7日間の観察中の虚血性脳卒中と神経精神医学的合併症の覚醒ラットモデル

サマリー

覚醒ラットにおける局所性虚血性脳卒中の新しいモデルが提案されています。これはラットの頸動脈内に空気塞栓を注入することで達成されました。局所性虚血性脳卒中の発症は、トリフェニルテトラゾリウム塩化物による脳染色、機能検査、生理的パラメータの評価によって確認されました。

要約

ガス塞栓症によるラットの実験的脳卒中の翻訳モデルは、脳卒中の発生の特徴を明らかにし、新規治療法や実証済み薬剤の神経保護効果を評価するために構築されました。この中程度の時間と労力を要するプロトコルにより、覚醒した動物における急速なニューロン死の動態を観察でき、せん妄を含む急性脳卒中の評価や、血圧、体温、呼吸分量の変化などの自律神経障害のモニタリングに特有の機会を提供します。大気中の空気(100μL)は、外頸動脈 を経 由して総頸動脈に逆行挿入された血管カテーテルを通じて、点滴ポンプを用いて注入されました。塞栓術から24時間後、動物は典型的な行動、運動障害、組織病理学的な違いを示します。実験の7日目には神経学的な状態が有意に改善し、行動テストの結果は対照値に近づきました。同時に、虚血病変では好中球からマクロファージ浸潤への移行が観察されます。提案されたモデルは、脳卒中後の神経精神疾患の合併症と、それに伴う生理学的、機能的、組織病理学的変化を再現するため、前臨床研究で利用可能です。

概要

本研究の目的は、覚醒ラットにおける局所性脳虚血性脳卒中のモデルを開発し、このモデルをヒトにおける虚血性脳卒中の臨床的側面に最も近似することでした。Söylandらの研究によれば、覚醒状態で虚血性脳卒中の症状が顕著だった患者の62.6%が示され、覚醒時の脳卒中を経験したのはわずか19^{%でした。}したがって、動物における脳動脈塞栓術の際に覚醒状態が現れるかどうかが最も重要な関心事です。局所性脳虚血性脳卒中の研究に用いられる古典的なモデルには、経頭蓋閉塞、血管内フィラメント中大脳動脈閉塞、塞栓閉塞、エンドテリン1閉塞、光血栓症モデル²が含まれます。古典的なモデリング手法では、動物に麻酔の影響をさらし、虚血性脳卒中モデルのエンドポイントの歪みが生じる可能性があります。イソフルランは閉塞手術において最も迅速なガス麻酔法として広く使用されています ^3,4,5。しかし、24時間後の中脳動脈閉塞(MCAO)後の脳障害の程度は、動物におけるイソフルラン麻酔の持続時間に反比例することが判明しました。イソフルランは1,000以上の虚血関連差異発現遺伝子の発現6に影響を与え、これは完全に信頼できない虚血性脳卒中モデルを引き起こす可能性があります。

ラットにおける虚血性脳卒中モデリングの方法の一つは、血栓を内頸動脈に注入^{することです。}それにもかかわらず、このモデルにおける虚血性脳卒中の誘発は、カテーテル治療から1時間後にイソフルランで行われました。この前置条件付けが血栓投与の神経学的および生理学的結果の発達を妨げた可能性があると考えられます。

覚醒ラットにおける内頸動脈塞栓術と、その後中央大脳動脈盆地における局所性脳損傷を組み合わせる虚血性脳卒中をモデル化する別の方法が提案されています。カテーテルは虚血性脳卒中のモデル化の24時間前に行われました。これにより、塞栓投与の効果が麻酔によって影響を受けないようにされました。

提案モデルでは、虚血に対してエンドテリン-¹⁸、フィラメント⁹、凝固性色素¹⁰は使用していません。カテーテルで投与する薬剤の選択は、この方法が実現可能であり、動物を立体誘導フレームに固定して麻酔する必要が不要になるという前提^{に基づいていました。}

さらに、このモデルは塞栓直後の動物の生理学的および神経学的パラメータの観察を可能にします。虚血性脳卒中モデリングの代替手法はこれと互換性がないようです。文献では、虚血性脳卒中モデル化後の脳損傷および神経障害のエンドポイントは、閉塞後24時間後に評価されることが多いです(^{11、12、13、14})。

覚醒ラットを用いた虚血性脳卒中モデリングは、局所性虚血性脳卒中の従来のモデルに代わる追加または代替となる可能性があります。このアプローチは、虚血性脳卒中治療のための登録または開発中の医薬品の神経保護潜在力のより広範な調査を促進します。

プロトコル

この研究は研究所の標準作業手順に従って実施され、ロシア科学アカデミーシェミャキン・オフチニコフ生物有機化学研究所付属施設動物ケア・利用委員会の生命倫理委員会(2025年1月17日付議定書番号1016/25)によって承認されました。本研究では、生後10〜12週の28頭のオスSprague-Dawley(SD)ラットを使用し、平均体重301g、微生物学的状態は特定病原体フリー(SPF)でした。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 動物の調理

1. 生後10〜12週のオスSDラット28匹を使い、SPF状態のまま使います。偽グループには12頭の動物を、脳動脈ガス塞栓症(CAE)を伴う虚血性脳卒中をモデル化するために16頭の動物を用います。
2. すべての器具は消毒液(0.5%クロルヘキシジンビグルコン酸塩、70%エタノール)で24時間滅菌してください。
3. ラットには、ティレタミン15 mg/kgとゾラゼパム15 mg/kg+キシラジン塩酸塩10 mg/kgの混合物(機関承認プロトコルに従い)を筋肉内注射で麻酔します。
4. 麻酔の外科的段階が達成されているか確認してください:動物の目の端に触れ、尾の先端をつまみます。
   注意:これらの操作後に反射が見られない場合は、動物は麻酔状態とみなされます。
5. 腹側頸部の手術視野を摘み取ってください。
6. 動物を手術台に固定し、四肢と上切歯を柔らかい止血帯で固定します。
7. 直径0.8mmのポリエチレン管を10cmの長さの管に切り、先端で約5mm幅の安定化スパイラルをねじります。これは、ポリエチレン管の先端を金属管に通し、熱湯(90°C)に浸して作ります。チューブにヘパリン(50 ME)を充填します。螺旋の反対側は釣り糸で作ったプラグで封じます。
   注意:カテーテルは医療グレードのポリエチレンチューブで作られています。カテーテルを扱う際に、カテーテルを曲げたり挟んだりしないようにしてください。

2. 頸動脈カテーテル術

1. 動物の首の腹側に約5mmの長さの切開をします。
2. 鉗子を使って首の筋肉を切り離してください。頸動脈が外頸動脈と内頸動脈に分岐する部分を開けてください。
3. 気管に沿って走る動脈を見つけてください。動脈に沿って走る迷走神経には触れずに、鉗子で慎重に結合組織鞘から取り出してください。
4. 鉗子を使って外頸動脈の一部を隔離してください。
5. 総頸動脈の分岐部に3〜5mmの仮結紮を尾部に設置します。
6. 外頸動脈に2本の結紮をし、1本は分岐直後、もう1本は分岐から遠位4mmの位置に置きます。
   注意:カテーテル挿入はこれら2つの結紮間に行われます。分岐直後に挿入された結紮はカテーテルを血管内に固定します。
7. 内頸動脈には、総頸動脈の分岐部に一時的な頭蓋骨を一時的に固定します。
8. 分岐後、翼口蓋動脈に結紮をします。
   注意:ステップ2.7および2.8で結紮を施す際、総頸動脈の主幹の後ろに隠れた側支線の存在により出血が発生する可能性があります。この場合、結紮が必要です。
9. ハサミで結紮の間の外頸動脈に切開をします。準備済みカテーテル(ステップ1.7)を血管に開けた穴に挿入し、総頸動脈へと導きます。
10. 遠位結紮を外し、カテーテルを血管のさらに下まで押し込み、総頸動脈に入ります。カテーテルが内側にある外頸動脈の部分に慎重に2本の結紮を結びます。3つ目の結紮をカテーテルの前に置き、結びます。
    1. カテーテルをクッションリングに結びつけて固定します。頸動脈および外頸動脈の結紮を除去します。
       注意:カテーテルを押すと、血管から血液が漏れる可能性があります。
11. 血管から血液が漏れている場合は、血管の穴と3つ目の結紮の間に重複した結紮を設置します。
12. 溝のある針のディレクターで固定カテーテルを肩閏に導きます。
13. 腹部の傷口は4.0縫合材で縫合します。連続縫合を使いましょう。
14. 皮膚の背面側を4.0の縫合材でカテーテルの周りにしっかり縫合してください。連続縫合を使いましょう。カテーテルの外側に接着石膏を貼り付け、縫合部に結びつけてより確実に固定します。
15. 抗生物質シプロフロキサシンを5 mg/kgの用量で筋肉内投与します。

3. CAE群動物における局所性脳虚血モデリング

1. ラットカテーテル治療から24時間後、動物を実験動物の固定装置で覚醒状態に置き、肩に置かれたカテーテルにアクセスできるようにします。
2. 0.5mLの生理食塩水(0.9% NaCl)を30Gの針で満たした注射器を注入ポンプに挿入します。
3. 注射器の針を空のポリエチレンカテーテル(100μL容量)に接続します。ポリエチレンカテーテルのもう一方の端はアダプターを使って埋め込まれたカテーテルに接続します。
   注:適切なカテーテルの埋め込みと血栓の不在は、埋め込まれたカテーテルからヘパリンが空気を含むカテーテルに移され、空気がわずかに圧縮されることで証明されます。その理由は、ラットの血圧が接続されたカテーテル内の空気圧を上回っているためです。
4. 注入ポンプの注入速度を10 μL/minに設定します。注入ポンプの注入量を120μLに設定します。
5. 点滴ポンプを起動しろ。ポリエチレンカテーテルから100μLの空気と20μLの生理食塩水(0.9% NaCl)を注入します。
   注:注射は10分で完了します。この時、動物を観察してください。注射中、動物は鳴いたり、かじったり、またはイモビライザーを掘ったりすることができます。
6. 動物をイモビライザーから取り出してください。
7. 動物の神経状態を0-5のポイントスケールで即座に評価します:0=神経障害なし、1=前肢を完全にまっすぐにすることができない、2=回転、3=四肢の支持喪失、4=意識低下で自発歩行なし、5=死亡。
   注:より詳しい説明については、出典¹⁵を参照してください。空気が注入された直後に神経障害が現れない可能性もあります。これは、閉塞が動物の解剖学的特徴や高血圧によるものではなかったことを示しています。
8. 神経症状がなければ、その動物を実験から除外します。
   注:CAEのラットは神経学的欠損スケールで1〜4ポイントを示します。多くの場合、四肢の支えが失われたり、意識が落ち込んで自発的に歩けなかったりします。
9. 抗生物質シプロフロキサシンを5 mg/kgの用量で筋肉内投与します。

4. 生理的パラメータの評価

1. CAEから1時間後、0-5点スケールで動物の神経状態を評価します:0=神経障害なし、1=前肢を完全にまっすぐにできない、2=回転、3=四肢の支持喪失、4=意識低下での自発歩行なし、5=死亡¹⁵。
   注:1時間経過後は、気泡が急速に再吸収されるため、動物に症状が現れない場合があり、動脈塞栓が不十分だったことを示しています。
2. CAEから1時間後に神経症状がない場合(神経欠損スケール¹⁵で0点のラット)を実験から除外します。
3. 抗生物質シプロフロキサシンをCAE後24時間と48時間に筋肉内5 mg/kg投与します。
4. 生理的パラメータの評価のために、偽グループとCAEグループの動物をランダム化します。
5. CAE直前とCAE直後の3時間、24時間、4日、7日後にサトリウススケールでグラム単位の精度で動物を体重測定します。
6. CAE直前およびCAE直後3時間、24時間、4日、7日後に、動作範囲32°Cから42°Cのデジタル体温計を用いて測定します。
7. CAE直前およびCAE直後およびCAE後3時間、24時間、4日、7日後に、コンピュータ化されたシステムのテールカフを使って血圧と呼吸パラメータを非侵襲的に測定します。
   1. 加熱パッドを起動し、40°Cまで加熱します。
   2. 動物を動物の固定装置に入れ、温熱パッドの上に置きます。動物を3〜5分間落ち着かせます。
   3. 次に、動物の尾部から2〜3cmの位置に、心血管パラメータを測定するセンサー付きのカフを装着します。
   4. トランスデューサーの位置を調整し、腹側尾動脈の真下に設置してください。
   5. 信号が安定し、プログラムに心拍数が表示されていることを確認しましょう。信号の録音を始めてください。
   6. カフの圧力の蓄積を起動してください。
   7. カフ圧が完全に解放されるまで脈拍と収縮期血圧を記録します。
   8. 動物の心拍数の回復が明確に表示されるようにしましょう。
   9. ステップ4.4.3-4.4.5を繰り返します。あと2回、動物のイモビライザーから動物を解放します。
   10. 3つの測定値から平均脈拍と収縮期血圧を計算してください。
8. CAE直前およびCAE直後、3時間、24時間、4日、7日後に、血圧と呼吸パラメータをコンピュータシステムで測定します。
   1. 動物を自然な位置に片手で固定します。
   2. 動物の鼻にチューブをつなぐマスクを装着します。
      注意:動物がマスクで呼吸することに慣れるまでには時間がかかります。
   3. 動物を落ち着かせてください。
   4. 呼吸量と呼吸数を10秒記録してください。
   5. 録画中に動物がため息や飲み込んだりしないように注意してください。
   6. ステップ4.5.2-4.5.3をさらに2回繰り返します。
   7. 3つの測定から平均呼吸量と呼吸数を計算します。
   8. 呼吸分量は次の式で計算します:
      分呼吸量 = 呼吸数 × 呼吸量。

5. 機能的および行動的パラメータの評価

1. 動物の神経状態を0-5の点尺度で評価します:0=神経学的欠損なし、1=前肢を完全にまっすぐにすることができない、2=回転、3=四肢の支持喪失、4=意識低下で自発歩行なし、5=死亡¹⁵。
2. CAE直前およびCAE直後3時間、24時間、4日、7日後にRota-Rodで運動機能と協調性を評価します。
   1. 動物たちをロタロッド装置でテストするための訓練をしてください。
      1. 動物を固定された棒に5〜30秒置きます。
      2. 少なくとも10秒間固定された棒を保持できる動物は、約30秒間最小限の加速度で回転する棒の上で走らせます。
      3. 動物が適切な回転するロッドの上で自由に立てるようになるまで訓練を続けてください。
   2. 動物を直径7cmの回転水平棒に、最低速度1回転/分で置きます。
   3. 加速は10秒ごとに1回転、最大速度は60回転までです。
   4. ラットが回転棒に乗っていた時間を記録してください。
3. CAE直前およびCAE後3時間、24時間、4日、7日後にコンピュータ化されたシステムを用いてラットの運動活動を評価します。
   1. 動物を開けた野原の中央に置き、5分間移動距離とラットの活動時間を記録します。
4. CAE後3時間、24時間、4日、7日後に握力メーターで前肢の握力を評価してください。
   1. 動物の尾を掴み、前肢でバーを掴ませます。
   2. 動物をグレートに平行に引っ張り、ネズミがグレートを離すまで続けます。
   3. 3回挑戦して、最も高い結果を選びます。

6. S100カルシウム結合タンパク質B(S100b)レベルの評価

1. CAEモデル化前、CAE後24時間および7日後にラットの血清S100bレベルを測定します。
   1. 動物を実験用の動物固定装置に入れます。
   2. 加熱パッドを起動し、40°Cまで加熱します。
   3. 動物を実験用の動物固定装置の加熱パッドに置きます。動物が落ち着くまで5分間待ちましょう。
   4. 動物を横に寝かせます。
      注意:尾部の尾に尾静脈が見えるはずです。
   5. 尾静脈に静脈内カテーテルを挿入します。
   6. 1.5mLのチューブに1mLの血液を採取します。
   7. 血液を室温で40分間置いてください。
   8. 血液サンプルを4°Cで1500 x gの圧力で15分間遠心分離します。
   9. 自動ピペットで血清を別の1.5 mLチューブに採取します。
      注意:血清は透明で透明で、赤血球の混合が一切含まれていなければなりません。
   10. 適切なELISAキットを用いて酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で血清を分析します。

7. カテーテル除去

1. CAEから24時間後、ステップ5の検査後にカテーテル除去手術を行います。
   1. 動物を吸入チャンバーに置き、ガス麻酔システムと酸素濃縮器を接続し、イソフルランを2.5%〜3.5%の容量で酸素供給率3L/minにして1〜2分間投与します。
   2. 動物をマスクガス供給付きの加熱パッド(37.5°C)に移し、イソフルラン2%-3%の投与モード、酸素流量1.0-2.0 L/minを投与します。
   3. 傷口の縫合やカテーテルを傷つけずに旗を切る。
   4. カテーテルの外側を清掃し、消毒液(70%エタノールに0.5%クロルキシジンビグルコン酸塩)で処理してください。
   5. 前回の手術で縫合したものを首の腹側から外してください。切開部では鉗子を使ってカテーテルのらせんを優しく隔離します。
   6. カテーテルの長い端を腹側切開から引き抜きます。
   7. 分岐部とカテーテル挿入部の間の外頸動脈に結び目をつけた結び目をつけます。
   8. カテーテルを縛っている結び目を慎重に切り、鉗子でカテーテルを引き抜き、血管の結び目をきつく締めて結び直します。
   9. 結紮端をトリミングし、傷口を縫合します。連続縫合を使いましょう。

8. トリフェニルテトラゾリウム塩化物染色の評価

1. 閉塞から24時間後に偽群6匹とCAE群6匹に末期麻酔を投与し、CAE群6匹とCAE群10匹に、チラタミン15 mg/kgおよびゾラゼパム15 mg/kg+塩酸キシラジン10 mg/kgの筋内注射を用いて投与します。
2. 手術段階の麻酔が1.3で説明されている通りに達成されているか確認してください。
3. 2mLの注射器と24Gの針を使って尾大静脈から全血液採取を行います。
4. 脳組織を傷つけずに頭蓋骨の背側骨を開けてください。
5. 硬膜を調べてください。
6. 脳をマイクロトームブレードで前頭葉から2mm厚の前頭切片に切ります。
7. 切片を顕微鏡スライドに置きます。
8. スライスを1%トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)溶液に入れ、サーモスタットで37°Cで10〜12分間置きます。
9. すべての脳のセクションを調べてください。TTC染色の色の変化を観察してください。
   注意:損傷していない組織は鮮やかなピンク色に染まり、病変のある組織は淡いピンク色に染まります。
10. 両側からスライスを撮影してください。
11. スライスを10%中性の緩衝ホルマリン溶液に固定します。
12. 科学的画像解析のためにソフトウェアで局所病変の面積を推定します。

9. ヘマトキシリンおよびエオシン染色の評価

1. 脱水はエタノールの上層バッテリー(70%、80%、100%)で固定された脳のスライスを固定します。
2. 乾燥スライスをパラフィンに浸し、厚さ7mmに切ります。
3. ヘマトキシリンとエオシンで部分を染色します。
4. 透過式光学顕微鏡を用いた切片の顕微鏡分析を行うこと。

10. 統計解析

1. 統計プログラムで統計解析を行います。
2. 記述統計(平均の標準誤差±計算)を適用し、結果を可視化するグラフを作成します。
3. 各グループの正規性を確認した後、ダンカンのランク基準を用いて複数回比較を行います。
4. 5%の有意水準で差を判断してください。

結果

生存と全体的な状態
空気泡を投与した直後、すべてのラットは数秒間動揺状態と顕著な震えを示し、その後1〜2分間すべての運動活動が停止し意識を失いました。意識を取り戻してから10〜15分間、足の支えを失う動物もいました。

CAE後3時間の生存率は100%でしたが、24時間後には80%に減少し、^3日目 には60%となりました。塞栓術後最大7日経過した動物の追跡調査では新たな死亡は認められませんでした(図1A)。

体重
カテーテル挿入手術により、例外なくすべての動物で体重が減少しました。その結果、研究2日目に全グループの動物で負の体重増加が観察されました(図1C)。これは、カテーテル挿入期間中に全身麻酔を受けていたため、体重減少に同じ効果があったため...

ディスカッション

MCAOは、ラットにおける局所性虚血性脳卒中をモデル化する一般的な手法であり、血栓形成、中大脳動脈の局所的な痙攣、そしてフィラメント²による一時的な閉塞によって達成されます。これらのモデルの目的は、(1) 標準化された病変容積と面積¹⁷で神経脳組織¹⁶の局所アポトーシスを達成すること、(2) 動物の神経学的欠損を2〜^{7日間監視}することである。

空気投与の速度と量の選択は経験的に決定されました。以前の出版物では、¹⁹番の空気管理の速度と量の選択について扱われていました。予備実験では、総体積3 mL/kgの空気ボーラス注射を30秒ごとに100 μLのペースで投与しました。しかし、この投与方法は観察初期の数時間で動物が死亡する結果をもたらしました。総量と空気投与速度の両方が徐々に減少す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2 mLの針を持つ3成分注射器	レイコ	523222	23G
アラジン シングルインフュージョンポンプ	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ	AL-1000
シプロフロキサシン	ファーマヴェット	3897744	シプロフロキサシンの5%溶液
コンピュータ化されたシステムPowerLab 8/35	付属品	3508-1090
デジン	Apteka.ru		70%エタノールに0.5%クロルヘキシジンビグルコン酸塩
デジタル温度計	B.ウェル・スイスAG	ロット0413
電子ダイナモメーター グリップストレングスメーター	BioMed Easy Technologies	007231024415MC01
S100カルシウム結合タンパク質B(S100B)用ELISAキット	クラウドクローン社(CCC)	SEA567Ra	48T
釣り糸			直径0.9mm
ガス麻酔システム	ウーゴ・バジレ	21100
GraphPad統計ソフトウェア	プリズム		v.10
グルーヴドニードルディレクター	フィッシャー・サイエンティフィック	カタログ番号11-00	12.7 cm
ヘパリン	エンドファーム。モスクワ内分泌植物	30122
イメージJ	国立衛生研究所および光学・計算機器研究所
インスリン注射器	SFMホスピタルプロダクト	160303	0.5mL、U-100、30G
静脈内カテーテル	KDメディカル		G24
イソフルラン(イソフルリン)	ヴェットファーマ		100 mL、1000 mg/kg
実験動物用の実験動物イモビライザー	オープンサイエンス	AE1001-R1
光顕微鏡	ツァイス		アクシオ・スコープ.A1
光学顕微鏡スライド	サーモ・サイエンティフィック	15442933
医療用ポリエチレンマイクロチューブ	サイエンティフィック・コモディティーズ社	BB31695-PE/4	内径 0.76 mm
医療用滅菌ガーゼワイプ	新しい生活		45×29 CM
マイクロチューブ	SARSEDT AG &KG中隊	S044378	1.5 mL
マイクロピペット・エッペンドルフ研究プラス	エッペンドルフ		200 & マイクロ;L
顕微鏡スライド	フィッシャー・サイエンティフィック	11562203
顕微外科用鉗子(湾曲)	カザン医療機器工場	F0106
顕微外科用鉗子(直線型)	RWDライフサイエンス	F11029-11
ミクロトームブレード	サーモ・サイエンティフィック	3052835	MX35プレミア+
マルチコンディショニングシステム	TSEシステムズ	131202-10
中性緩衝ホルマリン	ヘム	1072024	pH 6,8-7,2
非吸収性外科用縫合ラブサン	リンテックス	2022-01
虹彩摘出のための眼科はさみ	CMインストゥルメンテ	AJ-410-05
酸素濃縮器	武装	YYT32700960	7F-3L
リン酸塩バッファー	アムレスコ	2120C462
ピプットのヒント	サービスバイオ		200 & マイクロ;L
ネズミ	実験動物ナーサリーから取得したもの」プッシュチーノ」(www.spf-animals.ru 年)、ロシア科学アカデミーのシェミャキン・オヴチニコフ生物有機化学研究所。
冷蔵実験用多機能遠心分離機	エッペンドルフ	5804 R
ロタロッド ロタメックス-5	コロンバス・インスツルメンツ	210426
ハサミ METZENBAUM	Medstandart-Instrument	MT-H-256
外科用縫合材料	再発薬	114/0042011124	カプロアグ 4/0
手術台	VetKormTorg	VETBOT STL-1、TD00472
テラゾール	ゾーティス	672913	50 mg/mLのチレタミンと50 mg/mLのゾラゼパムを5 mLで
トリフェニルテトラゾリウム塩化物	ディア・マ	TTC1809
キシラジン	ニタ農場	151	キシラジン塩酸2%を50mLに含めて