下肢虚血治療のための脛骨皮質横移動のラットモデル

サマリー

この手法はラットにおける脛骨皮質の横移動を示し、四肢虚血中の血管再構築の可視化と解析を可能にします。

要約

脛骨皮質横輸送(TTT)は、虚血性下肢の血行再形成を促進するために用いられる新興の外科技術です。このビデオでは、皮質骨片の外科的作製、輸送プロトコル、術後の評価を詳細に説明したTTTの再現可能なラットモデルを紹介しています。この手技により、骨片の制御された上下移動が可能となり、血管新生反応を刺激します。術後1日目、7日目、12日目に取得した代表的なX線画像と、安楽死後19日目に行われた微小血管灌流画像では、TTT後の骨片の動きが明確で、四肢灌流の改善が確認されました。

このモデルは、TTT誘発血管新生の分子メカニズムを調査し、虚血性疾患の治療戦略の可能性を評価するための実用的かつ再現性の高いプラットフォームを提供します。このモデルを構築するために、スプラグ・ドーリーラットを対象とした臨床TTT手技をシミュレーションし、3つの主要な外科的ステップを含みました:表層大腿動脈の結紮、皮質骨断片の生成と動員、そしてカスタム外固定器の適用です。12日間にわたり、破片は徐々に前後に運ばれました。灌流イメージングにより、輸送サイクル完了後の虚血性肢の血管形成が強化されていることが確認されました。全体として、この標準化されたラットモデルは臨床TTT手技を非常によく模倣しており、虚血性四肢の状態における機械的導入、血管新生、血管再生の研究に価値ある実験システムを提供します。

概要

動脈硬化性動脈硬化(ASO)、血栓性血管炎(TAO)、糖尿病性足(DF)などの下肢虚血性疾患は、下肢への動脈血流が制限されることを特徴とします^1,2。初期段階では、患者は通常間欠性のクルージケーションや安静時の痛みを感じます。病気が進行すると、虚血が長引くと組織壊死、感染、重症の場合は四肢切断を引き起こすこともあります^。現在の標準治療(薬物療法、血管内介入、開腹手術など)は、特に進行期において効果が限定的であることが多い³。

脛骨皮質横輸送(TTT)は、さまざまな下肢虚血性疾患の治療における革新的な治療戦略^です。イリザロフ法と「張力・ストレスの^法則」5,6に根ざしたこの技術は、骨切開術を通じて脛骨に可動皮質皮質皮弁片を作ることを含みます。その後、骨、血管、周囲の軟部組織の再生を刺激するために、連続的かつゆっくりとした制御された気分を引く力が加わります。この再生プロセスは微小循環の再構築を促進し、影響を受けた肢の酸素供給のバランスを回復するのに役立ちます。最終的に、TTTは虚^{血組織における}血液灌流と機能回復の改善につながります7.

下肢虚血に対する従来の血管再建技術は、ふくらはぎの大きな動脈の血流を回復できますが、足の小さな動脈の血行再生や損傷した微血管の修復・再生を促進するには効果が乏しく、欠血を完全に解決する能力を制限^します。TTTは骨および周囲の軟組織に継続的に牽引を加え、化学変化因子とサイトカインの強力な放出を誘導^{します9。}これらの化学活性因子は幹細胞のさまざまな機能を調節し、虚血条件下では循環に豊富に分泌されます。彼らは損傷部位に内因性幹細胞を積極的に誘導し、直接的な幹細胞移植を必要とせずに血管修復と再生を促進します。これらの利点により、TTTは下肢虚血の有望な治療戦略として浮上し、下肢に影響を与える多様な虚血状態の治療にますます用いられています^7,9,10。

ウサギや犬は基礎的なTTT研究で一般的に用いられていますが、これらの種に適した分析ツールが不足しているため、メカニズム的調査は制限されています。対照的に、ラットTTTモデルは、実用性と低コストを維持しつつ、分子およびイメージング技術との互換性を高め、機構研究においてよりアクセスしやすく再現性の高いプラットフォームとなっています。しかし、これまでのところ、下肢虚血のラットモデルにおけるTTTの有効性を体系的に記述または評価した研究はありません。

ラットTTTモデルは脛骨の大きさが小さく皮質が薄いため、洗練された顕微外科的技術が必要であり、その注意引っこ範囲は皮質の厚さによって制限されます。これらの実務的な制約は、モデルが特定の研究環境に適合しているかどうかを評価する際に考慮すべきです。

本研究では、臨床脛骨横輸送装置の核心構造と操作原理を再現し、ラット特有のTTTモデルを開発しました。この手順は臨床的に検証されたプロトコルから改良され、小動物における実現可能性と一貫性を確保しました。私たちの目的は、虚血性肢疾患における血管新生および機械伝達の研究に適した標準化かつ再現性のあるラットTTTモデルを確立し検証することです。

プロトコル

すべての動物実験は広西医科大学第一附属病院動物倫理委員会(承認番号2025-E0642)によって承認されました。オスのスプラグ・ドーリーラット(300〜350g)は、標準化された条件下で広西医科大学動物研究センターに収容されました。ラットには自由に通常の食事と清潔な飲料水が提供され、12時間の人工照明/暗夜サイクルで維持されました。動物施設は20〜26°Cの管理温度、相対湿度40%〜70%に保たれていました。すべての手術器具は使用前に徹底的に滅菌されました。本研究で使用されるすべての試薬および材料の詳細は 表1に記載されています。

安楽死は、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与を腹膜内注射で行いました。死は心拍と呼吸の永久停止、瞳孔の拡張、有害刺激への反応の欠如によって確認された。すべての手続きは訓練を受けた職員によって行われ、動物の苦痛を最小限に抑えるために行われ、安楽死プロトコルは事前に施設動物ケア・利用委員会によって審査・承認されていました。

1. TTT用の外固定器

1. 骨片牽引ユニットと外固定フレームからなる、臨床脛骨皮質横移動外固定器(TTT-EF)を縮小・カスタム設計したバージョンを使用します。
2. 内部のねじ山機構を組み込むことで、両方のコンポーネントの垂直移動を可能にします(図1)。
3. 牽引ユニットと固定フレームの断面の両側に2つの貫通穴を開け、キルシュナーワイヤーの挿入を可能にします。
4. キルシュナーワイヤーを指定された穴に挿入し、安定性を確保するために六角ねじで横方向に固定します。
5. TTT-EFの牽引部品を0.8mmのキルシュナーワイヤーで骨片に接続します。
6. 固定部を脛骨の近位端と遠位端に1.0mmのキルシュナーワイヤーで固定します。

2. 手術

1. 8週齢のオスのスプラグ・ドーリー(SD)ラットにTTT手術を実施します。ラットには0.35 mg/kgのペントバルビタールナトリウムと0.3 mg/kgのクロラール水和物を腹腔内注射で麻酔します。
2. 足筋の離脱反射と角膜反射を検査して麻酔効果を評価してください。処置中はバイタルサインと麻酔の深さを継続的に監視してください。手術前にラットの目に眼軟膏を塗布し、角膜を保護するために、実験動物使用ガイドラインに従ってください。
3. 手術部位を剃り、0.5%リドカインを投与して術後の痛みを軽減します。
4. No.11メスを使って右鼠径部に10mmの皮膚切開をします。
5. 筋膜を鈍く切り離し、浅大腿動脈を露出させます。
6. 眼底鉗子を使って大腿神経と浅大腿静脈の間の動脈を隔離します。動脈の両端を結紮し、横断します。
7. 切開部は4-0吸収性縫合糸で縫合します。
8. No.11メスを使って内側上脛骨に垂直に15mmの切開を入れます。
9. 皮下組織と下部の筋肉を慎重に分離し、骨膜損傷を防ぎましょう。軟部組織を優しく解剖し、内側脛骨表面を完全に露出させます。
10. 手術用ブレードを使って内側脛骨面の骨片面積(8 mm× 4 mm)を輪郭付けます。0.6mmのドリルビットを使って、マークされた境界に沿って密に間隔をあけた穿孔を掘ります。上内側脛骨に骨の窓片(8 mm × 4 mm)を作ります。
11. 骨片に0.8mmのねじ込みキルシュナーワイヤーを2本、間隔0.5mmで埋め込み、輸送を容易にします。キルシュナーの配線をTTT-EFに接続し、固定してください。
12. 断片の両側に1.0mmのキルシュナーワイヤーを2本挿入し、脛骨の後皮質を貫通します。
13. TTT-EFを組み立てて取り付けてください。
14. 眼科用のハサミを使って、印のある線に沿って骨切り術を行います。
15. 骨片を優しく持ち上げて垂直移動を可能にし、骨髄損傷を避けます。
16. 手術部位に10%ポビドンヨウ素で洗浄し、その後無菌生理食塩水を投与します。
17. 切開部は4-0吸収性縫合糸で層状に縫合します。
18. 手術直後にブプレノルフィン(0.05 mg/kg)を皮下投与。効果的な鎮痛を確保するために、最大3日間、12時間ごとに投与を続けてください。

3. 術後モニタリング

1. 手術後は動物を注意深く観察し、適切な回復を確保し、合併症の早期発見を図りましょう。術後最初の48時間は6〜8時間ごとに動物を検査してください。一般的な活動、姿勢、グルーミング行動、食事と水分の摂取量、手術的切開の状態を評価します。
2. 術後3日目から気を散らす段階と癒着段階にかけて、少なくとも1日1回はモニタリングを行いましょう。正常な歩行、安定した体重、安定した食事と水分の摂取、創傷の分泌物、過度の腫れ、または痛みの行動兆候がないことを確認し、十分な回復を確認しましょう。
3. 必要に応じて、機関のガイドラインに従って鎮痛を継続してください。
4. 創傷感染(例:紅斑、腫れ、膿性分泌物)は、獣医師の指示に従い局所的な創傷ケアと全身抗生物質で治療してください。
5. 短時間の麻酔下で外固定器の緩みやずれを直して位置を保ち、正確な注意をそらすために矯正してください。
6. 潜在的な合併症があれば迅速に評価し、対処しましょう。重篤な合併症で移動、摂食、創傷治癒に影響を及ぼす動物は、獣医スタッフと相談の上で評価してください。
7. あらかじめ定められた人道的エンドポイント基準を満たす動物は人道的に安楽死させてください。

4. 骨片輸送プロトコル

1. 脛骨皮質横移動外固定器(TTT-EF)を使用して術後の骨片輸送を行います。
2. 手術後1日目を潜伏期間と指定してください。
   注意:この期間中は骨片を操作しないでください。
3. 2日目に上方輸送フェーズを開始します。骨片を12時間ごとに0.5mmの速度で5日間連続で前進させます(2日目から6日目)。7日目は輸送を一時停止し、安定化を待ってください。
4. 8日目に下降輸送フェーズを開始します。
5. 骨片を12時間ごとに0.5mmの同じ速度で5日間(8日目から12日目まで)引き抜きます。12日目の終わりまでに骨片が元の位置に戻るようにしてください。
6. 2日間の統合フェーズ(13日目〜14日目)を続け、それ以上の輸送はありません。
7. 固定段階の終わりに外固定器を取り外します。
   注:TTT輸送手順および評価スケジュールの視覚的なタイムラインについては 図2 を参照してください。

5. 評価

注意:骨片の位置と血流回復の両方を評価するために画像診断技術を使用してください。

1. 1日目、7日目、12日目に下肢のX線画像検査を行い、運搬された骨片の進行と最終位置を監視します。
   1. ラットには、指定された画像撮影時に酸素入り2.0%イソフルランを用いて麻酔を行います。
   2. 低体温症を防ぐために、各ラットを温めパッド付きの温度管理型画像プラットフォームに置きます。
   3. 呼吸数と足部反射を評価して麻酔深度を監視し、安定した固定を確保します。
   4. すべての動物で四肢と外固定器を標準化された配置に配置し、X線取得のばらつきを最小限に抑えます。
   5. 骨片のずれと位置の再配置を確認するためにX線画像を取得してください。
2. 術後19日目に下肢の微小血管灌流を評価するために血管灌流画像検査を実施します。
   1. ラットを安楽死させ、大腿動脈から造影剤を灌流して血管を観察します。
   2. 安楽死したラットは標準化された仰向け姿勢に置き、一貫した画像撮影環境を確保します。
   3. 造影剤を大腿動脈に灌流し、一定の室温条件下で完全な血管充填を可能にします。
   4. 血管画像検査を行い、微小血管構造と灌流の評価を行います。すべての標本が一貫して、四肢の向きと固定具の位置が一致していることを確認し、画像診断の再現性を支援します。
   5. 得られた画像を使って、下肢の血流と血管構造の回復を評価します。

結果

図3は、TTT治療による下肢虚血動物モデルの構築手順を示しています。私たちの手でこの手術は約90%の成功率を示しました。故障回数が限られていたのは、外固定具の緩みや術中の骨片骨折などの技術的な問題によるもので、その後の気をそらすことは不可能でした。このモデルは、浅大腿動脈を露出させ結紮して虚血を誘発することで確立されました(図3A)。その後、脛骨内側に皮膚と筋肉を切開して4 mm × 8mmの骨片を準備し、骨を露出させました(図3B)。骨片の指定部位は脛骨に記され、その後、これらの刻印に基づいて穴を開けて骨切り術が行われました(図3C,D)。骨切り術後、骨片を安定させるために固定ピンと外部フレームが取り付けられました(図3E,F)。

ディスカッション

麻酔および手術を伴うすべての処置は、動物の安全および施設の動物ケアガイドラインに細心の注意を払って行われました。麻酔の深さは切開前にペダル撤退検査や角膜反射検査で確認され、手術中は定期的にモニタリングされました。低体温症を防ぐために十分な熱サポート(例えば温熱パッド)が提供され、長時間の麻酔中は角膜を保護するために眼軟膏が塗布されました。

麻酔に関連する潜在的なリスクには、呼吸抑制、低体温症、回復遅延、偶発的な過剰摂取などが含まれていました。したがって、継続的な観察が不可欠であり、補助酸素を含む蘇生機器もすぐに利用可能でした。

手術リスクには主に出血、軟部組織損傷、手術部位の汚染、骨髄や神経血管構造への医原性損傷が含まれていました。これらのリスクを最小限に抑えるため、オペレーターは厳格な無菌技術を採用し、組織の扱いを穏やかにし、骨窓の正確な形成を確実にしました。意図しない骨髄貫通、過剰な皮質の乱れ、血行動態の不安定さは即座に対処されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロ横切り式リトラクター	天津新中医療機器有限公司	A61B17/66	骨片牽引を行う
小型整形外科用ドリル	燕城瑞耀科技有限公司	RA-II	脛骨ドリリング骨切開術のために
0.6mmステンレス製ドリルビット	常州ボルシュ医療機器有限公司	-	脛骨ドリリング骨切開術のために
0.8mmねじ山型キルシュナーワイヤー	常州ボルシュ医療機器有限公司	-	骨皮弁とリトラクターの取り付け用
1.0mmねじ型キルシュナーワイヤー	常州ボルシュ医療機器有限公司	-	リトラクターの固定のために
ペントバルビタールナトリウム	上海製薬控股有限公司	-	動物麻酔用
アレンキー	常州ボルシュ医療機器有限公司	-	ネジの固定用
ブプレノルフィン	上海製薬控股有限公司		鎮痛動物の場合
マイクロフィル	フローテック株式会社		動物の血管造影
イソフルラン	河北一品製薬有限公司		吸入麻酔の誘導および維持のために
塩酸リドカイン(0.5%)	河北一品製薬有限公司		局所浸潤に用いられ、術後の痛みを軽減し、手術中の組織刺激を最小限に抑えます