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方法論記事

ラットモデルにおける頸部深部リンパ静脈吻合のための外科的プロトコル:リンパ節およびリンパ管吻合

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DOI：

10.3791/69201

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2025年11月14日

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1Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 2Institute of Medical Technology, Peking University Health Science Center, 3Department of MR Diagnosis, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 4Department of Neurology, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, 5Department of Clinical Nutrition, Harbin 242 Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、ラットの深部頸部リンパ節またはその求心性リンパ管を顔面後静脈と吻合する手順を明確に定義し、他の変数の影響を最小限に抑え、手術ベースの研究の実施を標準化するためのプロトコルを提示します。

要約

頸部深部リンパ静脈吻合術 (dcLVA) は、アルツハイマー病 (AD) の有望な治療戦略となっており、現在の限られた治療選択肢と比較して大幅な改善をもたらします。ただし、dcLVA の根本的なメカニズムは不明のままです。臨床試験は進行中ですが、dcLVA をシミュレートする動物モデルは、そのメカニズムを調査するための貴重なツールを提供します。この研究は、基礎研究を促進し、臨床上の課題に対処するために、動物の dcLVA モデルを作成するための標準化されたプロトコルを開発することを目的としています。深部頸部リンパ節 (dcLN) とその求心性リンパ管 (ALV) を後顔面静脈 (PFV) と吻合するための外科的手順と重要な手順について説明し、深部頸部リンパ節-静脈吻合 (dcLnVA) と深部頸部リンパ管-静脈吻合 (dcLaVA) の 2 つの異なる手術方法について詳しく説明します。リンパドレナージを促進するだけでなく、これら 2 つの外科方法の比較は、アルツハイマー病の病因における深部頸部リンパ節と深部頸部リンパ系の役割を理解し、調査するのにも役立ちます。全体として、ラットの外科的処置と主要な解剖学的ランドマークの完全かつ明確な提示は、手術プロトコルを標準化するのに役立ちます。 これにより交絡因子を最小限に抑え、実験間のばらつきを減らすことができるため、関与するメカニズムをより深く理解するための強固な方法論的基盤が築かれます。

概要

アルツハイマー病 (AD) は徐々に進行する神経変性疾患であり、認知機能の低下を引き起こすことがよくあります。ADの際立った病理学的特徴は、異常にリン酸化されたタウタンパク質によって形成されるアミロイドベータ(Aβ)プラークと神経原線維のもつれです。脳リンパ系に関する最近の研究により、アルツハイマー病を治療するための新たな治療法が開かれました。このシステムは、間質液 (ISF) から脳脊髄液 (CSF) への Aβ のドレナージを促進し、その後髄膜リンパ管 (mLV) を介して深部頸部リンパ節へのドレナージを促進します1。2024年、謝教授のチームは、頸部深部リンパ静脈吻合術(dcLVA)後のアルツハイマー病患者の認知改善の最初の症例を報告し、その後臨床試験を開始しました(NCT06530732)2。

dcLVA は、アルツハイマー病の新しい治療アプローチとして、患者に有望な見通しを提供しますが、その治療効果の根底にある正確なメカニズムについては、さらなる解明が必要です3。動物モデルは、これらのメカニズムを調査するために不可欠なプラットフォームを提供します。dcLVA の治療メカニズムを包括的に理解することは、アルツハイマー病の病因についての理解を深めるだけでなく、手術手技を最適化し、治療適応を明確にし、最終的には患者により大きな臨床的利益をもたらします。

Xie 教授のチームは最近、外頸静脈の支流と深部頸部リンパ節4 を接続する実現可能性を実証した dcLVA モデルを報告しました。ただし、モデルの説明はまだ十分ではありません。まず、深部頸部リンパ節 (dcLN) とその周囲の解剖学的構造の説明は不十分です。第二に、術後の開存性の客観的で定量的な評価はありません。さらに重要なことは、dcLNと静脈の吻合の手順の詳細な説明や、教育に便利な明確で直感的な写真やビデオが不足していることです。

この技術には複雑な外科的操作が必要であり、ラットとヒトの解剖学的違いを考慮すると、ラットモデルの外科的処置や技術的詳細のバリエーションにより、実験結果に大きな不一致が生じる可能性があります。したがって、ラットの関連する解剖学的ランドマークを明確に説明し、吻合手順の詳細な技術的説明を提供することは重要かつ緊急です。このような取り組みは、手術プロトコルの再現性と標準化を強化し、それによって研究者によるより広範な応用をサポートし、関連する科学的研究を前進させるために不可欠です。さらに、リンパ節から静脈への吻合やリンパ静脈吻合などの臨床手術技術の多様性と、外科的アプローチに応じて結果が異なる可能性を考慮すると、それらの相対的な有効性を評価するための比較研究が必要です。これらの課題に対応して、再現性の高い 2 つの dcLVA 方法、つまり深部頸部リンパ節間静脈吻合 (dcLnVA) と深部頸部リンパ管-静脈吻合 (dcLaVA) を紹介します。これらの方法は、モデル作成プロセスを標準化し、その後の基礎研究を容易にすることを目的としています。

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プロトコル

この研究は、ハルビン医科大学の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) の承認を得て実施されました (承認番号。SYDW2025-037)。被験者は、大学の動物センターから提供された、体重400〜500 g、生後12〜14週の雄のスプレイグ・ドーリー(SD)ラットでした。このセンターは、特定の病原体のない(SPF)施設を維持し、国の繁殖基準に準拠しています。

注: この研究では主に、頸部深部リンパと静脈の間の吻合の 2 つの方法を調査します。dcLN と後顔面静脈 (PFV) の間の外科的接続を確立する。この手法は dcLnVA と呼ばれます。深部頸部リンパ管 (dcLaV) と PFV の間に解剖学的接続を作成します。この手法は dcLaVA と呼ばれます。手術方法や吻合後の評価など、両方の顕微手術手順について詳しく説明します。

1. 術前の準備

  1. ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)の腹腔内注射 によって ラットを麻酔します。ネズミの反応を注意深く監視します。ペダル反射が完全に存在しない場合にのみ続行します。
  2. 先端が鈍い針を使用して、エバンスブルー(EB)溶液(約60〜100 μL / kg、5%)5 を片側鼻腔の鼻粘膜にゆっくりと投与します。ラットを半側臥位に置き、腹部を上に向けて、EB注射した鼻孔を下に向けて配置します。EBが対側の鼻孔や気道に入るのを防ぐために、頭を固定します。
  3. ラットの首の毛を剃って、手術野をきれいにします。手術中の乾燥や角膜損傷を防ぐために、両目にワセリンを塗布してください。

2.外科的切開

  1. ラットの首の正中線をヨウ素チンキで3回消毒して、無菌の手術野を確保します。
  2. 手術用ハサミを使用して長さ約3cmの正中線切開を行います。
    注:解剖中は顎下腺(SMG)と血管を損傷しないように注意してください。
  3. 外科的切開部を引っ込めて、胸甲状甲状筋(STM)、胸鎖乳突筋(SCM)、および舌骨筋(OHM)を露出させます。

3. PFVの調製

  1. SCMの外側縁に沿って、外頸静脈(EJV)の支流であるPFVを特定します。
  2. PFV と EJV の間の分岐点で、微小血管クリップを使用して PFV を閉塞します。
  3. PFVを鈍く解剖して十分な長さを確保し、遠位端でクランプします。PFV セグメントができるだけ緩いままであることを確認して、dcLN との吻合中にその後の牽引力を確保します。
  4. 微小血管ハサミを使用して、血管軸に平行な縦方向の切開を作成します。
    注: 横切開は牽引によって拡大および破裂する可能性があるため、PFV 切開が縦方向であることを確認してください。
  5. 血管内赤血球が完全に除去されるまで、ヘパリン化生理食塩水(0.9%NaCl中の0.1%ヘパリンナトリウム)で分離された血管セグメントを完全に洗浄します。

4.リンパ節静脈吻合

  1. STM と SCM の中央にある dcLN とその求心性リンパ管 (ALV) を調査し、完全に露出させます4。
  2. 鈍い技術を使用して dcLN を徐々に分析します。dcLNとそのALVの両方への損傷を避けて、dcLNと周囲の組織の間の筋膜を慎重に切開します。
    注:吻合後の張力を最小限に抑えるために、PFVとdcLNが互いに近くにあることを確認してください。
  3. dcLNの遠位端を切開します。PFV血流に大きな影響が及ばないように、切開の幅がPFVの直径より小さいか類似していることを確認してください。
  4. 12-0ナイロン縫合糸を使用して、PFV切開の近位端をdcLN切開の近位端に吻合します。
  5. PFVの切開長を遠位端まで拡大し続け、dcLN切開の長さよりわずかに大きくします。
  6. 針をdcLN切断の外縁とPFV切開の内縁に順次通し、それによってdcLN切断をPFVの内腔に引き込みます。
  7. dcLN切断の下端から上端まで連続縫合を行います。PFV 内腔内での血栓形成を防ぐために、最終縫合を完了する直前にヘパリン ナトリウムをもう一度投与します。連続閉鎖中は縫合糸に適切な張力を維持して、確実に閉鎖し、その後の漏れを防ぎます。
  8. 連続吻合が緩んでいる場所に断続縫合糸を配置します。

5.リンパ管静脈吻合

  1. ALVを横断し、周囲の組織を保存して縫合糸のアンカーポイントとして機能します。
  2. 12-0縫合針を使用して、PFV切開部の近位約2 mmに挿入し、PFV切開部の開口部から出るように進めます。
  3. ALVをキャッチするために、縫合針でALVの断端近くの組織に入ります。
  4. 針をPFV切開部に通し、その近位端から外し、縫合糸を結び、PFVの内腔内のALV断端を固定します。
    注:ALV断端をPFVの内腔に完全に挿入し、近位方向に向けて生理学的ドレナージを維持します。
  5. ALVの断端近くの周囲の組織をPFV切開の内側の端に縫合して、外部固定を提供します。PFV内腔に血栓が付着しないように、最後のステッチの前にヘパリンナトリウムを投与します。

6.縫合と術後のケア

  1. 皮下筋膜の連続縫合と表皮の断続縫合を行います。
  2. ヨウ素チンキで手術部位を消毒します。次に、感染を防ぐために切開部の周りにエリスロマイシン軟膏を均一に塗布します。
  3. 術後、ペニシリンナトリウム(800,000単位/kg)を1日1回腹腔内注射 で 5日間連続して投与し、感染のリスクを低減します。

7. 吻合の検証

  1. PFV の外側にある EJV の支流である前顔面静脈 (AFV) を特定して解剖します。
  2. 隣接するAFVと比較してPFVで有意に強い染色を観察することにより、吻合の成功を確認します。
  3. 標準化されたCIE LAB色空間を使用して、色の変化を客観的に定量化します。フィジーの関心領域 (ROI) を定義して抽出し、平均 CIE L*a*b* 値を取得し、次の式を使用して色相角度 (h°) を度単位で計算します。
    h° = atan2(b, a) × (180/π)6,7.

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結果

dcLnVA と dcLaVA の外科的処置と術後転帰は、それぞれ 1 つの代表的な症例で説明されています。dcLnVAの場合、PFV(直径2 mm)が同定され、SCMの外側境界から解離されました(図1A、図S1A)。SCMとSTMの間の隙間、PFVの約4 mm内側に、長い楕円形のdcLN(5 mm× 4 mm× 2 mm)が見られ、細かく分離されました(図1B、C、図S1B-E)。続いて、クランプされたPFVを分離したdcLNと並置しました(図1D)。PFV側壁に縦方向の切開(1.5 mm)を行い、内腔を約1 mLのヘパリンナトリウム溶液(0.1%)で洗い流しました(図1E-F

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ディスカッション

2012年、ILifらは、グリンパ系8を初めて記述した。2015年、Louveauらはリンパ管の内腔にあるT細胞凝集体を特定し、これらの構造を髄膜リンパ管と呼びました。彼らはさらに、髄膜リンパ管がグリンパ系とdcLNの両方に接続されていることを実証しました。要約すると、グリンパ系と髄膜リンパ管の両方を含む脳リンパ系の調節下で、間質液中のAβは脳脊髄液(CSF)に排出され、次に髄膜リンパ管に排出され、最終的にdcLN9に到達します。その後の動物実験では、髄膜リンパ機能の障害がマウスの認知機能低下とAβ沈着の増加をもたらすことが一貫して実証されました10。逆に、髄膜リンパ管の機能を高める近赤外線照射などの治療戦略は、マウスの認知を改善し、アルツハイマー病関連の病理学的特徴を軽減することが示されています11。研究が進むにつれて、髄膜リンパ管、特に頭蓋底にあるリンパ管を介した

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金 (82173384 および 81773161)、黒竜江省重点研究開発プログラム (2023ZX06C11)、および Genertec 医学科学研究基金プロジェクト (TYYLKYJJ-2024-043) の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9%無菌生理食塩水  山東奇都製薬有限公司およびnbsp; R9824041307  
エリスロマイシン軟膏三奇製薬株式会社H34020307
エバンス・ブルーダイ 5%(50mL)リージェンDK0053
ヘパリンナトリウム溶液 0.1%バイオスコBAC006
マイクロ鉗子アンリキシンAT-15
微小血管クランプタイガージーンTG-AC-18-Z
ペニシリンナトリウム河北元正合茂製薬有限公司JFT230602
ホワイトワセリン天城  20250202

参考文献

  1. Formolo, D. A., et al. Leveraging the glymphatic and meningeal lymphatic systems as therapeutic strategies in Alzheimer's disease: an updated overview of nonpharmacological therapies. Mol Neurodegener. 18 (1), 26(2023).
  2. Li, X., et al. Promising outcomes 5 weeks after a surgical cervical shunting procedure to unclog cerebral lymphatic systems in a patient with Alzheimer's disease. Gen Psychiatr. 37 (3), e101641(2024).
  3. Chen, J. Y., et al. Deep cervical lymphovenous anastomosis (LVA) for Alzheimer's disease: microsurgical procedure in a prospective cohort study. Int J Surg. 111 (7), 4211-4221 (2025).
  4. Fang, R., et al. A novel microsurgical model of cervical lymph node-to-vein anastomosis (LNVA) for studying brain lymphatic outflow. J Craniofac Surg. 36 (6), 2160-2163 (2025).
  5. Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
  6. Mazur, F., Han, Z., Tjandra, A. D., Chandrawati, R. Digitalization of colorimetric sensor technologies for food safety. Adv Mater. 36 (42), e2404274(2024).
  7. Karamucki, T., Rybarczyk, A., Jakubowska, M., Sulerzycka, A. A comparison of two methods of determining colour change in the assessment of the quality of pork. Acta Sci Pol Technol Aliment. 16 (3), 321-329 (2017).
  8. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  9. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  10. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  11. Wang, M., et al. Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer's disease-associated pathology and cognition in mice. Nat Commun. 15 (1), 1453(2024).
  12. Proulx, S. T. Cerebrospinal fluid outflow: a review of the historical and contemporary evidence for arachnoid villi, perineural routes, and dural lymphatics. Cell Mol Life Sci. 78 (6), 2429-2457 (2021).
  13. Yoon, J. H., et al. Nasopharyngeal lymphatic plexus is a hub for cerebrospinal fluid drainage. Nature. 625 (7996), 768-777 (2024).
  14. Zhou, Y., et al. Impaired peri-olfactory cerebrospinal fluid clearance is associated with ageing, cognitive decline and dyssomnia. EBioMedicine. 86, 104381(2022).
  15. Papadopoulos, Z., et al. Differential impact of lymphatic outflow pathways on cerebrospinal fluid homeostasis. J Exp Med. 222 (2), e20241752(2025).
  16. Mehta, N. H., et al. The brain-nose interface: a potential cerebrospinal fluid clearance site in humans. Front Physiol. 12, 769948(2021).
  17. Norwood, J. N., et al. Anatomical basis and physiological role of cerebrospinal fluid transport through the murine cribriform plate. Elife. 8, e44278(2019).
  18. Fan, F., Zhao, N., Guo, M. Lymphatic-venous anastomosis: cracking the code of Alzheimer's disease treatment. Neural Regen Res. , (2025).
  19. Hong, J. P., Chen, W. F., Nguyen, D. H., Xie, Q. A proposed role for lymphatic supermicrosurgery in the management of Alzheimer's disease: a primer for reconstructive microsurgeons. Arch Plast Surg. 52 (2), 96-103 (2025).
  20. Nguyen, L., et al. Role of sigma-1 receptors in neurodegenerative diseases. J Pharmacol Sci. 127 (1), 17-29 (2015).
  21. Pierre, K., et al. Chronic traumatic encephalopathy: diagnostic updates and advances. AIMS Neurosci. 9 (4), 519-535 (2022).
  22. Chen, J. Y., et al. Deep cervical lymphovenous anastomosis (LVA) for Alzheimer's disease: microsurgical procedure in a prospective cohort study. Int J Surg. 111 (7), 4211-4221 (2025).

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