マウスから一次膵島および一次膵臓細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法

Summary

本研究は、マウス膵臓から機能的な一次膵島および腺皮細胞を効率的に抽出する簡略化された方法を開発し、急性膵炎誘発性糖尿病の病因における細胞間コミュニケーションの研究に貴重なツールを提供しました。

Abstract

急性膵炎糖尿病(PPDM-A)の病因に関する研究では、膵腺腺細胞(PAC)と膵島細胞間の異常な双方向コミュニケーションが重要な焦点となっています。しかし、不死化細胞株は病態生理的条件を再現できないため、高品質な一次細胞の抽出が極めて重要です。マウスから一次アイレットを抽出する現在の方法は、主に胆管カニュレーションによる 生体内 膵臓灌流に依存しており、これは技術的な障壁が高く、経験のない研究者には適していません。

この研究では、複雑な 生体内 灌流の必要性を排除し、方法を修正しました。SPFグレードのC57BL/6Jマウス(6〜8週齢)は麻酔と安楽死を行い、その後膵臓隔離が行われました。膵臓はコラーゲン酵素Pとともにin vitro で消化されました。一次アイレットはフィコル密度勾配遠心分離で分離され、アシナー細胞は細胞篩ろ過と遠心分離によって得られました。細胞の生存率と機能は、カルセイン/ヨウ化プロピジウム(カルセイン/PI)染色、グルコース刺激インスリン分泌アッセイ、アミラーゼ活性検出を用いて評価されました。

結果は、修正された方法が操作しやすいことが示されました。マウスあたりの収量は(120 ± 5)の一次アイレットと1.6〜1.95個×10⁷の腺皮細胞でした。膵島および腺皮細胞の生存率はそれぞれ(97.52 ± 0.16)%と(96.55 ± 0.95)%でした。さらに、島は正常なインスリン分泌能力を示し、腺皮細胞はセルリン刺激に敏感でした。この方法はシンプルかつ信頼性が高く、膵臓の外分泌・内分泌相互作用およびPPDM-Aの研究に現実的な枠組みを提供します。しかし、ラットでの未検証の適用など、制限もあります。

Introduction

急性膵炎(AP)は膵臓実質損傷や炎症カスケードなど複数の経路を通じて膵内分泌機能を妨げ、急性膵炎後糖尿病(PPDM-A^)を誘発します^1,2。現在、PPDM-Aの主要な病因は不明であり、膵内分泌と外分泌区画間の異常な双方向コミュニケーションが主要な研究焦点となっています^。既存の不死化β細胞株(例:INS-1、MIN6)はin vitro糖尿病細胞モデルで一般的に用いられますが、その腫瘍由来性から、血糖応答性や細胞異質性の面で通常の一次膵島細胞と有意な違いがあります。その結果、急性膵炎^4,5の微小環境下での病態生理状態を真に再現することはできません。したがって、高品質な一次アイレットとアシナール細胞の獲得は、それらの相互作用メカニズムを解明する中核的な技術的基盤となっています。

マウスから一次アイレットを分離する現在の方法は主に管管カニュレーション技術に依存しており、胆管を正確に定位・カニュレーションして、コラーゲンゼ溶液を膵臓実質に注入してin vivo灌流を行う^6,7。しかし、新生マウスの一次アイレットの分離に関しては、Huangら8がin vivo膵灌流なしのin vitro消化を用いて優れた^{成果を達成}しました。私たちの研究チームの実務経験に基づき、胆管カノレーションによる最適な膵灌流を行うことは、専門的な訓練なしには迅速かつ効果的に行うことが難しいと分かっています。新生マウスから一次アイレットを分離する方法に触発され、私たちのチームは、灌流経験のない研究者にもより簡単かつアクセスしやすいように抽出プロトコルを改良しました。この修正されたアプローチは、若マウスや繊細な胆管を持つマウスから一次島を単離するより簡単な代替手段も提供します。さらに、この方法はアイレットおよびアシナーセルの分離効率(量)および純度(品質)の両面で利点を提供します。研究者は同じ病理学的および生理学的文脈で実験を行うことができ、アイレットとアクシナー細胞間の相互作用メカニズムの詳細な解析を促進します。

この方法は膵臓の消化時間を厳密に管理する必要があります。消化前に膵臓をミンチにすることも重要なステップです。さらに、消化後の膵臓組織の機械的分散の強さにも注意を払う必要があります。これらの要因はすべて、孤立した小島やアシナー細胞の数量と質に影響を与えます。この方法はラットで検証されておらず、現時点では生産のための大規模化はできません。

Protocol

動物を対象とした手技は、長海病院の倫理委員会または実験動物センター倫理委員会(承認番号:CHEC (A.E)-2025-026)によって承認されています。SPFグレードのC57BL/6Jマウス(生後6〜8週、体重18〜25g、オスまたはメス、n = 3)は、12時間の明暗サイクルで維持され、食事(維持食)と水を自由に提供しました。

注射器や針などの廃棄物は、研究所専用の鋭利器容器に回収され、資格を持つ専門機関によって処分されます。研究 における非人間動物のケアおよび利用における倫理的行動ガイドラインに従い、マウスの死骸は研究所専用のマウス死骸冷凍庫に保管され、専門機関によって焼却されます。

1. 試薬の調製

注意:無菌密度勾配培地のような溶液は、研究所の「化学廃棄物収集ドラム」に収集されます。すべての化学廃棄物は、検査機関が手配した資格のある専門機関によって処分されます。

1. コラーゲンP溶液の調製
   1. 50 mLの遠心分離機チューブで、コラーゲナーゼP25 mg、無水塩化カルシウム42 mg、トリプシン阻害剤0.02 gを順次重さで投与します。ハンクスバランス塩溶液45.5mLとHEPES溶液500μLを加え、完全に溶けるまで渦巻きます。0.22μmフィルターでろ過して溶液を滅菌し、新しい無菌50 mL遠心分離機チューブに移します。これにより0.5 mg/mLのコラーゲン酵素P溶液が得られ、その後の膵臓組織の消化に使用されます。
2. 無菌密度勾配溶液の処理
   1. 滅菌のため0.22μmのフィルターで無菌密度勾配溶液をろ過し、その後新しい無菌50 mL遠心分離機管に移します。溶液情報には明確なラベルを付け、後で使うために4°Cで保存してください。以降は「フィコル」と呼ばれます。
3. ストップバッファーと完全培地の準備
   1. 胎児用牛血清(FBS)10%とペニシリン-ストレプトマイシン溶液をそれぞれ空DMEM培地とRPMI-1640培地に加え、DMEM全培地およびRPMI-1640全培地(膵消化のストップバッファーも含む)を調製します。溶液情報には明確なラベルを貼り、後で使用するために4°Cで保存してください。
4. 異なる濃度のグルコース溶液の調製
   1. 50 mLの遠心分離機管内に、クレブス・リンガー重炭酸HEPESバッファー(KRBH)50 mLと牛血清アルブミン(BSA)-V 0.25 gを加え、0.5% BSAを含むKRBH溶液を合成します。次に、0.5%BSA含有KRBH溶液28.33 mLに、グルコース168 μL(1 M)と塩化カルシウム溶液1.5 mL(50 mM)を加えて5.6 mMのグルコース溶液を合成します。0.5%BSA含有KRBH溶液の9.28 mLに、グルコース220 μL(1 M)と塩化カルシウム溶液500 μL(50 mM)を加えて22 mMのグルコース溶液を合成します。

2. 膵島および膵腺腺細胞(PAC)の分離

注意:すべての手術器具はオートクレーブ滅菌処理を受けなければなりません。

1. 12ウェルプレートにハンクスのバランスソルト溶液とコラーゲンP溶液を加えます。さらに、50mLの遠心分離管に3mLのコラーゲナーゼP溶液を加えて消化します。
   注意:ハンクスバランスソルト溶液2mLを3つのウェルに加え、コラーゲナーゼP溶液2mLを1つのウェルに加えます。
2. 手術前に1.25%トリブロモエタノールを腹腔内注射で0.025 mL/gの量で体重測定・麻酔し、マウスの足パッドをつまんで麻酔状態を確認します。麻酔の深さは呼吸数の徐々の低下と足パッドへのつまみの無反応によって決まります。深麻が確認されたら、マウスを頸部脱臼で安楽死させます。マウスを75%エタノールに5分間浸して消毒し、その後バイオセーフティキャビネットに移して膵臓隔離を行います。
   注:トリブロモエタノール(1.25%)は購入時にあらかじめ調製された溶液として提供されます。手作業での準備は不要です。研究者は実験中ずっと手袋とマスクを着用しなければなりません。1.25%トリブロモエタノールの注射中に皮膚に触れた場合は、すぐに無水エタノールで残留試薬を拭き取り、流水で5分間すすいでから乾燥を和らげる保湿剤を塗布してください。本研究には腐食性化学物質は含まれていません。1.25%トリブロモエタノールなどの廃棄物化学試薬は、「有害化学廃棄物」とラベル付けされた専用の密封容器に回収されます。
3. 腹部に「V字型」の切開を入れて、マウスの腹腔を開けます。左心気症領域にある濃赤色のリンパ器官は脾臓であり、脾臓に付随する白色器官は膵臓です。胃の下縁と膵十二指腸の接合部に沿って、膵臓を鈍く解剖します。
4. 隔離された膵組織をハンクのバランスソルト溶液で洗浄し、残存する腸間膜の付着物、脾臓、膵周囲脂肪組織を除去します。
5. 処理済み膵臓を2mLのコラーゲンP溶液を含む12ウェルプレートに移します。左手でピンセットで膵臓を固定し、右手で1mLの注射器を使ってコラーゲンゼP溶液を膵実質に注入し、膵組織が半透明で浮腫するまで注ぎます。
   注:灌流用のコラーゲナーゼP溶液の体積は600〜800μLです。
6. 外科用ハサミで膵臓を1〜2 mm³の組織片に素早く切り分けます。
   注:組織片のサイズは標準的な200 μLピペットの内径とほぼ同じです。
7. 1 mLのピペット先端の遠位1〜1.5cmを切り取り(開口部を拡大)、この改良した先端を使って膵臓組織の断片を2 mLのコラーゲナーゼP溶液と共に、3 mLのコラーゲナーゼP溶液をあらかじめ充填した50 mL遠心分離チューブに移します。
8. 遠心分離機チューブを37°Cの水浴で12分間孵化し、この間は5〜6分ごとに優しく揺らします。
   注:遠心分離管を振る目的は、膵組織とコラーゲンP溶液の完全な接触を確保することです。
9. コラーゲナーゼP溶液の消化作用を終わらせるために、RPMI-1640完全培地10mLを加えます。
10. ペレットを5mLのパスツールピペットで繰り返しピペット(上下に15〜20回)して、明らかな大きな組織の塊が残らないまで続けます。
11. RPMI-1640全培地10mLを加え、180× g で4°Cで2分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
12. ペレットを20mLのRPMI-1640完全培地で再懸浮させます。懸濁液を40メッシュのふるいでろ過し、その後180× g で4°Cで2分間遠心分離します。
13. 上清液を優しく捨て、20 mLのフィコル溶液を加えてペレットを再懸濁させ、ゆっくりと15 mLのRPMI-1640完全培地を加えます。
    注:この時点で透明な液体界面が観察できます。
14. 640 × g で25°Cで20分間優しく遠心分離機を置きます。
    注意:遠心分離中の激しい揺れは避け、界面の破損を防ぎましょう。
15. 遠心分離機チューブを慎重に取り外し、5mLのパスツールピペットで上部の赤色培地層を吸引します。次に、液体層界面でアイレットを含む液体を慎重に吸引し、新しい50 mL遠心分離機チューブに移します。RPMI-1640完全培地20 mLを加え、180 × g で遠心分離機で4°Cで2分間入れ、上清液を廃棄します。
16. ペレットを20mLのRPMI-1640完全培地で再懸浮させ、180× g で4°Cで2分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
17. ペレットを10 mLのRPMI-1640完全培地で再懸浮させ、60mmの細胞培養皿に移します。
18. 逆立型生物顕微鏡(100倍倍)で、20μLピペットを使って手動でアイレットを選びます。選ばれたアイスレットを24ウェルの培養皿に移し、1ウェルあたり500μLのRPMI-1640完全培地をあらかじめ充填します。
19. フィコル溶液層を廃棄し、2.15段階のペレットを10 mLのDMEM完全培地で再懸浮させ、100μmのセルストレーナーでろ過し、180 × g で4°Cで2分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
20. ペレットを10 mLのDMEM完全培地で再懸浮させ、180 × g で4°Cで2分間遠心分離し、上清液を廃棄します。その後、5mLのDMEM完全培地でペレットを再懸浮させ、次の実験に備えます。

3. 膵島および腺細胞の生存可能性検出

1. 分離したアイレットと適切な数のアシナー細胞を、それぞれ1 mLのRPMI-1640全培地と1 mLのDMEM全培地を含む12ウェル/24ウェル培養プレートに移します。プレートを37°C、5%CO₂セルのインキュベーターに15分間置いて平衡させます。
2. 12ウェル/24ウェルの細胞培養プレートを180 × g で25°Cで30秒遠心分離します。 その間、カルセイン/プロピジウムヨウ化物(カルセイン/PI)細胞生存性・細胞毒性アッセイキットの指示に従って染色試薬を準備してください(調製中は光から保護してください)。
3. 培地を優しく捨て、膵島とアシナー細胞をリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で一度洗浄し、ステップ3.2と同じ条件で遠心分離機をかけます。
4. PBSを廃棄し、アイレットとアシナーセルを準備済みの染色試薬で再懸浮させます。培養皿をアルミホイルで包み(光から守るため)、37°C、5%CO₂細胞の培養盤で30分間培養します。
5. 光が遮られた環境下で蛍光顕微鏡(100倍倍)で画像を撮影し、ImageJを用いて細胞の生存可能性解析を行います。

4. アシナーアミラーゼアッセイ

1. 12ウェルのプレートに1.5 ×^10個6セル/ウェル、培地1mLを投与します。コントロール(Ctrl)とセルリン刺激細胞(10 nM、20 nM、50 nM;C10、C20、C50とラベル付け)を設定します。30分間の刺激後、製造元の指示に従ってアミラーゼ活性検出のための上清液を採取してください。

5. グルコース刺激インスリン放出アッセイ

1. 24ウェルのプレートに1井戸あたり10個のアイレットをまきましょう。アイレットを完全なRPMI-1640メディウムで2時間安定化させ、その後メディウムを廃棄します。
2. アイレットを1 mLの5.6 mMグルコース溶液に1時間培養します。その後、上澄液を採取してください。
3. アイレットはKRBHバッファーで洗いましょう。次に、22 mMのグルコース溶液でアイスレットを1時間培養し、再び上清を採取します。
4. マウスINS(インスリン)ELISAキットを用いて、低グルコースおよび高グルコース条件下の2つの上清液のインスリン濃度を検出します。グルコース刺激インスリン指数(GSI)を計算する:
   GSI = 高グルコース培地中のインスリン濃度 / 低グルコース培地におけるインスリン濃度

Results

フィコル溶液密度勾配遠心分離後、透明な無色液体層と媒体の界面付近にアイスレットが観察され、チューブ底部にはPACが堆積物として存在しました(図1)。

光学顕微鏡下では、アイレットは通常丸または楕円形で、色は黄金褐色で、1匹あたり安定した収率(120個±から5個)であった(図2A,B)。新たに分離されたPACは球状で、主にクラスター(1クラスタあたり3〜8個のアクシナー細胞)に分布していました。腺皮細胞の頂端は色が濃く、明らかにザイモゲン顆粒が見えました。細胞の周囲に顆粒や小胞構造は観察されず、溶液の背景も明確でした。アシナー細胞の収量はマウスあたり1.6〜1.95×10⁷細胞[(1.77 ×〜 10⁷)± (1.75 × 10⁶])でした(図2C,D)。

島やアシナー細胞のカルセイン/PI染色結果は 図3Aに示されています。カルセイン染色細胞(緑色)が大多数を占め、PI染色細胞(赤色)は稀でした。生死染色画像の定量解析はImageJを用いて行われました。結果は、分離された島とアシナー細胞の生存率がそれぞれ(97.52 ± 0.16)%と(96.55 ± 0.95)%であったことを示しました(図3B)。

分離された膵腺細胞の基底アミラーゼ活性は(0.79 ± 0.01) U/mLでした。10 nM、20 nM、50 nMの濃度でセオルリン刺激を受けた後、アシナー細胞のアミラーゼ活性はそれぞれ(1.45 ± 0.03) U/mL、(1.65 ± 0.05) U/mL、(1.39 ± 0.02) U/mL でした。一方元ANOVAの結果は、対照群(Ctrl)群と比較して、すべてのセレリン刺激群でアミラーゼ活性に有意な差が見られ(全 てP が0.001<)、さらに、20 nM群と10 nMセレイン群間でアミラーゼ活性に有意な差が観察されました(P < 0.001)(図4A)。

5.6 mMのグルコース溶液で刺激した際、孤立したアイレットのインスリン分泌は(0.27 ± 0.04) ng/mL/islet/hでした。22 mMのグルコース溶液で刺激した際、分離されたアイレットのインスリン分泌は(0.94 ± 0.04) ng/mL/islet/hで、GSIは3.44でした。結果は、分離されたアイレットが異なる濃度のグルコース溶液による刺激下で典型的かつ効果的なインスリン分泌反応を示すことを示しています(図4B)。

研究チームのメンバーは、分離されたアイレットやアシナー細胞の量と質が消化時間と密接に関連しており、操作中の厳密な制御が必要であり、異なる操作者の影響を受けにくいことを観察しました。一方で、収量や生存率の変動は膵臓の完全な剥離や膵組織の機械的分離とも密接に関連しており、手術中に注意が必要です。

図1:フィコル溶液密度勾配遠心分離の結果。 アイレット層は無色透明の液体層と培養培地の界面に位置しています。遠心分離機管の底にある沈殿物はPACです。略称:PACs:膵臓の腺皮細胞。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:膵島およびPACの形態学的および定量的特徴。 (A) マウス膵臓組織から分離された膵島の形態。スケールバー = 100 μm。(B) マウス膵臓組織から分離されたアイレットの数の定量解析(n = 3)。(C) マウス膵臓組織から分離されたPACの形態学。スケールバー = 100 μm。(D) マウス膵臓組織から分離されたPACの数の定量解析(n = 3)。すべてのデータは平均標準差(SD)で表±。略称:PACs:膵臓の腺皮細胞。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:アイレットおよびPACの生存可能性評価。 (A) マウスアイレットおよびPACの生存可能性を評価するためのカルセイン/プロピジウムヨウ化物蛍光染色。緑:生きた細胞。赤:死んだ細胞。スケールバー = 100 μm。(B) アイレットおよびPACの生存可能性の定量的分析(n = 3)。すべてのデータは平均標準±で表されました。略称:PACs:膵腺腺細胞;PI = ヨウ化プロピジウム。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:PACsのアミラーゼ活性および膵島のインスリン分泌能力の評価。 (A) 異なるセルレイン濃度による刺激下のPACのアミラーゼ活性(Ctrl: Control group;C10、C20、C50:セレレンの濃度は10 nM、20 nM、50 nM(n = 3)でした。(B) グルコース刺激インスリン分泌濃度の定量的分析(n = 3)。すべてのデータは平均標準差(SD)で表±。***P < 0.001。略称:GSI = グルコース刺激インスリン指数;PACs:膵臓の腺皮細胞。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Discussion

近年、膵炎後糖尿病(PPDM)は^{広く注目を集めています。}APの文脈でPACが膵島ホルモン分泌に影響を与える分子メカニズムの調査は非常に重要です。

APの病因は主に、腺皮細胞における膵酵素の過剰活性化に関連しており、これが膵臓組織の自己消化を引き起こします^11,12。AR42J、266-6(腺皮細胞株)やMIN6、INS-1(β細胞株)などの細胞株は現在利用可能ですが、これらの体外細胞モデルは一次性腺皮細胞や^{アイレットの}生理学的複雑さを完全に再現することはできません^4,5。したがって、一次腺皮細胞と膵島の分離は、膵臓の外分泌区画と内分泌区画の相互作用を深く研究するために不可欠です。現在、島の隔離方法はよく確立されています。しかし、ほとんどの研究は膵島と膵^腺細胞の相互作用を研究する必要性を満たしていません ^6,7,8。

この実験プロトコルは膵臓灌流手順を最適化し、技術的な障壁を下げることで、胆管カニュレーションの専門訓練を受けていない研究者でも実験を行えるようにしています。同時に、単離された小島や腺窩細胞の量と質を確保し、一次マウス島と膵原一次腺窩細胞を同時に単離する簡便かつ迅速な方法を提供します。

この方法は膵島の分離プロセスを簡素化しますが、重要な工程は依然として高い収量と膵臓および膵腺細胞の効果的な分離を確保するために厳格な管理が必要です。これらのステップには、適切な膵灌流、適切な組織破壊(徹底的なミンチングの確保)、膵消化(消化時間の正確な制御と消化中の手動振る動作)、機械的ピペッティング(ピペッティングの回数と強度の制御)が含まれます。アイレット選択の前に、再懸浮したアイレットはより効率的なアイレット採取を促進するために、約10分間セルインキュベーターで安定化させるべきです。

膵灌流中は、より透明な液体小胞を注入することでより良い結果が得られることに注意が必要です。膵臓組織全体は完全に灌流する必要がありますが、灌流時間は1〜2分以内に制御してください。細胞生存率が低いと判明した場合は、膵組織とコラーゲナーゼPの接触時間(灌流時間や水浴消化時間を含む)を調整します。さらに、隔離中の機械的損傷にも注意してください。例えば、膵臓組織を分散させる際の過度な力は避けてください。無菌技術は、アイレットやアクシナー細胞の隔離期間中ずっと維持され、汚染を防ぐ必要があります。準備された試薬は0.22μmのろ過が必要です。分離プロセスはバイオセーフティキャビネット内で行われるべきであり、隔離中に使用するすべての器具や消耗品は滅菌でなければなりません。2つの調製された完全培地には1%のペニシリン・ストレプトマイシン溶液も含まれています。

マウス麻酔の場合は、左親指と人差し指でマウスの首の皮膚を固定し、薬指と小指で腹部を支えます(頭を下げて腹部を露出させる姿勢を保ちます)。注射器を右手で持ち、マウスの左下腹部の皮膚(鼠径部から1cm、正中から0.5cm)に30°の角度で挿入し、麻酔をゆっくりと注射し、針抜き後に無菌綿棒で注射部位を10秒間押さえて薬剤漏れを防ぎます。完全に麻酔されたマウスは頸椎脱臼による安楽死のみ行います。

汚染された針(マウスの血液や組織に曝露された)で刺されたり、マウスに噛まれた場合は、すぐに傷口の近くの流し込み口の周囲を絞り(傷口の近位から遠位端にかけて少量の血液を排出)、流水で15分間連続的に洗浄し、その後75%エタノールまたは0.5%ポビドンヨウ素で消毒してください。

アクシナー細胞アミラーゼ活性アッセイの結果、単離された膵臓のアクシナー細胞は基底活性化レベルが低く、セルレイン刺激に感受性があることが示されました。アミラーゼ活性はセレイン濃度上昇とともに徐々に増加し、20 nMで最高レベルに達し、セルレイン濃度が50 nMになるとわずかに減少しました。グルコース刺激インスリン分泌アッセイの結果は、分離されたアイレットが異なる濃度のグルコース溶液による刺激下で典型的かつ効果的なインスリン分泌反応を示したことを示しました。これらの結果は、このプロトコルで抽出されたアシナー細胞およびアイレットがその後の in vitro 実験に適していることを示しています。

この実験プロトコルのアイレットおよび腺頭細胞の分離手順は操作が容易です。実験結果により、このプロトコルで分離された島やアクシナー細胞は優れた量と生存率を示しました。さらに、チームの複数のメンバーが複数のマウスを使ってこのプロトコルを検証しています。検証結果は、再現性が高く、データも信頼性が高く、細胞収量の変動も最小限であることを示しています。しかし、このプロトコルにはいくつかの制限もあります。オペレーターの技術的なスキルへの依存度は低いものの、マウス膵臓を完全に解離するには基本的なマウス解剖学の知識が必要であり、これは分離プロセス全体の前提条件です。複数のマウスから膵臓組織を同時に分離する場合、コラーゲンP溶液やその他の試薬の量を適切に調整する必要があります。さらに、2匹以上のマウスからの同時分離は推奨されません。解剖、灌流、ミンチ処理の際に異なるマウスの膵組織を処理する時間差が、膵組織とコラーゲンPの接触時間に影響を与え、細胞分離の効率と生存性を損なうからです。したがって、その大規模な応用は限定的である可能性があります。さらに、このプロトコルはラットで検証されていません。ラットからアイレットやアクシナー細胞を分離する場合、一部の試薬の用量や消化時間の調整がさらに必要になることがあります。

結論として、この実験プロトコルは、一次マウスアイレットと一次膵腺細胞を同時に分離するための簡単かつ迅速な方法を提供します。これは、未経験の研究者が膵島および神経細胞の単離を行うのにより適しており、同時に膵臓の外分泌-内分泌相互作用に関する invitro 研究の実用的な実験枠組みも提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 & μ;Mフィルター	ミレックス	SLGPR33RB	調製済みのコラーゲン酵素P溶液をろ過します
0.25 M 塩化カルシウム(無菌)	ビヨタイム	ST365	インスリン分泌活性化のためのカルシウム依存性シグナル伝達経路
1mlシリンジ	ジェルイ	10084692516405	コラーゲナーゼPの膵臓組織への灌流に使用されます。
1.25%トリブロモエタノール溶液	北京ヨシダ・バイオテクノロジー株式会社	JT0781	麻酔
1.5 mL遠心分離機チューブ	エッペンドルフ	30121589	細胞上清液を遠心分離と保存のために採取します。
1xハンクバランス塩溶液	バイオシャープ	BL561A	コラーゲナーゼP溶液を準備し、膵臓組織を洗い流します
12ウェル細胞培養プレート	サーステット	83.3921	膵臓組織と培養から抽出したアシナールを保持してください
15 mL遠心分離機チューブ	北京・ラブギック科技有限公司	CT-002-15A	実験中の溶液を保持する方法
24ウェル細胞培養プレート	サーステット	83.3922	採取した小島の養殖
40-mesh ふるい	魏丹楽器	該当なし	膵臓組織をろ過する
5 mL パスツールピペット	バイオシャープ	BS-XG-03L	液体のピペット投与や膵臓組織の物理的な破壊
50 mL遠心分離機チューブ	北京・ラブギック科技有限公司	CT-002-50A	実験中の溶液保持、組織の封存、遠心分離
60mm細胞培養皿	北京・ラブギック科技有限公司	12211	摘みやすいアイレットを含む培養培地を保持する容器
75%エタノール溶液	ハイノート	該当なし	ネズミを消毒のために浸けてください。
Adobe Photoshop 2023	アドビ社	該当なし	画像を生成しましょう。
ベックマン・アレグラ X-12/X-12R 遠心分離機	ベックマン	アレグラX-12/X-12R	遠心分離機
牛血清アルブミン(BSA)-V	ソーラービオ	A8020	島の正常な生理機能を維持し、異なる濃度のグルコース溶液を調製するために(これ)を使いましょう。
C57BL/6Jマウス、SPFグレード、6–生後8週間、体重18歳と18歳;25 g	海軍医科大学実験動物センター
カルセイン/PI細胞の生存率および細胞毒性アッセイキット	ビヨタイム	C2015L	カルセインAM(カルセインAM)およびプロピジウムヨウ化物(PI)による生存細胞と死死細胞の二重蛍光染色を同時に行い、動物細胞の細胞生存率と細胞毒性を検出します。
塩化カルシウム(無水)	サンゴン・バイオテック	10043-52-4	コラーゲン酵素P溶液を準備します
セルストレーナー(100 & mu;m)	バイオシャープ	BS-100-XBS	ろ過する腺皮細胞
コラーゲンP	シグマ	11213857001	膵臓組織の消化
D-(+)-グルコース溶液(20%、無菌)	ビヨタイム	ST491	アイレットからのインスリン分泌を刺激します。
DMEMベーシック(1x)(Dulbecco'S改良型イーグル中介)	ギブコ	C11995500BT	培養アシナー細胞
胎児用牛血清(FBS)	バイオウエスト	S140B-500	培地を準備してください
Ficoll-Paque PREMIUM滅菌液	シチバ	17544203	密度勾配層化のための密度勾配媒体
GraphPad プリズム 8.0.1	グラフパッド・ソフトウェア有限責任会社	該当なし	画像を作成し、統計解析を行うこと。
HEPES溶液(1 M)	バイオシャープ	BL1061A	コラーゲン酵素P溶液を準備します
高速/冷蔵遠心分離機	シグマ	3K15	遠心分離機
イメージJ	国立衛生研究所光学・計算機器研究所(LOCI)	該当なし	細胞蛍光画像を解析し、細胞の生存率を計算します。
逆形生物顕微鏡	ライカ	該当なし	細胞の形態を観察し、島を選びます。
逆転蛍光顕微鏡	オリンポス	IX73	細胞の蛍光信号を観察し、蛍光画像を撮影します。
クレブス・リンガー重炭酸HEPESバッファー	リージェン	CZ0103	島の正常な生理機能を維持し、異なる濃度のグルコース溶液を調製するために(これ)を使いましょう。
マウスINS(インスリン)ELISAキット	武漢ファインバイオテック有限公司	EM0260	島のインスリン分泌量を検出してください。
眼用鉗子(10cm、フック付き湾曲)	清怡医療機器	該当なし	解剖の補助
眼用鉗子(10cm、歯付き直線)	清怡医療機器	該当なし	膵組織の解離と急激な分離、膵組織の摘出を支援する
ペニシリン・ストレプトマイシン溶液	ギブコ	15140-122	汚染を防ぐために培地を準備してください
RPMI-1640中型、	KeyGEN バイオテック	KGL1501-500	コラーゲナーゼP消化液を終了し、膵島を培養します
グリシンマックス(大豆)からのトリプシン阻害剤	シグマ	T6522	コラーゲン酵素P溶液を準備します
急迫性ハサミ(10cm、直線先端)	清怡医療機器	該当なし	解剖学の補助と膵臓組織の切断
ウォーターバス	OAIICLAB	OW-HF	消化温度を維持してください。
&α;-アミラーゼおよびβα;-アミラーゼ活性アッセイキット	エラブサイエンス	E-BC-K006-M	さまざまな条件下でアクシナー細胞が分泌するアミラーゼのレベルを検出します