J 1.54kTTC染色
磁気加熱撹拌機常州市と楽器工場JJ-79-1WBの
マイクロピペットドイツ エッペンドルフ/WBの
常温マイクロ遠心分離機海門 Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WBの
NPY1R型親近感2D38248WBの
ピペットエッペンドルフ0.5-10ulWBの
PKCの親近感17E3745WBの
染色済みタンパク質マーカーバイオシャープBL712CWBの
PVDF用メンブレンミリポールIPVH00010WBの
Ribo-Zero rRNA除去キットイルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国/RNA抽出
RIPAライセートバイオシャープBL504A型WBの
ペントバルビタールナトリウム北京シンクファーテクノロジー株式会社メルク麻酔剤
トランスファーメンブレン器具上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社VE-186WBの
膜貫通装置Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (タノン)VE-186WBの
&β;-アクチンZs-BIOの19AW0505WBの

参考文献

  1. Marquez-Ortiz, R. A., et al. Neuroimmune support of neuronal regeneration and neuroplasticity following cerebral ischemia in juvenile mice. Brain Sci. 13 (9), 1337(2023).
  2. Han, M., Ma, B., She, R., Xing, Y., Li, X.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

lncRNAmiRNAceRNA

関連記事