次世代シーケンシングを用いた非小細胞肺がんにおける標的変化の検出

サマリー

このプロトコルは、非小細胞肺がん(NSCLC)ホルマリン固定パラフィン包埋組織における標的化可能なゲノム変化を検出するための、自動化されたISO15189認定の次世代シーケンシングワークフローを記述しています。

要約

非小細胞肺がん (NSCLC) における標的療法の成功は、突然変異、遺伝子融合、増幅などのドライバーの変化を正確に特定できるかどうかにかかっています。次世代シーケンシング (NGS) は、既知のゲノム異常と新規のゲノム異常の両方を検出できる包括的な分子診断ツールとして登場し、個別化された NSCLC 治療に重要なサポートを提供します。しかし、NGSは依然として複雑で技術的に困難な方法です。NGS は広く採用されているにもかかわらず、技術的な複雑さや納期の長期化など、依然としていくつかの課題に直面しています。ここでは、臨床検査室で実装されているISO15189認定のNGSワークフローを紹介します。標準化されたプロトコルには、腫瘍細胞性評価(≥20%)、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織からのDNA抽出(DNAインプット≥50 ng)、自動ライブラリ調製、およびバイオインフォマティクス分析が含まれていました。各ステップに厳格な品質管理 (QC) 措置を統合することで、ワークフローは高いデータ信頼性を保証します。さらに、ワークフローにおける重要な革新は、NGSライブラリ構築の自動化でした。NGSライブラリ構築の自動化システムには、末端修復、Aテール、アダプターライゲーション、ハイブリダイゼーションキャプチャ、精製が含まれており、人的エラーを効果的に最小限に抑え、実験の再現性を高め、ハンズオン時間を短縮し、効率を向上させました。経験から、臨床NGS検査の精度と拡張性を維持するには、厳格なQCと自動ライブラリ調製が不可欠であることが実証されています。この最適化されたアプローチは、ISO15189基準への準拠を保証するだけでなく、NSCLC 管理における精密腫瘍学に対する需要の高まりもサポートします。

概要

非小細胞肺がん(NSCLC)は、全肺がん症例の75%〜85%を占め、臨床的優先事項と治療上の課題の両方を表しています^1,2,3。近年、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)などの分子標的薬の開発と臨床応用の成功により、進行性NSCLCの治療は個別化精密治療の時代に突入しました^4,5,6。標的療法は、正確な有効性、高い特異性、および最小限の副作用を提供します ^7,8。この治療の変化は、同時に分子診断技術の需要を増加させました。

現在、包括的な腫瘍標的検査は、正確な遺伝子変異プロファイルの解明に役立つ臨床診療に不可欠な要素となっており、その後の標的薬物使用、薬剤耐性モニタリング、患者の予後評価に信頼できる基盤を提供します。特に、ハイスループットと高感度の技術的利点を活用したNGSベースのマルチ遺伝子検査は、すでに^{臨床応用に}推奨されています9,10,11,12。

従来の分子診断技術と比較して、NGS は画期的な利点を示しています。NGS の最大の利点は、そのハイスループット機能にあります。これにより、既知および未知の遺伝的変化の両方を含む複数の遺伝子の同時検出が可能になります^13,14。一方、NGS は 1 回の実行で包括的な検査を実現し、コスト、サンプル消費量、および検査所要時間を比較的削減します^15,16。これらの利点を考慮して、NGS は臨床現場での応用が増えています。ただし、NGS のプロセスは、腫瘍細胞性評価、核酸抽出、自動ライブラリ調製、バイオインフォマティクス分析など、複雑です。初期サンプル処理の品質は、その後のバイオインフォマティクス分析のパフォーマンスに直接影響します¹⁷。特に、ライブラリー調製には、生の核酸サンプルをシーケンシング機器と互換性のある標準化されたライブラリに変換するための一連のステップが含まれます。ライブラリー調製には、断片化、末端修復、アダプターライゲーション、およびPCR増幅が含まれます¹⁸。この複雑なプロセスでは、多くの場合、さまざまな技術的バイアスが導入されます。たとえば、断片化はヘテロクロマチン領域の過小評価につながる可能性があります。アダプターライゲーション中のリガーゼの基質の優先性により、特定の配列が失われる可能性があります。PCR増幅は、極端なGC含有量を持つ領域で不均一なカバレッジを引き起こす傾向があります¹⁹。これらの体系的なバイアスは、シーケンスデータの品質を低下させるだけでなく、その後のバイオインフォマティクス分析で誤った結論につながる可能性もあります。したがって、実験結果の信頼性と一貫性を確保するには、厳格な QC システムを確立することが不可欠です。

これらの長年の技術的課題に対処するために、研究所は完全に自動化されたNGSシステムを採用しました。このシステムは、手動処理時間を短縮し、全体的なターンアラウンド期間を短縮するように設計されています。プログラム可能なプロトコルが組み込まれており、運用の柔軟性と処理精度の両方を確保しながら、統合されたモジュールとユニットを利用して各ステップでの潜在的な技術的バイアスを効果的に最小限に抑えます。さらに、この自動化ソリューションは、ライブラリ調製の再現性とスループットを向上させるだけでなく、さらに重要なことに、シーケンシングデータが元のサンプルの分子組成をより正確に反映することを保証します。ここでは、DNAベースのNGSを用いたドライバーの変化の検出によるシステムを導入したいと考えています。

プロトコル

このプロトコルは、匿名化されたアーカイブサンプルに対するIRBの免除を受けました。

1. 事前テスト手順とQC

1. 検査室情報管理システムにサンプル情報を登録します(表1)。遺伝子変異検査のインフォームドコンセントフォームに記入してください。
2. NSCLC FFPEサンプルを受け取ります。検査に使用するサンプルが、保管期間が 2 年以内のパラフィン組織サンプルであることを確認してください。サンプルが標準的な病理学的方法に従って処理および保管されていることを確認してください。
   注: この研究は、大規模な臨床分析を実施するのではなく、主に方法論的ワークフローに焦点を当てています。したがって、研究のこの段階では、特定のサンプル数要件は設定されていませんでした。
3. 使い捨てミクロトームブレードを使用して切片を切断します。ブレード、鉗子、および1.5mlマイクロチューブをサンプル間で交換して、相互汚染を防ぎ、オペレーター由来の汚染物質(毛髪、皮膚細胞、唾液など)の持ち込みを回避します。
   注:大きなサンプルサイズ(≥0.5 cm x 0.5 cm)6〜10 μL、5枚。小さなサンプルサイズ(<0.5 cm x 0.5 cm)および穿刺サンプル、6-10 μL、10枚。
4. 定期的なヘマトキシリン-エオシン(HE)染色を実行して、腫瘍細胞の含有量を評価します。
5. 下流分析のために≥20%の悪性腫瘍細胞を含むサンプルを選択します。腫瘍内容は、HE ステンドグラススライド²⁰ で病理学者によって評価されます。
   注:腫瘍含有量が20%未満の場合は、HEスライド上のマークされた腫瘍領域のガイダンスの下、対応する腫瘍組織領域をこすり落とします。このプロセスは、周囲の非腫瘍性成分を効果的に除去することで腫瘍組織の濃縮を達成し、それによって収集された材料中の腫瘍細胞の割合を大幅に増加させます。
6. 以下に説明するように、自動精製システムを使用して核酸抽出を実行します。
   1. ミクロトームを使用してFFPEブロックを切片し、リボンを取得します。リボンを1.5mlの微量遠心チューブに入れます。リボンを自動抽出装置の指定されたサンプル入力位置に移します。
   2. 自動抽出キットを備えた自動抽出装置を使用し、手動ピペッティングを自動磁気ビーズ核酸抽出システムに置き換えます。
      注:このステップを自動化することで、自動抽出を確実にし、下流のNGSアプリケーションで高精度で再現性のあるDNA生産を保証できます。
   3. 全自動核酸精製器と核酸抽出試薬の説明書を参照して、核酸を抽出してください。
   4. 次に、 C1102プログラムを選択し、サンプル脱ろうインキュベーション時間を16時間、溶出量を100 μLとして選択します。
      注:抽出したDNA溶液をすぐにテストしない場合は、-20°Cで6か月以内に保存する必要があります。
7. 以下に説明するように、核酸の質(表2)を評価します。
   1. アガロースゲル電気泳動を使用して、DNAフラグメントサイズを決定します。Agilent2100およびその他のマイクロ流体キャピラリー電気泳動分析システムは、低入力サンプルに使用します。
   2. 1 g のアガロースを 100 mL の TAE 溶液に溶解します。混合物を水浴で透明になるまで加熱します。溶液を約60°Cに冷却します。
   3. 電気泳動装置の正極(赤)に接続します。負極(黒)を電圧180Vに実行し、15分間^21,22実行します。
   4. アガロースゲル電気泳動の結果に従って、フラグメントサイズを4つのレベル(A-D; 表3)、その後の操作のためにレベルA〜Cの核酸を選択します。
   5. 分光光度法を使用して純度を検証します。OD260/OD280 > 1.8 を確認します。OD260/OD230 > 2.0 で、許容可能な汚染物質レベル^{を示します 23,24}。
   6. 蛍光分析用の配列特異的蛍光色素に基づく検出キット(材料表)を使用して、DNA濃度を正確に測定します。
   7. 199 μLの作業溶液に1 μLの試験対象DNAを加え、次に混合し、短時間遠心分離し、蛍光光度計を使用してその濃度を測定します( 材料表)。

2. ライブラリーの調製とQC(図1)

1. 以下に説明するように、超音波処理(材料表)を使用してフラグメントゲノムDNAを調製します。
   1. 200 ngのゲノムDNAを50 μLの低Tris-EDTA(TE)バッファーに混合します。次に、サンプルチューブを予冷(8°C)のサンプルラックに保管します。
   2. 表4に従って機器パラメータを設定します。次に、フラグメンテーションを開始します。
   3. アガロースゲル電気泳動を使用して、フラグメンテーション効果を検証します。このステップでは、末端が損傷したDNA断片が生成され、後続のステップのために末端を鈍い末端に変換するために末端の修復が必要です。
2. 以下に説明するように、3 フィートで端部の修理と A の追加を実行します。
   1. FFPE DNAの損傷した末端を酵素で修復して平らな末端を形成し、3'-OHと5'-Pを確保します。平らな二本鎖の3'端にAを追加します。
   2. 7 μLの末端修復バッファーと3 μLの末端修復酵素を加えてERAミックスを調製し、3x〜5xを静かに手動でフリックし、1〜3秒間遠心分離します。
   3. ERAミックスを50 μLの壊れたDNAサンプルに加え、穏やかに混合し、1〜3秒間遠心分離します。
   4. PCR装置に入れ、ERAプログラムを選択します(20°Cで30分間、65°Cで30分間、4°Cホールド;蓋85°C)。2時間以内に次の操作を実行します。
3. 以下で説明するようにアダプターライゲーションを実行します。
   1. 30 μLのライゲーションバッファー、10 μLのDNAリガーゼ、および10 μLのDNAアダプターを加えて、反応系LIGミックスを調製します。次に、3x-5xを軽く手動でフリックし、1〜3秒間遠心分離します。
   2. 前のステップの60 μL生成物に50 μLのLIG混合物を加え、穏やかに混合し、1〜3秒間遠心分離します。
   3. 混合物をPCR装置に入れ、LIGプログラムを選択します(蓋を加熱せずに20°Cで15分間、70°Cで10分間(加熱カバー)、4°C保持;蓋85°C)。
4. 磁気ビーズ精製を行います。
   1. 低吸着遠心チューブ1.5 mLを取り、88 μLの均質化磁気ビーズと110 μLのアダプターライゲーション生成物を加えます。ボルテックスしてよく混ぜ、室温で5分間インキュベートします。
   2. インキュベートしたサンプルをすぐに1〜3秒間遠心分離し、遠心分離管を磁気ラックに置きます。溶液が透明になるのを待ちます(約3〜5分)。
   3. チューブを磁石に固定した状態で、キャップを開き、ビーズペレットを乱さずにピペットを使用して除去した上清を慎重に吸引します。
   4. チューブを磁石に固定し、各チューブに300 μLの新しく調製した75%エタノールを加えます。
   5. 磁気ビーズが完全に沈殿するまで1分間待ちます。遠心分離管を水平にゆっくりと一度回転させてエタノールを吸収します。
   6. 手順2.4.4と2.4.5を1回繰り返し、合計2回繰り返します。
   7. 瞬間遠心分離を1〜3秒間行い、チューブを磁気ラックに戻し、30秒待ちます。ピペットを使用して残留エタノールを取り除き、チューブカバーを開いたままにします。
   8. 磁気ビーズを室温で2分間乾燥させ、ビーズ表面がつや消しになり、ひび割れが見られないまで乾燥させます。
   9. ライゲーション産物を28 μLの溶出バッファー(EB)で溶出します。
      注:磁気ビーズは、使用前に室温で少なくとも30分間平衡化する必要があります。
5. 以下に説明するように、プレライブラリを増幅および精製します。
   1. 10 μLのPCRバッファー、10 μLのPCRプライマー、1.5 μLのdNTPミックス、1 μLのPCR酵素を加えて、反応システムのプレミックスを調製します。3x-5xを軽く手動で軽くたたき、遠心分離機で1〜3秒間分離します。
   2. 前のステップで精製した生成物27.5 μLに22.5 μLのプレミックスを加え、穏やかに混合し、1〜3秒間遠心分離します。
   3. プログラムPRE:98°C45秒を選択します。(98°C 15秒、60°C 30秒、72°C 30秒)12サイクル;72°C2分;4°C保持;蓋105°C。
   4. PCRプログラムが完了したら、新たに調製した75%エタノールを使用して磁気ビーズ精製を実行します。18 μLのEBで製品を溶出します。
6. 以下で説明するようにハイブリッドをキャプチャします。
   1. 15 μLのプレライブラリーと4 μLのブロッカーミックスを加えて、反応システムAを調製します。
   2. PCRに置き、PCRプログラムHYBを実行します(95°Cで5分間、65°C保持;蓋105°C)。
   3. 10 μLのハイブリダイゼーションバッファー、0.5 μLのRNase阻害剤ブロッカー、および1 μLのプローブを加えて、反応システムB HYBミックスを調製します。3x-5xを軽くフリックし、1〜3秒間遠心分離します。
      注:プローブ名はLCOO1で、プローブ遺伝子には EGFR、KRAS、BRAF、ALKなどが含まれます。
   4. PCR装置の温度が65°Cに下がったら、11.5 μLのHYB混合物を反応システムAに加え、穏やかに混合し、PCR装置の蓋を覆い、16〜24時間インキュベートを続けます。
   5. 洗浄バッファー2を15 mLのコニカルチューブで金属ヒーターで65°Cでサンプルあたり600 μLの投与量でインキュベートします。
   6. SCB磁気ビーズを回収し、5回反転して混合し、10秒間ボルテックスし、室温で30分間平衡化します。10秒間ボルテックスし、25 μLを1.5 mLの低吸着遠心分離管に移し、磁気ラックに3分間置き、上清を廃棄します。
   7. 200 μLのビーズ洗浄バッファーを25 μLのSCB磁気ビーズに加え、ボルテックスして3秒間混合し、1〜3秒間瞬間遠心分離し、磁気ラックに3分間放置し、上清を廃棄します。
   8. 手順2.6.7を2回、合計3回繰り返します。
   9. 200 μLのビーズ洗浄バッファーを磁気ビーズに加え、ボルテックスして3秒間混合し、後で使用するために再懸濁します。
   10. 約30 μLのハイブリッドサンプルを再懸濁したSCB磁気ビーズに移し、ボルテックスして混合し、回転ミキサーに置き、室温で30分間インキュベートし、1〜3秒間遠心分離します。
   11. 混合チューブを磁気ラックに3分間置き、約230 μLの上清を吸引します。500 μLの洗浄バッファー1を加え、5秒間ボルテックスし、ロータリーミキサーに置き、室温で15分間インキュベートします。瞬間遠心分離機で1〜3秒。
   12. 磁気ビーズサンプル混合チューブを磁気ラックに置き、3分間放置します。次に、約500 μLの上清と残留液体を吸引します。
   13. 150 μLの洗浄バッファーを2〜65°Cに予熱し、10秒間ボルテックスし、恒温ミキサーに置き、振とうし、65°Cで600 rpmの速度で10分間インキュベートします。1〜3秒間瞬時遠心分離を行い、磁気ラックに3分間置き、約150 μLの上清と残留液体を吸引します。
   14. 手順2.6.13を3回、合計4回繰り返します。
   15. 瞬時に1〜3秒間遠心分離し、サンプルチューブから残留液体を除去します。20 μL EBを加え、8x-10x上下に混ぜ合わせ、よく混ぜて、後で使用するために氷の上に置きます。
7. 最終ライブラリーの調製と精製
   1. 25 μLの増幅ミックス、5 μLのインデックス、および20 μLの磁気ビーズライブラリーを添加して、反応システムPOSTミックスを調製します。3x-5xを軽くたたき、1〜3秒間遠心分離します。穏やかに混合し、1〜3秒間遠心分離します。
   2. プログラムを選択 POST: 98 °C 45 秒;(98°C 15秒、60°C 30秒、72°C 30秒)12サイクル;72°C10分;4°C保持;蓋105°C。
   3. PCRプログラムが完了したら、新たに調製した75%エタノールを使用して磁気ビーズ精製を実行します。最終ライブラリーを20 μLのEBで溶出します。

3. 完全自動ライブラリ調製(表5)

1. 電源ボタンを押してシステムをアクティブにし、初期化を待ちます。[プログラム設定]に移動し、[プロトコルの実行]を選択し、[プロトコル:Burning Rock HS]を選択します。
2. アリコートのQCパラメータをサンプルタイプ:高品質DNAとして設定します。入力量(ng):50;PCR前サイクル:12;PCR後のサイクル:12。[実行] をクリックします。
3. パッケージ化された試薬カートリッジを指定されたスロットに挿入します(試薬の配置と状態を自動的に検証します)。
4. サンプルをロードした後、[ 開始 ] を押してシステムを自律的に実行します。LEDインジケーターを観察して、進行状況を監視します。
5. プログラムが終了したら、[ OK ]をクリックすると、プログラムは自動的に最終ライブラリをライブラリチューブに転送し、ライブラリの準備を完了します。

4. シーケンスとQC

1. 以下に説明するように、ライブラリの定量とQCを実行します。
   1. 蛍光測定法を使用して、プレライブラリー濃度と総ライブラリー濃度を測定します。
   2. ライブラリのフラグメントサイズを検出します。キットを使用して、ライブラリのフラグメントサイズとアダプターの存在を評価します(材料表)。
      注:最終ライブラリにプライマー二量体が含まれている場合は、マシンでサンプルを混合する前に、追加の精製ステップを追加する必要があります。フラグメントを挿入するための適格標準は 150 bp ≥であり、予想される捕獲効率は 40 % ≥です。
   3. シーケンシング操作のために、シーケンシングライブラリを1.6 pMおよび1300 μLに希釈します。
2. 以下に説明するようにシーケンス環境モニタリングを実行します。
   1. 室内温度(19〜25°C)、室内湿度(20%〜80%)などのシーケンス環境を制御します。
   2. Q30を超えるベース、クラスター密度通過フィルター(PF)を含む完全な機器出力データQC。

5. シーケンスデータ分析とQC

1. 以下に説明するように、生データ処理と分子プロファイリングを実行します。
   1. Burrows-Wheeler Aligner(バージョン0.7.10)を使用して、シーケンスデータをhg19にアライメントします。
   2. Genome Analysis Tool Kit(バージョン3.2)およびVardict(バージョン1.5.1)を使用して、局所アライメント、最適化、重複マーキング、およびバリアント呼び出しを実行します。
   3. VarScan(バージョン2.4.3)fpfilterパイプラインを使用してバリアントをフィルタリングし、深さが50未満の遺伝子座を削除します。ExAC、1000 Genomes、dbSNP、またはESP6500SI-V2データベースで母集団頻度が0.1%を超えるバリアントを一塩基多型(SNP)として分類および除外します。
   4. 残りのバリアントには、SnpEff(バージョン3.6)を使用して注釈を付けます。
   5. MarkSV(Burning Rockアルゴリズムツール)を使用して、大規模ゲノム再構成(LGR)を含む構造変異体(SV)を解析します。キャプチャ間隔のカバレッジデータの深さに基づいてコピー数バリアント(CNV)を分析します。
   6. グアニン-シトシン含有量とプローブ設計に起因するシーケンスバイアスのカバレッジデータを補正します。
2. ²⁵で説明されているように、平均深さ、中央値深さ、固有深さ、インサートサイズ、libの複雑さ、カバレッジ、Q30比、対応のあるサンプル相関比などのサンプル品質を評価します。
3. レポート生成では、パイプラインのバージョンとパラメーターを確認して、バイオインフォマティクスのレビューを完了します。関連するガイドラインを使用して、変異の病原性を評価します^26,27。最終報告書を発行します。

結果

厳格な品質管理を備えた自動化されたNGS分析ワークフローを利用して、研究室はNSCLC検体の包括的なゲノムプロファイリングを実施しました。最適化された検出ワークフロー(図2)により、代表的な腫瘍サンプルで臨床的に実用的ないくつかのゲノム変化が確実に同定されました(図3)。

配列決定の結果は、有意なEGFR遺伝子コピー数増幅(CN=14.7)を伴う高頻度EGFR p.L858Rミスセンス変異(AF=89.25%)を示しました。さらに、MET遺伝子の中程度の増幅(CN=5.0)とBRAF遺伝子の低レベルの増幅(CN=3.8)が観察されました。分析されたパネルでは、他の病原性遺伝子変化は検出されませんでした。免疫療法関連のバイオマーカーに関しては、結果は中間の腫瘍変異負荷 (TMB=9.0 変異/Mb) およびマイクロサテライト安定...

ディスカッション

すべての適格なNGSレポートは、依然として複雑で時間のかかる厳格なプロセスの背後にあります²⁸。これらの問題に対処するために、研究所は完全に自動化されたNGSシステムを開発しました。この操作により、手動介入が大幅に削減され、実験エラーが最小限に抑えられ、ターンアラウンドタイムが大幅に短縮されます。したがって、このシステムはNGSにとってより信頼性が高く効率的な戦略を提供し、ゲノム研究におけるデータ品質に対する新しい考え方を確立しました。

統合システムは、ワークフロー全体にわたる包括的な自動化を特徴としており、処理効率と結果の信頼性を向上させます。まず、核酸抽出では、研究室では自動磁気ビーズベースの核酸抽出システムを使用して FFPE サンプルを処理します。病院の病理検査室で一般的なアーカイブ検体として、FFPE サンプルは重要な遡及的研究価値を持っていますが、核酸は損傷を受けやすく、従来の抽出プロセスは面倒です²⁹。こ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アジレント 高感度DNAキット	アジレント	5067-4626	the  での使用用;Agilent 2100 バイオアナライザーシステム
アジレント DNA 1000 試薬キット	アジレント	5067-1504	the  での使用用;Agilent 2100 バイオアナライザーシステム
Agilent 2100バイオアナライザー	アジレント	G2939A	ライブラリのフラグメントサイズとアダプターの有無を評価してください。
コンサート全自動核酸精製装置	コンサート	MC1002	DNA抽出に使用
Equalbit 1×dsDNA HSアッセイキット	ヴァイジーム	EQ121-02-AA	the  での使用用;Qubit 3.0 フルオロメーター
ヒトEGRR/KRAS/BRAF/ALK遺伝子統合検出キット	バーニングロック	BR-LC00102	図書館の建設
マグニスBR	アジレント・テクノロジーズ	G7595AA	自動NGSライブラリ作成
ME220 集束超音波計	コヴァリス	500396	超音波検査
ナノドロップワン/OneC	サーモ・フィッシャー	ND-ONE-W	全波長UV可視光分光光度検出
NextSeq 550Dx	イルミナ	20005715	順序
NSQ 500/550 ハイ出力KT v2.5(300CYS)	イルミナ	20024908	NextSeq 550Dxでの使用用
核酸抽出試薬	コンサート	RC1102	DNA抽出に使用
Qubit 3.0 フルオロメーター	生命	Q33216	核酸やライブラリー濃度検出に使用
Qubit dsDNA HSアッセイキット	生命	Q32851	the  での使用用;Qubit 3.0 フルオロメーター