Method Article

複数の発生源から4つの人獣共通感染症腸内寄生虫を同時に検出するための統合PCRベースの分子検出システム

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの統合分子検出システムの組み合わせに基づいて、複数の供給源から4つの人獣共通感染症腸内寄生虫を同時に検出するプロトコルを提示します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感染症は、人間の健康、経済発展、社会の安定に影響を与える重要な要素です。その中でも、人獣共通感染症腸寄生虫病は、特に クリプトスポリジウム、エン テロサイトゾオン・ビエネウシ、 ブラストシスチス、 ジアルジアなどの新興感染症として、ますます世界的な関心の焦点となっています。上記の寄生虫の疫学に関する研究はごくわずかしか発表されておらず、単一の検出対象、低い検出率、高い欠落検出率などの問題を伴いました。本研究は、特に地域の監視施設における動物と環境のインターフェースを含む複数のシナリオにおける日常的な寄生虫検出のための効率的な技術支援を提供するために、野生のマウス、コンパニオンペット、家畜(牛と羊)から採取されたサンプルから上記の4つの人獣共通感染腸内寄生虫を同時に検出するためのPCR検査の組み合わせに基づく統合分子検出システムの確立を目的としています。

本研究では、野生マウス95匹とイヌ30匹(ネコ25匹、イヌ5匹)の糞便中から Enterocytozoon bieneusi を検出した試験を一次試験とし、2セットのプライマーを使用してITS遺伝子を増幅したところ、各PCRの陽性結果はまったく同じ(5.26%)でしたが、2セットのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)検査を組み合わせた結果、 Enterocytozoon bieneusi の陽性率(6.32%)が高かった。 ジアルジアについては、ベータジアルジン(BG)遺伝子を使用して9つの陽性サンプルが検出されましたが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)およびトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)遺伝子を使用して陽性サンプルは検出されませんでした。以上の結果は、複数の標的遺伝子セグメントに対するPCR検査の組み合わせが、単一のPCR検査と比較して、指定された病原体の検出能力を高めることを実証しました。標的配列はサンガー配列決定によって確認されました。このシステムは、複数の発生源からの人獣共通感染症腸内寄生虫の感染状態、分布、系統発生進化の監視を強化および促進するように設計されており、早期に正確で高感度な警告の基礎を提供します。これは、人間、動物、環境のインターフェース全体でワンヘルスの目標を達成するための技術的な架け橋を構築することを目的としています。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クリプトスポリジウム、Enterocytozoon bieneusi、ブラストシスチス、およびジアルジアは、世界的に蔓延している一般的で無視されやすい原生動物病原体です。近年、自然病巣の生態学的ニッチへの埋め立てと侵入、コンパニオンアニマルの繁殖の人気、家畜や家禽の繁殖の発展などの要因により、げっ歯類、コンパニオンアニマル(猫と犬)、家畜(牛と羊)における多源人獣共通感染症腸寄生虫病の蔓延がますます注目されています。 国内および農村地域での感染症の発生と再出現は、人間の健康と世界の公衆衛生の安全を深刻に危険にさらしています 1,2,3,4。

これらの寄生虫は、複雑な属内種と広範な宿主適応性を持っています。げっ歯類、コンパニオンアニマル、家畜の反芻動物、家禽、鳥類だけでなく、人獣共通感染症にも感染する可能性があり、人間に感染し、腹痛、下痢、嘔吐などの臨床症状を引き起こす可能性があります。これらは、子供、高齢者、妊婦、および免疫不全の人々の間で特に影響を受けやすく、水、食物、および空気を介して伝染する可能性があり、重大な人獣共通感染症の公衆衛生上のリスクをもたらします3,5,6。

現在、上記の 4 つの寄生虫の同定は主に形態に依存しており、属内の形態学的類似性や主観的要因、特に種と遺伝子型の区別により誤認されやすいです。分子生物学技術は、これらの寄生虫の種、属、遺伝子型を特定するために広く使用されています。ブラストシスチスとクリプトスポリジウムの場合、検出は主に小サブユニットリボソームリボ核酸(SSU rRNA)遺伝子3,7,8に焦点を当てています。Enterocytozoon bieneusiの場合、内部転写スペーサー(ITS)遺伝子4,9;ジアルジアの場合、ベータジアルジン(BG)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)、およびトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)遺伝子10,11。ネストされた従来のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、これら4つの寄生虫の同定とタイピング能力を大幅に向上させましたが、見逃された症例を検出し、重要な遺伝的特徴を持つ新種または準種を識別するには不十分です。これは、人間、動物、その他の宿主における疫学調査、伝播、疾病管理の効率に影響を与えることが多く、人間、動物、環境の公衆衛生上の安全保障に大きな課題をもたらします。

これら4つの寄生虫は症状、感染経路、宿主範囲が類似しているため、検出漏れを回避し、遺伝的に大きな違いを持つ新種や準種を正確に識別しながら、効率的に検出するための統合分子システムはまだ存在していません。この研究は、マルチソースサンプル(野生マウス、コンパニオンアニマル、牛、羊)中の4つの人獣共通感染症腸内寄生虫を同時に検出するために、文献をレビューすることにより、PCRハイスループットシーケンシング技術に基づく成熟した統合分子検出システムを確立しました。バイオインフォマティクス分析と組み合わせて、このシステムを適用して、複数の発生源の人獣共通感染症腸内寄生虫を特定し、感染分布や系統発生の進化などの疫学的要因を監視し、ヒトや動物の感染や環境汚染を早期に警告しました。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、江蘇省疾病管理予防センターの動物倫理委員会によって承認され、実施されました。この研究は、動物安楽死に関する米国獣医師会ガイドラインの2020年版、実験動物の管理に関する規則の指導原則(中華人民共和国国家科学技術委員会命令第2号、1988年)、および中華人民共和国科学技術部が発行した動物の人道的扱いに関する指導原則に従って実施されました。

1. 野生のマウス、コンパニオンアニマル、家畜(牛、羊)の新鮮な糞便の調製

  1. 透明な気密プラスチックの箱に入った缶詰の圧縮二酸化炭素源からの二酸化炭素吸入によってマウスを麻酔し、毎分容器容量の30%〜70%の交換率で行います。完全な麻酔と昏睡状態の後、マウスに頸部脱臼を行います。
  2. 新鮮な糞便サンプルの収集:排便後1時間以内に犬、猫、牛、羊から糞便サンプルを動物の糞便ごとに1本のチューブで収集し、相互汚染を避けます。
    1. さまざまな野生の生息地で放出装置を備えた餌ケージを使用してげっ歯類を捕獲します。捕獲したマウスをマウスバッグに入れ、速やかに研究室に運びます。バイオセーフティキャビネット内で無菌操作下で、マウスを解剖して糞便を含む直腸を採取し、2 mLのクライオチューブに入れ、後で検出するために-80°Cで保存します。
    2. 研究対象として、さまざまな地域のペットショップから犬や猫を選びます。排泄したばかりの糞便をすぐに5 mLのクライオチューブに回収し、完全なサンプル情報で標識し、-80°Cで保管するために速やかに実験室に輸送します。
    3. 畜産農場(集約的または放し飼い)の牛と羊を研究対象として選択します。排泄したばかりの糞便をすぐに50 mLのクライオチューブに集め、完全なサンプル情報でラベル付けし、-80°Cで保管するために速やかに実験室に輸送します。

2. 野生マウス、コンパニオンアニマル、家畜(牛、羊)の新鮮な糞便からの全DNAの抽出

  1. 糞便の前処理:
    注:QIAamp Fast DNA Stool Mini Kitを使用しました。
    1. バイオセーフティキャビネットでの無菌操作下で、さまざまな供給源からの約200mgの糞便をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液に加え、スチールビーズを加え、ティッシュグラインダーを使用して完全に均質化します。
    2. これを70°Cで5分間加熱し、室温(15〜25°C)で10,000× gで10分間遠心分離します。
    3. 25 μLのプロテイナーゼKを含む2 mLの遠心分離管に600 μLの上清を加え、600 μLのバッファーALを加え、15秒間ボルテックスします。
    4. 70°Cで10分間インキュベートします。600 μLの100%無水エタノールをライセートとボルテックスに加えて混合します。
  2. 600 μLのライセートをスピンカラムに慎重に加え、14000 × g で1分間遠心分離し、スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブに入れます。この手順をもう一度繰り返します。
  3. スピンカラムを慎重に開き、500 μLのバッファーAW1を加え、最高速度で1分間遠心分離し、スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブに入れます。スピンカラムを慎重に開き、500 μLのバッファーAW2を加え、最高速度で3分間遠心分離します。
  4. スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブ(別途調製)に入れ、14000 × g で3分間遠心分離します。スピンカラムを新しい標識付き1.5 mL遠心分離管に入れ、100 μLの溶出バッファーをスピンカラムメンブレンに直接加えます。
  5. 室温(15〜25°C)で1分間インキュベートし、14000 × g で1分間遠心分離してDNAを溶出します。
  6. 超微量分光光度計を使用してDNAの濃度と純度を測定します。抽出したDNAをその後の検出に使用するか、-20°Cで保存して長期保存します。
    注: 抽出された DNA の完全性と純度を確保するには、A260/A280 比を 1.8-2.0 にする必要があります。

3. 低分子サブユニットリボソームRNA(SSU rRNA)を標的とする クリプトスポリジウム と ブラストシスチスの ネストされた従来のPCR検出

注:このステップにはDream Taq Green PCR Mixを使用しました。

  1. PCRミックスを使用して氷上でPCR反応システムを調製します:25 μLの2× Taqバッファー、2 μLのフォワードプライマーとリバースプライマー各2 μL、16 μLのddH2O、および5 μLのテンプレート、総容量50 μL。
  2. クリプトスポリジウムの場合は、手順 3.2.1 から 3.2.2 に従います。
    1. F1R11 および F-1R1-1 8,11 を第 1 ラウンド反応プライマーとして使用します。反応プログラムを設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間の変性を30サイクル、55°Cで40秒間アニーリング、72°Cで90秒間伸長し、72°Cで7分間伸長します。
    2. F2R21 および F-1R2-1 8,11 を第 2 ラウンドのプライマーとして使用し、次の反応プログラムを行います: 94 °C で 5 分間の初期変性、94 °C で 40 秒間の 30 サイクルの変性、55 °C で 40 秒間のアニーリング、72 °C で 1 分間の伸長、72 °C で 7 分間の最終伸長。
  3. ブラストシスティスの場合は、手順3.3.1〜3.3.4に従ってください。
    1. F1R13 および F1-1R-1 3,12 を第 1 ラウンド反応プライマーとして使用します。F1R1の反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間の変性を30サイクル、60°Cで40秒間アニーリング、72°Cで100秒間伸長し、72°Cで7分間の最終伸長。
    2. F1-1R-1の反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間30サイクルの変性、55°Cで40秒間アニーリング、72°Cで1分間伸長、72°Cで7分間の最終伸長。
    3. F2R23 と F2-1R-1 3,12 を第 2 ラウンドのプライマーとして使用します。F2R2の反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間変性を30サイクル、60°Cで40秒間アニーリング、72°Cで1分間伸長、72°Cで7分間の最終伸長。
    4. F2-1R-1の反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間30サイクルの変性、55°Cで40秒間アニーリング、72°Cで50秒間伸長、72°Cで7分間の最終伸長。
      注:プライマー配列を 表11、3、8、11、12に示します。
病原体予想される製品サイズ(bp)プライマー配列(5'-3')参照
クリプトスポリジウム830F1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
F2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: ガカタットキャットカグttctガック8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
ブラストシスチス600F1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTAACTGCAACACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

表1:クリプトスポリジウムとブラストシスチスのSSU rRNAのプライマー配列。

4. Enterocytozoon bieneusi ITS遺伝子、ジ アルジア BG、GDH、TPI遺伝子のネストされた従来のPCR検出

注:このステップにはDream Taq Green PCR Mixを使用しました。

  1. PCRミックスを使用して氷上でPCR反応システムを調製します:25 μLの2× Taqバッファー、フォワードプライマーとリバースプライマー各2 μL、16 μLのddH2O、および5 μLのテンプレート、総容量50 μL。
  2. Enterocytozoon bieneusiの場合は、手順4.2.1〜4.2.2に従ってください。
    1. F1R19 および F1-1R1-12 を第 1 ラウンド反応プライマーとして使用します。反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間の変性を30サイクル、55°Cで40秒間アニーリング、72°Cで50秒間伸長し、72°Cで7分間の最終伸長。
    2. F2R29 およびF2-1R2-12 を第2ラウンドプライマーとして使用し、反応プログラムは次のようになります:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間の30サイクルの変性、55°Cで40秒間のアニーリング、72°Cで50秒間伸長、72°Cで7分間の最終伸長。
  3. ジアルジアの場合は、手順 4.3.1 から 4.3.3 に従います。
    1. BG-F1R1、GDH-F1R1、およびTPI-F1R1 2,10を3つの標的遺伝子の第1ラウンド反応プライマーとして使用します。すべての第1ラウンドの反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間変性を30サイクル、50°Cで40秒間アニーリング、72°Cで1分間伸長、72°Cで7分間の最終伸長。
    2. BG-F2R2 2,10およびTPI-F2R2 2,10の第2ラウンド反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間の変性を30サイクル、55°Cで40秒間アニーリング、72°Cで50秒間伸長、72°Cで7分間の最終伸長。
    3. GDH-F2R2 2,10の第2ラウンド反応プログラムを次のように設定します:94°Cで5分間の初期変性、94°Cで40秒間30サイクルの変性、60°Cで40秒間アニーリング、72°Cで50秒間伸長、72°Cで7分間の最終伸長。
      注:プライマー配列を 表22、9、10に示します。
病原体予想される製品サイズ(bp)プライマー配列(5'-3')参照
Enterocytozoon bieneusi390F1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
ジアルジア511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2:CTCGACGAGCTTCGTGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530TPI-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

表2: Enterocytozoon bieneusi ITS遺伝子、および Giardia BG、GDH、およびTPI遺伝子のプライマー配列。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスクリ プトスポリジウム、 ブラストシスチス SSU rRNA遺伝子、 Enterocytozoon bieneusi ITS遺伝子、 Giardia BG遺伝子PCR検査結果
マウスの直腸糞便サンプル95個すべてを2セットのプライマーを使用してEnterocytozoon bieneusiのITS遺伝子についてテストしたところ、各方法で5つの陽性サンプルが得られ、合計6つの陽性サンプルが得られました。図1では、レーン1〜6および7〜12に、それぞれ1セットのプライマーを使用して、2つの異なるPCRからのPCR産物をロードしました。各PCR検査では、異なる陽性サンプルが見逃されま...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クリプトスポリジウム、Enterocytozoon bieneusi、Blastocystis、およびGiardiaは、一般的な人獣共通感染症の腸内寄生虫です。最初の2つは米国国立衛生研究所(NIH)によってカテゴリーBの生物学的病原体に分類され、4つすべては世界保健機関(WHO)によって世界で最も重要な24の食品媒介性寄生虫としてリストされています。それらは潜在的に人間や動物に感染し、環境を汚染する可能性があり、病気の発生を引き起こし、公衆衛生の安全に重大な影響を与える可能性があります13。現在、感染性寄生虫の同定は主に技術者による形態分析に依存しており、主観的で時間がかかり、効率が低いです。したがって、既存の検出技術を統合して、マルチソースサンプル中の4つの人獣共通感染症腸内寄生虫と他の寄生虫を同時に検出するためのPCRハイスループットシーケンシング技術に基づく効率的な統合分子検出システムを確立することが急務です。

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、江蘇省衛生健康委員会 (助成金番号) によって支援されました。Ym2023024)、塩城市医学研究プロジェクト(助成金番号。YK2023085)、および新興および再出現感染症の病原性微生物学の主要研究所(江蘇省疾病管理予防センター)のオープンファンド(PM202402)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アガロース 清客技術TSJ001
Qiaquickジェル抽出キットQiagen 28704DNAゲル抽出キット
100 bp プラス DNA ラダーTransGen バイオ テクノロジーBM311DNAラダー
4Sグリーンプラス核酸染色BBIA616696-0500DNA染色
10回以上;TBEバッファソーラービオT1051電気泳動緩衝器
キュービット4.0熱https://www.thermofisher.com/in/en/home
/インダストリアル/分光-元素
-同位体分析/分子分光/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s&s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!!77516061528018!!380468
453!1240249321530142&cid=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		蛍光定量機器
ミニスペース1000タノンhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
タイプ=詳細		ゲルイメージャー
 DNA抽出用Fast DNA Stool Miniキット奇アゲン51604核酸抽出キット
ProFlexベース熱https://www.thermofisher.com/
英語/ホーム/ライフサイエンス/PCR/
サーマルサイクラー-リアルタイム-
計器/サーマルサイクラー
/proflex-pcr-system.html		PCR
ドリームタックグリーンPCRミックス熱K1082PCR増幅 

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