方法論記事

lncRNA,miRNA,およびmRNA発現に基づく中大脳動脈閉塞ラットにおける競合する内因性RNAネットワークの解析

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DOI：

10.3791/68876

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2025年10月7日

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1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

この記事について

サマリー

この研究では、バイオインフォマティクス分析と実験的検証を使用して、虚血性脳卒中において競合内因性 RNA (ceRNA) として機能する長いノンコーディング RNA (lncRNA) の調節的役割と根底にあるメカニズムを体系的に調査しました。

要約

この研究は、虚血性脳卒中において ceRNA として作用する lncRNA の調節的役割と根底にあるメカニズムを調査することを目的としています。ceRNA仮説に基づいて、lncRNA、miRNA、およびmRNAは、脳卒中に関与する調節ネットワークの構成要素として同定されました。得られたサブネットワークから主要なlncRNAが詳細な分析のために選択されました。遺伝子オントロジーを用いた機能濃縮解析と京都遺伝子ゲノム百科事典による経路マッピングにより、lncRNA関連ceRNAネットワーク内の重要な相互作用が明らかになりました。カルシウムシグナル伝達、ギャップ結合シグナル伝達、神経活性リガンド受容体相互作用などの主要な経路は、ウェスタンブロット分析を使用してさらに検証されました。構築されたceRNAネットワークは、334のlncRNA、miRNA、およびmRNAで構成され、機能濃縮分析によりそれらの生物学的役割が予測されました。代表的なceRNAサブネットワークを構築するために、中心性が高い3つのlncRNAが選択されました。ウェスタンブロット分析により、偽グループと比較して、主要なタンパク質(CaMKII、カルモジュリン、CX36、PKC、CX43、GRIA3、GABRA6、およびNPY1R)の発現レベルがモデル群で有意にダウンレギュレートされ、CaNの発現は有意にアップレギュレートされたことが明らかになりました(P < 0.05)。これらの発見は、lncRNAが脳卒中の病因に大きく関与していることを示唆しています。結論として、ceRNA として作用する lncRNA は、虚血性脳卒中の病因において重要な調節的役割を果たします。

概要

虚血性脳卒中は、一般的な神経障害であり、永久的な脳損傷、長期障害、または死につながります 1,2,3,4。マイクロRNA(miRNAまたはmiR)、長いノンコーディングRNA(lncRNA)、およびメッセンジャーRNA(mRNA)は、RNAを介した調節ネットワークを形成します5,6,7,8。これらの分子は、さまざまな複雑なメカニズムを通じて細胞機能を調節します 9,10 虚血性脳卒中の病態生理学への寄与者としてますます認識されています。しかし、この状態との関連性が高まっているにもかかわらず、これらのノンコーディング RNA の正確な役割は不明のままです。虚血性脳卒中の根底にある分子メカニズムを明らかにするには、新しいノンコーディングRNAのさらなる研究が不可欠です。

LncRNAは、さまざまな病的状態の開始と進行中に遺伝子発現の重要な調節因子として機能します。競合する内因性RNA(ceRNA)として機能するlncRNAは、miRNAに結合して特定の調節効果を発揮します11。Weiらは、lncRNA AK038897がmiR-26a-5pを標的とすることによってceRNAとして作用し、それによって死関連プロテインキナーゼ1(DAPK1)を調節して脳虚血再灌流障害を悪化させることを報告しています12。研究によると、長いノンコーディング RNA SNHG1 (lncRNA SNHG1) は、miR-18a との相互作用を通じて HIF-1α/VEGF シグナル伝達経路を調節することにより、脳血管疾患を調節する ceRNA として機能することが示されています13。追加の研究は、長いノンコーディングRNA母体発現遺伝子3(lncRNA MEG3)がmiR-21 / PDCD4シグナル伝達カスケードを介してニューロンのアポトーシスを調節することを示しています14。ハイスループットシーケンシングやマイクロアレイ解析により、多数のlncRNA、miRNA、mRNAが同定されていますが、脳卒中におけるこれらの分子の機能は不明なままであり、RNAを介した調節ネットワークの体系的な確立が急務となっています。

したがって、本研究では、以前に収集したデータを用いて、ceRNA仮説に基づく包括的なlncRNA-miRNA-mRNAネットワークを構築し、遺伝子オントロジー(GO)と京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮を通じて選択されたceRNAサブネットワークを解析し、lncRNAの機能をより深く理解することを目的としています。この結果は、いくつかのlncRNAがceRNAとして機能し、特定のmiRNAとその標的mRNAを調節する可能性があることを明らかにする可能性があります。GO の濃縮は、細胞発生、シグナル伝達、細胞周期調節などの重要な生物学的プロセスを強調する可能性がありますが、経路の濃縮は、脳卒中関連経路、免疫応答、代謝への関与を明らかにする可能性があります。これらの発見は、多様な細胞プロセスと疾患メカニズムにおける lncRNA の潜在的な役割を浮き彫りにする可能性があります。

虚血性脳卒中研究における既存のceRNAネットワーク解析法に比べて、関連研究との比較によって裏付けられるように、いくつかの重要な改善点が提供されています。まず、ネットワーク構築と機能経路検証を組み合わせることにより、多層検証を統合します。公開トランスクリプトームデータを使用した免疫関連ceRNAネットワークのバイオインフォマティクスプロファイリングに主に焦点を当てているLiら15とは異なり、334のlncRNA、miRNA、およびmRNAで構成されるceRNAネットワークを構築し、ウェスタンブロット分析を通じて重要なシグナル伝達経路(カルシウムシグナル伝達、ギャップジャンクションシグナル伝達、および神経活性リガンド-受容体相互作用)を検証し、Fanらに見られるようにインシリコ予測への過度の依存の限界に対処します16、circRNA関連ceRNAネットワークを構築するが、下流経路の実験的検証が欠けており、モデル群と偽群の両方でタンパク質発現(CaMKII、CX36、GRIA3など)を定量化することにより、予測されたネットワークの機能的関連性を確認します。トポロジカルの重要性が高いコア lncRNA に焦点を当て、所見の特異性を高めます。3つのlncRNA、2つのmiRNA、および24のmRNAでlncRNA-miRNA-mRNA ceRNAネットワークを構築するが、主要な調節因子を優先しないChengら17とは異なり、代表的なサブネットワークを構築するために高度な中心性を持つ3つのlncRNAを特定し、メカニズムの洞察が最も影響力のあるノードに固定され、Liらで説明されているようなより広範で焦点が絞られていないネットワークと比較して解釈可能性が向上します18、62 個の lncRNA が含まれていますが、ターゲットを絞ったサブネットワーク分析が欠けています。再現性を向上させるための詳細な実験パラメータを提供する:脳組織から抽出した500 ng〜1 μgのトータルRNA(グループあたり6匹のラット:20のMCAOモデルと20の偽操作対照)をライブラリ調製に使用し、品質を確保するためにRNA完全性番号(RIN)>8.0、circRNAバイオマーカーを検証するがRNA入力仕様を省略するWang et al.19では詳細が指定されていません。雄のSPF SDラット(220±30 g)を広く使用されているモデルであるMCAOで使用するが、その限界を明示的に指摘し、Liらで強調されているように、ヒト虚血性脳卒中の血管の複雑さや免疫応答を完全に再現しない--そして、梗塞の重症度を標準化するために、神経学的スコア(1-3)によってラットを層別化することによってこれを緩和する。研究の限界を認識する:ceRNAネットワークは翻訳後修飾を捉えることができない可能性があり、ウェスタンブロット検証のサンプルサイズ(グループあたりn = 6)は拡大される可能性があり、将来的にはこれらのギャップに対処するためのより大きなコホートとプロテオミクス分析を含む研究があります。

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プロトコル

動物実験は安徽中医薬大学実験倫理委員会(ライセンス番号:AHUCM-rats-2024006)によって承認され、施設のガイドラインとJoVEの動物使用基準に従って実施されました。この研究では、40 匹の雄の SPF グレードの SD ラット (220 g ± 30 g) を使用しました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 実験動物

  1. 動物実験センターに標準的な実験条件で動物を収容します。12時間の明暗サイクルを維持し、寝具を毎日交換し、食べ物と水を自由に入手できるようにします。
  2. 実験の最後に、腹腔内注射 を介して 150 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを投与して深い麻酔状態を誘導することにより、動物を安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従って)。足を挟むことに対する反射的反応がないことで深い麻酔を確認し、呼吸を監視してバイタルサインが完全に失われていることを確認し、その後斬首を進めます。

2. ラットにおける中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの誘導

  1. 1% ペントバルビタール ナトリウムを 40 mg/kg20 の用量で腹腔内注射することにより麻酔を誘発します (施設で承認されたプロトコルに従って)。つま先のピンチと角膜反射を使用して麻酔の深さを評価します。
    1. 処置中、呼吸と心拍数を継続的に監視します。目の保護のために麻酔導入直後に滅菌鉱物油ベースの眼軟膏を塗布します21.
  2. 完全に麻酔したら、正中線の首を切開し、右総頸動脈 (CCA)、内頸動脈 (ICA)、および外頸動脈 (ECA) を慎重に露出させます。直接視覚化下で、適切な顕微手術器具 (鉗子やはさみなど) を使用して周囲の結合組織を優しく分離し、各動脈を完全に露出させます。
    1. 動脈を露出させた後、外科用縫合糸を使用してECAとCCAを結紮します。しっかりとした手術用結び目を結び、血流を遮断し、その後の処置中の出血を最小限に抑えます。適切な張力を確保して、縫合糸挿入のための安定したフィールドを作成します。
    2. 眼科用ハサミを使用してECAとICAの分岐部に小さな切開を行い、縫合糸の挿入を準備します。丸みを帯びた(ボール型)端の先端から直径0.25mm、長さ18mmのナイロン縫合糸を選択します。ECA-ICA接合部の切開部位に縫合糸を挿入し、ICAに沿って約18.5mm±0.5mmの深さまでゆっくりと進めて中大脳動脈を閉塞し、限局性脳虚血を誘発します。
    3. 挿入したナイロン縫合糸を外科用縫合糸を使用して周囲の組織または血管に固定し、変位を防ぎます。MCAOを2時間維持した後、虚血/再灌流障害を誘発します。細い外科用鉗子を使用してナイロン縫合糸をそっとつかみ、約5 mmゆっくりと引き抜き、脳血流を部分的に回復させ、再灌流障害を誘発します。偽グループでは、糸塞栓を挿入せずに頸動脈のみを結紮します22。
  3. MCAOモデルの確立に成功してから1週間後、ラットを深く麻酔します。足をつまんでも反応がなくなったら、すぐに首を切って脳を採取します。脳組織を生理食塩水ですすぎ、凍結保存のために-80°Cの冷蔵庫に保管します23。
  4. 神経機能スコア
    1. Longa スコアリング法を使用して神経機能を評価し、MCAO モデル24 の成功を判断します。再灌流後 24 時間で、各ラットの神経学的機能を評価し、次の基準に基づいてスコアを割り当てます。スコア 0: 観察可能な神経学的欠損なし。スコア 1: テールサスペンション中の左前肢の屈曲、前肢が完全に伸びていない。スコア 2: テールサスペンション中の左前肢の屈曲で、平らな面に置いた場合、患側 (左側) の抵抗が著しく減少します。スコア 3: スコア 2 と同じですが、クロール中に旋回または不随意の回転動作が追加されています。スコア 4: 24 時間以内の意識喪失または死亡。
      注: スコアが高いほど、行動障害が重度が高く、神経障害が大きいことを示します。
  5. 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)染色を使用した脳梗塞容積の計算
    1. 冠状面に沿って各 ex vivo ラットの脳を同じ厚さの5つのスライスに分割します。各スライスの厚さが正確に 2.0 mm ± 0.1 mm であることを確認します。切片を新たに調製した2%(w / v)TTC染色溶液に完全に浸します。
      1. 溶液を光から保護するために染色容器をアルミホイルで包み、サンプルを37°C±0.5°Cの恒温インキュベーターで30分間インキュベートします。染色後、正常な脳組織にローズレッド染色が観察されますが、虚血性梗塞領域はデヒドロゲナーゼ活性の喪失により染色されていない(白)ままです。
    2. TTC染色した脳スライスを4%(w / v)パラホルムアルデヒド溶液に移し、4°Cで24時間固定して組織形態を維持します。固定後、高解像度イメージングシステムを使用してスライスのデジタル画像をキャプチャします。固定後24時間にデータを記録し、アーカイブします。
    3. ImageJソフトウェアを使用して、TTC染色後の各ラットグループの梗塞体積と総脳組織体積を定量化します。次の式25 を使用して、補正された梗塞体積の割合を計算します。
      補正梗塞体積 (%) = {[総病変体積 − (左半球体積 − 右半球体積)] / 右半球体積} × 100%。
    4. GraphPad Prismソフトウェアを使用して、対応のないt検定を介して補正された梗塞体積を視覚化し、統計的に分析します。統計的有意性を P < 0.05 と定義します。

3. RNAハイスループットシーケンシング

  1. 各グループの3匹のラットから脳組織を選択します。製造元の指示に従って、Ribo-Zero rRNA除去キットを使用して、全RNAサンプルからリボソームRNA(rRNA)を除去します。
    1. 標準プロトコルに従って、TruSeq RNA Library Prep Kitを使用して相補的DNA(cDNA)ライブラリーを構築します。精製されたcDNAライブラリーをクラスター生成とシーケンシングに使用します。
  2. 新しく構築されたライブラリに依存せずに、この研究のすべてのシーケンシングライブラリとデータセットを提供した以前に生成されたコアデータ26を使用します。現在の作業は、新しいRNA-seqライブラリーやシーケンシングデータを生成せずに、これらの既存のデータセットの統合融合解析に集中します。
    1. 以前の研究に対する関連する機関倫理委員会からの承認を確認します。ハイスループットシーケンシングを実施して、MCAOを持つラットのmiRNA発現プロファイルを体系的に評価し、前述のように標準化されたプロトコルに準拠します27。
      注:RNAシーケンシングライブラリーの品質管理データは、 補足ファイル1に記載されています。

4. 長鎖ノンコーディングRNA、マイクロRNA、メッセンジャーRNAの差次発現解析

  1. 必要に応じて、Ensembl(https://www.ensembl.org/index.html)、miRBase(https://www.mirbase.org/)、およびNONCODE(http://www.noncode.org/)からタンパク質コード遺伝子、miRNA、およびlncRNAのアノテーションを取得します28,29,30。StringTie31(https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)を使用して遺伝子発現を定量します。
    1. StringTieアセンブラーを使用して、各サンプルからアライメントされたリードをトランスクリプトームにアセンブルします。StringTie マージモジュールを使用して、すべてのサンプルからのトランスクリプトームアセンブリを統合し、コホート全体で一貫したトランスクリプトの統一されたセットを生成します。このマージされたトランスクリプトームを使用して、転写産物の存在量を推定します32。
    2. トリム平均M値(TMM)正規化を適用し、各転写産物33,34の100万マッピングリードあたりの転写産物キロベースあたりのフラグメント数(FPKM)を計算することにより、タンパク質コード遺伝子とlncRNAの定量化を実行します。
  2. edgeRパッケージ(https://bioconductor.org/)を使用して差次発現解析を行い、MCAO群と対照群の間で差次的に発現するlncRNA(DEL)、miRNA(DEMis)、およびmRNA(DEM)を同定します。フィルター処理された生のカウント行列を edgeR DGEList オブジェクトに変換します。共通の分散を推定し、各遺伝子またはmiRNAに同じ分散値を割り当てます。
    1. 正確な検定を実行して、グループ間の遺伝子発現を比較します。差次的に発現する遺伝子35ごとに、log2倍の変化(log2FC)、100万当たりのログ数(logCPM)、P値、および偽発見率(FDR)調整P値を取得します。統計的有意性を P < 0.05 として定義し、倍数変化しきい値は |log2(FC)|> 1.

5. 異次発現マイクロRNAの長鎖ノンコーディングRNAおよびメッセンジャーRNA標的の予測

  1. 適切なデータベースから DEMis と DEL のシーケンスを取得します。miRNA-lncRNA相互作用予測ツールmiRanda36およびRNAhybrid37を使用して、DEMisとDELの間の潜在的な相互作用を特定します。miRWalk 3.0データベース(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38からmiRNA-mRNA相互作用ペアを取得する

6. 長いノンコーディングRNA-マイクロRNA-メッセンジャーRNA調節ネットワークの構築

  1. ceRNA仮説39,40に基づいてlncRNA-miRNA-mRNA調節ネットワークを構築します。
    1. DELとDEMの間のピアソン相関係数(PCC)を計算します。PCCが0.99 でP が0.01>場合、さらなる分析のためにlncRNA-mRNAペア<選択します。
    2. 共発現したlncRNA-mRNAペアごとに、両方の転写産物を標的とする共有miRNAを同定します。これらの共有miRNAを使用して、miRNA-mRNA-lncRNA共発現ネットワークを構築します。
    3. Cytoscape(https://cytoscape.org/)を使用して、lncRNA-miRNA-mRNA相互作用ネットワーク41,42を構築し、視覚化します。次の手順を実行します:
      1. CytoNCAプラグインを使用して、各ノードの中間中心性(BC)、近接性中心性(CC)、および度中心性(DC)を計算します。
      2. 中心性スコアが3つの指標すべての中央値を超える遺伝子を選択して、最終的なキーサブネットワークを構築します。
      3. CytoHubbaプラグインを使用して、タンパク質間相互作用ネットワークの上位10個のハブ遺伝子を同定し、ステップ2で同定した主要なノードを抽出します。
      4. ceRNAネットワークの各コンポーネントのノード次数を計算します。

7. 機能強化分析

  1. GOおよびKEGG経路濃縮解析を実行して、RNA機能をさらに調査します43。clusterProfiler パッケージ (https://bioconductor.org/) を使用して、エンリッチ結果を視覚化します44.

8. lncRNA - ceRNA関連経路に関与する主要なタンパク質の発現レベルを検出するためのウェスタンブロット分析

  1. 深い麻酔下で、脳全体をすばやく取り除きます。髄膜と血管を慎重に除去した後、ラットの梗塞領域の皮質組織を分離します45。細いハサミを使用して組織を細かく切り、各部分の重さが 50 mg から 100 mg になるようにします。計量された組織サンプルを予冷した均質化チューブに移します。
    1. PMSFとRIPA溶解バッファーの体積比1:100(最終濃度1 mM PMSF)でタンパク質溶解バッファーを調製します。溶解バッファーを組織20mgあたり200 μLの比率で添加します。組織が細かく分解されるまで、加熱滅菌されたガラスホモジナイザーを使用してサンプルを完全に均質化します。
    2. ホモジネートを氷上で30分間インキュベートし、10分ごとに穏やかに攪拌して完全な溶解を促進します。サンプルを28,656.6 × g で4°Cで15分間遠心分離します。 ペレットを乱すことなく、総タンパク質を含む上清を慎重に吸引します。
  2. 5×ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ローディングバッファーを1:4の比率でタンパク質サンプルに加えます(5×バッファー1容量とタンパク質サンプル4容量)。希釈後、SDS-PAGEローディングバッファーの最終作業濃度は1×です。
    1. よく混ぜて沸騰したお湯浴で10分間加熱し、タンパク質を完全に変性させます。サンプルを室温まで冷まします。各サンプル30 μgをSDS-PAGEゲルウェルにロードします。
    2. 電気泳動を2段階で行います:80 Vを30分間適用してスタッキングゲルを通してタンパク質を分離し、次に120 Vに1時間増やして分離ゲル内のタンパク質を分離します。
  3. ゲルのサイズに合わせて、事前にカットされたろ紙とポリ二フッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンを準備します。PVDFメンブレンをメタノールに3分間浸して活性化します。PVDFメンブレンとろ紙の両方を転写バッファーに5分間浸します。
    1. 転写サンドイッチを次の順序(上から下)で組み立てます:陽極板、3層のろ紙、PVDF膜、ゲル、3層のろ紙、陰極板。ゲル、メンブレン、濾紙の層が適切に位置合わせされていることを確認します。均一な移送を確保するために、各ステップですべての気泡を取り除きます。
  4. タンパク質転写直後に、PVDFメンブレンをウェスタン洗浄バッファーで5分間すすぎ、残留転写バッファーを除去します。5%脱脂粉乳を含むウェスタンブロッキングバッファーで穏やかに振とうしながら室温で2時間メンブレンをブロックするか、リン酸化タンパク質を検出する場合は5%BSAを使用します。
  5. ブロッキング後、メンブレンを一次抗体(1:1000)とともに4°Cで一晩インキュベートし、穏やかに振とうします。翌日、メンブレンを二次抗体(1:10,000)とともに室温で2時間インキュベートします。
  6. 光の干渉を防ぐために、暗い部屋で化学発光検出を実行します。PVDFメンブレンのタンパク質側を自動イメージングシステムの露光プレートの中央に平らに置きます。
    1. 使用直前に、清潔な遠心分離管内で同量のECL試薬AとECL試薬Bを混合してください。混合したECL溶液を膜表面に均一に塗布して、発光反応を開始します。
    2. 室温で1〜2分間インキュベートした後、膜表面を乱さずに余分な液体を穏やかに除去します。発光強度に応じてイメージングシステムの露光パラメータを調整し、信号キャプチャを最適化します。

9. 統計分析

  1. ImageJソフトウェアを使用してウェスタンブロット結果を解析し、バンドグレー値を定量化します。GraphPad Prism を使用して、実験データの統計分析を行います。すべてのデータを平均±標準偏差(x ± SD)で表します。対応のない t検定を使用してグループ間の統計的差を評価します。
    1. 2 つの独立したサンプル グループからのデータをソフトウェアのデータ テーブルに入力し、各グループは個別の列に対応し、サンプルは互いに独立しています。「分析」機能で「正規性と対称性の検定」を選択し、両方のグループにシャピロ・ウィルク検定を適用して正規性を検証します。
    2. 両方のグループの P > 0.05 の場合、正規分布したデータを考慮します。これに基づいて、分析関数のt検定で対応のないt検定を選択して分析を実行します。統計的有意性をP < 0.05として定義します。

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結果

ラットモデルの各グループの成功率検証実験結果を 図1に示します。モデリング後、ラットで神経機能スコアリングを実施しました(図1A)。モデル群は重度の神経障害を示し、スコアが1〜3のモデル群はその後の実験に含まれました。 図1B とCはTTC染色結果を示しており、赤は正常な脳組織を表し、白は梗塞領域を示します。モデル群は重度の脳梗塞を示した。これらの発見は、虚血モデルの確立が成功したことを確認し、その後の実験での使用を検証します。edgeRを用いた差次発現解析により、MCAO群で920個のDEMと710個のDELが明らかになりました。さらに、16のmiRNAが異常な発現パターンを示しました。

LncRNAは、miRNAに競合的に結合することにより、ceRNAとして作用することができます。全体として、16個のmiRNAと121個のlncRNAを含む717個のlncRNA-miR相互作用ペアが同定されました(<...

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ディスカッション

脳卒中の病因の根底にある分子メカニズムを調査し、潜在的な診断および治療標的を特定するために、MCAO後のラットの脳組織に対してRNA-Seqおよび低分子RNA-Seq(sRNA-Seq)分析を実施しました。この研究は主に、lncRNA、miRNA、およびmRNAが関与する複雑な調節ネットワークを調査することを目的としています。MCAO誘導ラット脳組織のRNA-SeqおよびsRNA-Seqデータセットを網羅的に解析し、lncRNA-miRNA-mRNA調節ネットワークを解明しました。lncRNA、miRNA、およびmRNA間の調節関係を説明するために広範なネットワーク相互作用が構築され、それによって脳卒中の病因の根底にあるRNAを介したメカニズムの理解が進みました。ceRNAネットワークの解析により、「白血球接着」、「インテグリン介在細胞接着の調節」、「コラーゲン線維組織化」、「インテグリン介在細胞接着」、「虚血性脳卒中後のシグナル伝達のカルシウム依存性正調節」、「異球細胞間接着」、「単球走化性」などの生体プロセスに関連する344のタンパク質コード遺伝子が明らかになりまし...

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開示事項

著者らは、競合する利益は存在しないと述べている。

謝辞

この原稿は、安徽省学術リーダー予備候補者資金提供プロジェクト(No.2022H287)、安徽省衛生研究重点プロジェクト(参照:AHWJ2022a013)、安徽省大学自然科学研究重点プロジェクト(NO.2023AH050745)、および安徽省衛生衛生優秀人材プロジェクト(NO.ahsjhmypygc20230074)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2%(w/v)TTC染色液北京康楽クローンバイオテクノロジー株式会社 20230805TTC染色
4%(w / v)パラホルムアルデヒド溶液ビヨタイムP0099固定脳組織
40 オスの SPF グレード SD ラットHagzhou Ziyuan 実験動物繁殖有限公司SCXK [zhe] 2024-0004実験動物用
5%脱脂粉乳科学的物理学PH1519WBの
アガロース電気泳動システム北京六義バイオテクノロジー株式会社DYCP-44PWBの
自動露光装置上海培清科技有限公司JS-M6PWBの
自動露出計上海培清科技有限公司JS-M6PWBの
自動製氷機常熟市雪科電化有限公司IMS-20WBの
カルモジュリン親近感49B2443WBの
カムキイ親近感14G0796WBの
遠心機海門麒麟バイアー機器製造有限公司LX300WBの
clusterProfiler パッケージ生体伝導体clusterProfiler_4.17エンリッチメント分析
CX36ゼンビオN24AP24WBの
CX43ゼンビオM08NO01WBの
ECL超高感度化学発光キットバイオシャープBL520B型WBの
電気サーモスタット空気乾燥オーブン上海三発科学機器有限公司DHG-9070WBの
電気泳動装置Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (タノン)EPS300WBの
電気泳動装置上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社EPS300WBの
電気泳動タンク上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社VE-180WBの
ガブラ6親近感46V5371WBの
ヤギ抗マウスIgGZs-BIOの142637WBの
ヤギ抗ウサギ IgGZs-BIOの139931WBの
グリア3親近感0C33051WBの
高速冷凍遠心分離機安徽嘉文計器設備有限公司JW-3021HR型WBの
HiSeq 2500システムイルミナ/RNAハイスループットシーケンシング
ImageJソフトウェア国立衛生研究所画像J 1.54kTTC染色
磁気加熱撹拌機常州市と楽器工場JJ-79-1WBの
マイクロピペットドイツ エッペンドルフ/WBの
常温マイクロ遠心分離機海門 Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300LX300WBの
NPY1R型親近感2D38248WBの
ピペットエッペンドルフ0.5-10ulWBの
PKCの親近感17E3745WBの
染色済みタンパク質マーカーバイオシャープBL712CWBの
PVDF用メンブレンミリポールIPVH00010WBの
Ribo-Zero rRNA除去キットイルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国/RNA抽出
RIPAライセートバイオシャープBL504A型WBの
ペントバルビタールナトリウム北京シンクファーテクノロジー株式会社メルク麻酔剤
トランスファーメンブレン器具上海タノンサイエンス&センターテクノロジー株式会社VE-186WBの
膜貫通装置Shanghai Tianeng Technology Co., LTD. (タノン)VE-186WBの
&β;-アクチンZs-BIOの19AW0505WBの

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