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方法論記事

脈絡叢上皮および内皮の別解析のためのヒト血液・脳脊髄液障壁の高度な共培養モデル

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DOI:

10.3791/69275

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2025年11月28日

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1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

この記事について

サマリー

脈絡叢のヒト上皮細胞と内皮細胞の共培養を確立し、血液脳脊髄液関門の高度な in vitro モデルを生成しました。選択条件下で上皮と内皮を別々に分離し、その後のRNA調製および転写解析を行う方法を記述します。

要約

脳の心室系に位置する高灌流脈絡叢(CP)は、立方上皮や開孔された内皮など複数の構造的構成要素からなり、血液脳脊髄液関門(BCSFB)の位置です。in vitroでCPを調査するためには、いくつかの異なる細胞培養方法が考えられます。当研究室では、ヒト上皮性CP乳頭腫(HIBCPP)細胞に基づく強力な障壁機能を持つ逆細胞培養フィルターモデルが確立され、広く利用されています。最近、安定した不死化ヒトCP内皮細胞株(iHCPEnC)を生成することに成功しました。両細胞株を組み合わせて、HIBCPP単独と比べてバリア機能が向上した高度な機能的2細胞型モデルを構築しました。このモデルはCP上皮と内皮の両方を表すため、感染、炎症などの選択条件下で両細胞の相互作用を調査することが可能です。本プロトコルでは、上皮細胞と内皮細胞を分離して転写解析を行うこの2細胞型モデルの構築方法を説明します。上皮と内皮に特異的なPCRプライマーを記述し、両細胞間の交差汚染の可能性を検出します。炎症状態下でCP内皮が上皮に与える可能性のある影響を調査するため、リポ多糖(LPS)処理の文脈で選択遺伝子の発現レベルをHIBCPP細胞画画で解析しました。高度なCP のin vitro モデルと、上皮および内皮の応答を個別に解析できる可能性は、CPの生物学的および病理学的機能に関わる細胞プロセスの研究において重要な関心を持っています。

概要

脈絡叢(CP)は、脳の4つの脳室すべてに位置する異なる細胞集団からなる高度に血管化された集合体です。他にも機能する中には、中枢神経系(CNS)と血液の間に機能する生理学的バリア、いわゆる血液・脳脊髄液関門(BCSFB)として機能し、例えば血液中の感染性物質などが脳に循環するのを防ぎます。CPは、極性上皮細胞を含むさまざまな細胞タイプで構成されており、これらはタイト接合部や付着接合部、さらにはデスモソームを持ち、基底膜上に位置しています。上皮細胞の表面は、腔内表面に微絨毛が存在することで拡大します。開孔した内皮毛細血管は、線維芽細胞や免疫細胞などの結合組織に囲まれ、基底膜1,2,3の下に位置しています。最近、CP内皮細胞が上皮細胞とともにBCSFBの完全性を高めることが報告されており、炎症過程中の脳保護に関与している可能性があると4,5。

これまでのところ、ヒト上皮CP乳頭腫(HIBCPP)細胞の逆培養は、高い経上皮電気抵抗値(TEER)と強力なバリア機能を持つヒトBCSFBを模倣するために最も頻繁に用いられるin vitroモデルです。細胞機能をより深く理解しつつ、同時に動物実験を避けるためには、in vitro実験からできるだけ多くの情報を得ることが重要です。最初の安定した不死化ヒトCP内皮細胞株(iHCPEnC)が最近、当研究所6,7で確立されました。HIBCPP細胞とiHCPEnCの助けを借りて、より高度な方法でBCSFBを模倣した共培養in vitroモデルを構築することができました8。この2細胞型モデルを用いることで、HIBCPP細胞とiHCPEnCの共培養がHIBCPP単独と比べてTEER値を高めることを示すことができました。iHCPEnC単独ではTEER 7,8を発症しないことに注意が必要です。このモデルで用いられた2つの細胞タイプの別々の準備とその後の解析により、健康な状態と疾患状態の相互作用を調査することが可能となります。

ここでは、この目的を達成するための2つの異なるアプローチについて説明します。この理論の根拠は、いずれの場合もHIBCPP細胞の逆細胞培養モデルに基づいているという点です(図1)。方法1は「直接共培養」法で、両方の細胞を1つのフィルターインサートに配置します。HIBCPP細胞は、iHCPEnCを標準的にシーディングする前に逆に培養されます。方法2、すなわち「膜インインサート」培養では、フィルターインサートと同じ性質を持つ別の膜を追加しました。この追加の膜は、すでにHIBCPP細胞が逆培養で増殖しているフィルター挿入部に挿入されます。iHCPEnCは標準的な培養方法で追加の膜にシードされます。

その後の細胞分離によりRNA解析を行うことで、選択条件下でのCP上皮と内皮の転写反応についての洞察が得られます。HIBCPP細胞およびiHCPEnCに特異的なPCRプライマーを記述し、両細胞タイプの成功かつクリーンな分離の確認を可能にします。リポ多糖(LPS)による治療後、本研究モデルを用いて炎症状態下で内皮が存在する場合のCP上皮の異なる応答を調べます。

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プロトコル

1. HIBCPP細胞

注:以下では、HIBCPP細胞の培養と維持、ならびにHIBCPP細胞を用いた逆型細胞培養フィルター挿入物の準備について説明します。このプロトコルは、12ウェルの細胞培養フィルター挿入上でのHIBCPP細胞の増殖のために設計されています。24ウェル細胞培養フィルター挿入によるHIBCPP細胞の培養に関する詳細なプロトコルと動画は、以前に発表されています。

  1. HIBCPP細胞を培養に取り込む方法
    1. HIBCPP細胞のバイアルを室温(RT)で解凍します。
    2. バイアルの内容物を、胎児乳牛血清(FCS)10%を含むDMEM/HAMS-F12培地10mLと、予温培地(10% HIBCPP培地)5μgインスリン/mLを含んで再懸浮させます。
    3. 再懸濁したHIBCPP細胞をT75細胞培養フラスコに入れ、37°Cで5%CO2で24時間インキュベートします。
    4. 細胞をシードしてから24時間後にフラスコの培地を交換し、DMSOを除去します。
    5. 細胞を90%のコンフルージョンまで培養し、この工程には約2週間かかります。培地は週に2回交換してください。
  2. HIBCPP細胞の連続培養
    注:連続培養の場合、HIBCPP細胞を1:3の割合で新しいT75細胞培養フラスコに分割してください。
    1. T75フラスコから培地を取り出します。
    2. 細胞を10mLのPBSで一度洗浄します。
    3. PBSを外してください。
    4. 0.25%トリプシン-EDTAを3 mLの助けでHIBCPP細胞を剥離します。この作業は37°Cで約10〜20分かかります。 その間にフラスコを回して、トリプシン-EDTAで細胞層を完全に覆い尽くします。
    5. HIBCPP培地7mLを加え、50 x g で遠心分離機で10分間RTで投与します。
    6. 細胞ペレットを10%HIBCPP培地30mLに再懸浮させ、新しいT75フラスコ3個に分散します。
    7. 細胞を90%の合流率まで培養します。細胞は約1週間で合流に達します。
    8. 培地は週に2回交換してください。
      注:HIBCPP細胞は増殖抑制を受けていません。したがって、フラスコは合流し、細胞は増殖し多層を形成します。
  3. 逆培養におけるHIBCPP細胞のシーディング
    1. T75フラスコから培地を取り出します。
    2. 細胞を10mLのPBSで一度洗浄します。
    3. PBSを外してください。
    4. 0.25%トリプシン-EDTAを3 mLの助けでHIBCPP細胞を剥離します。この作業は37°Cで約10〜20分かかります。 その間にフラスコを回して、トリプシン-EDTAで細胞層を完全に覆い尽くします。
    5. その間にフィルターインサートを準備してください。12ウェルフィルターの挿入物を逆さまにして6ウェル培養プレートにピンセットを使い、事前に温めた10%HIBCPP培地を充填します。各フィルターインサートの上に培地を一滴かけて膜をあらかじめ湿らせてください。
    6. トリプシン化細胞を10% HIBCPP培地17 mLで再懸濁します。
    7. 50 x g で10分間RTで遠心分離し、HIBCPP細胞を1 ×10 6 Cell/mLの濃度に調整します。
      注:HIBCPP細胞は小さな凝集を形成する傾向があります。フィルターインサートにシードする前に完全に溶かす必要はありません。セルの90%を単一にしてください。
    8. 12ウェルフィルターインサートに逆向きにHIBCPPセルを種子化し、密度は4×10個の5 セル/インサート。
    9. 細胞の懸濁液が膜に取り込まれるまで待ちます。6ウェル培養プレートの蓋を閉じます。
    10. 逆さまのインサートが入ったプレートをインキュベーターに入れます。
    11. シードから24時間後、鉗子を使って挿入物を正しい向きに回し、新しい12ウェルの細胞培養プレートにします。下部区画に10%のHIBCPP培地を2mL、上部区画に1mLを入れます。
    12. 培地を交換せずに5〜6日間放置し、TEERの決定と共培養の準備を開始します。

2. TEERの決定

注:TEER値の決定はMilliCell ERS2と箸電極の助けを借りて行われます。計算には細胞培養フィルター挿入物のセルセルなしのブランク測定(オームブランク)が必要です。

  1. 箸の電極は乾燥して保管してください。測定を始める前に、電極を80%エタノールに10分間浸して消毒してください。
  2. その後、電極をPBSで洗い流します。
  3. 測定開始:電極の長端を井戸に入れ、短端をシードセルを含むフィルターインサートに入れます。
  4. 12ウェルの細胞培養フィルター挿入(オームサンプル)のオーム値を記録します。
  5. TEERは次のように計算します:Ohm·cm2 = (Ohmsample -Ohm Blank) × 1.1 cm2。
  6. 測定が終わったら、電極を80%エタノールで洗い流し、乾燥して保管します。
    注意:異なる実験条件や異なる細胞株の測定の合間には、交差汚染を防ぐために箸電極を消毒し、PBSで洗い流す必要があります。

3. iHCPEnC

  1. iHCPEnCを文化に取り込む
    1. RTでiHCPEnCのバイアルを解凍してください。
    2. バイアルの内容物を、予温した5 mLの完全クラシック内皮培地(iHCPEnC培地)で再懸濁します。
    3. 500gの遠心分離機で5分間RTで加熱します。
    4. その間に、T25細胞培養フラスコに2mLの付着因子を約1分間コーティングします。アタッチメントファクターを吸引し、iHCPEnCのシードまでフラスコを置いてください。
    5. 細胞ペレットを5mLのiHCPEnC培地で再懸浮させ、準備済みのT25細胞培養フラスコに入れます。
    6. 培地を変えずに37°Cで5%CO2 を含んで1週間培養します。
  2. iHCPEnCの連続培養
    注:連続培養の場合、iHCPEnC 1:4を新しいT25細胞培養フラスコに分割してください。
    1. iHCPEnC培地を取り出し、3mLのPBSで一度細胞を洗浄します。細胞の剥離には注意してください。
    2. PBSを吸引してください。
    3. トリプシン-EDTA1mLの助けを借りて、結合したiHCPEnCを剥離します。このステップはRTで約3〜5分かかります。
    4. 細胞を5mLのiHCPEnC培地に再懸浮させます。
    5. 500gの遠心分離機で5分間RTで加熱します。
    6. その間に、新しいT25フラスコを4枚塗り、1つあたり2mLのアタッチメントファクターを塗布してください。
    7. 細胞ペレットを20mLのiHCPEnC培地で再懸濁します。
    8. 4つの準備されたフラスコそれぞれに5mLの細胞懸濁液を分散させます。
    9. 再び、培地を変えずに1週間培養します。1週間で合流します。
      注:iHCPEnC細胞は増殖抑制されています。したがって、フラスコはコンフルンになり、残ったセルは浮かびます。

4. 共培養実験の準備

  1. 方法1:「直接共培養」(1つの挿入物の両側で上皮細胞と内皮細胞を培養)の場合、追加のものは調製しないでください。
  2. 方法2:「膜インインサート」法では、以下の手順を実行します。
    1. 別のDin-A-4膜から直径11mmに相当するNo.11穿孔鉄を用いて、12ウェルの細胞培養用フィルター用インサートサイズの膜をパンチングします。
    2. パンチアウトした膜をペトリ皿に入れます。
    3. パンチアウトした膜は紫外線(UV-C、254 nm)で60分間滅菌します。
      注:パンチアウトして滅菌された12ウェル細胞培養フィルターのインサートサイズ膜は、事前に準備し、滅菌状態で保管することができます。

5. 共文化の確立

注:この段階でHIBCPP細胞はすでに2細胞型 in vitro 培養モデルに備えられています。HIBCPP細胞は5〜6日間培養されています(ステップ1.3.8-1.3.12と比較してください)。HIBCPP細胞はTEER(約20オーム・cm²)を発達させ始めます。

  1. 両者の場合、方法1(「直接共培養」)および方法2(「膜インインサート」)は、10%のHIBCPP培地を1%のHIBCPP培地に置き換えます。この目的のために、12ウェル培養プレートのウェルに1%のHIBCPP培地2mLを投入します。
  2. ピペットと鉗子を使って逆さまの培養含有フィルターインサートを空にし、フィルターインサートを標準的な向きで準備された12ウェルに入れます。
  3. 方法2(「膜インインサート」)では、以下のようにフィルターインサートを準備します。
    1. パンチアウトして滅菌した膜を、HIBCPP細胞をピンセットで逆培養した12ウェルフィルターインサートに組み込みます。
  4. 細胞培養プレートをインキュベーターに戻し、iHCPEnCのトリプシン化を行います(ステップ6で説明)。

6. 共培養におけるiHCPEnCの播種と培養

注:以下の節では、HIBCPP細胞とiHCPEnCの12ウェル培養フィルター挿入における共培養の確立について説明します。24ウェル培養フィルター挿入物上でのHIBCPP細胞とiHCPEnCの共培養に関する詳細なプロトコルは、以前に8。iHCPEnCを剥離する前に、共培養に必要な細胞数を計算してください。1つのコンフルなT25細胞培養フラスコは、約5個の5 個×5個の細胞を提供します。

  1. iHCPEnCを含むコンフルレントT25フラスコの培地を取り除きます。
  2. iHCPEnCをPBS3mLで洗浄します。細胞の剥離は避けてください。
  3. PBSを外してください。
  4. トリプシン-EDTA1mLの助けを借りて、結合したiHCPEnCを剥離します。このステップはRTで約3〜5分かかります。
  5. 細胞を5 mL/T25フラスコにiHCPEnC培地で再懸濁させます。
  6. ノイバウアーチャンバーの細胞数を数えてください。
  7. 500 × g で遠心分離機を5分間RTで加熱します。
  8. 細胞ペレットをiHCPEnC培地で最終濃度1×105 Cells/mLに再懸浮させます。
  9. 方法1(「直接共培養」)および方法2(「インサート中の膜」):12ウェルのフィルターインサートに700μL iHCPEnC(7x105 細胞)をシードします。
  10. 共培養および対照群(HIBCPP細胞およびiHCPEnCのみの培養)のTEER値を、iHCPEnCシードから24時間後に初めてモニタリングし、その後は毎日モニタリングします。

7. LPS治療

注:共培養はHIBCPP細胞のみ培養と比較してより高いTEER値を呈すべきです(推奨係数:1.5以上)。

  1. 実験用に設置した細胞培養挿入物のTEER値を測定・記録してください。
  2. 1%HIBCPP培地に5μg/mLのLPSを含むマスターミックスを準備します。
  3. 1ウェルあたり2 mL 1% HIBCPP培地を含む新しい12ウェルプレートを準備します。
  4. 鉗子とピペッティングを使ってインサートを空にしてください。
  5. 準備済みの井戸に挿入装置を設置します。
  6. LPSマスターミックス1mLまたは1%のHIBCPP培地を加えます(ネガティブコントロール)。
  7. 37°Cで4時間培養します。
  8. セクション8に進む前にTEER値を測定・記録してください。

8. HIBCPP細胞およびiHCPEnCからのRNA分離による転写解析

注:2つの別々の細胞画画を実現し、共培養モデルで培養された細胞からの交差汚染を防ぐために、細胞画画は慎重に別々に挿入物から削り取られます。各フィルターインサートに対して、RNA分離のすべてのステップを中断なく行ってください(インサートは空きません)。

  1. 洗うフィルターはPBSで一度挿入します。この目的のために、1.5mLのPBSを1ウェルに入った12ウェルの培養プレートを準備します。
  2. ピペットと鉗子を使って細胞培養フィルターの挿入部分を空にします。挿入物をPBS充填の12ウェル培養プレートに挿入します。
  3. インサートに1mLのPBSを加えます。
  4. 方法1(「直接共培養」)用にiHCPEnCおよびHIBCPP細胞を準備するには、以下の手順を実行します。
    1. インサートからPBSを取り出し、空の乾燥した12ウェル培養プレートに置きます。
    2. ピペットチップと10〜20μLのPBSのピペットアップ・ダウンを用いて、iHCPEnCはスクレイピングでインサートから剥離されます。
    3. この細胞分画を350μLのRNA溶解バッファーを含む1.5 mLチューブに入れます。細胞を上下にピペットで上下に動かし、RNA溶解バッファーと適切に混合します。
    4. iHCPEnCの収穫が終わったら、インサートを裏返して細胞培養プレートの蓋に入れます。
    5. HIBCPP細胞をiHCPEnCの分画と同様に膜から取り出し、350μLのRLT-βメルカプトエタノールを含む準備済み1.5mLのチューブに入れます。
      注意:1つの状態に対して複数の共培養を準備する場合は、挿入物と細胞分画ごとに350μLのRNA溶解バッファーを取ります。特定の条件下の単一調製細胞分画を同じカラム上で連続的に精製します。
  5. 方法2(「膜インインサート」)用にiHCPEnCおよびHIBCPP細胞を準備するには、以下の手順を実行します。
    1. 鉗子を使って追加の膜を取り出し、12ウェル培養プレートの乾いた蓋に入れます。iHCPEnCの溶解のために100μLのRNA溶解バッファーを膜にピペットで投与します。
    2. この100μLの溶解液を1.5mLのチューブに250μLのRNA溶解バッファーを入れ、よく混ぜます。
    3. フィルターインサートからPBSを取り出し、12ウェル培養プレートの蓋に下向きに置きます。挿入物の膜に100μLのRNA溶解バッファーを加え、HIBCPP細胞分画を溶除します。
    4. この100μLの解離液を、250μLのRNA溶解バッファーを含む1.5mLのチューブに入れます。
  6. 製造元のプロトコルに従ってRNA分離を行います。
  7. 分光光度計を使ってRNAの量を測定します。
  8. 製造元の説明通りにRNAサンプルの逆転写およびqPCR解析を行います。
    注:共培養はHIBCPP細胞に比べてiHCPEnCの量が少ないため、分析結果に応じてiHCPEnCから十分なRNAを分離するために複数の12ウェルフィルター挿入物が必要です。異なるフィルター挿入物のRNA解離液はプールする必要があります。逆転写およびqPCRは前述の方法で実施可能です。

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結果

本プロトコルでは、図 1に示すように、細胞培養フィルター挿入上に上皮(HIBCPP細胞)と内皮(iHCPEnC)からなるヒトCPの2細胞型モデルの段階的生成を説明しています。このモデルシステムでは、HIBCPP細胞はフィルターの下側で逆に増殖され、iHCPEnCはインサートのフィルターの上側か、インサート膜の上に置かれた第二のフィルターにシードされます。

二セル型モデルのTEER値
最近、HIBCPP細胞とiHCPEnCを細胞培養フィルター挿入で共培養すると、TEER測定で時間とともにバリア機能が増加することを示しました。これらの実験は、0.4μmの孔径6,7,8を持つ24ウェルの細胞培養フィルター挿入を用いて行われました。この影響...

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ディスカッション

ヒトCPは、バリア形成上皮や拡張血管内皮など、いくつかの異なる細胞タイプから構成されます。CPの内皮細胞はフェネトレーションされていますが、最近の研究ではBCSFB 4,7におけるバリア機能への寄与が示されています。CPとして臓器における内皮と上皮の複雑な相互作用を研究するには、両細胞型を解析できる高度なin vitroモデルが必要です。

ここでは、上皮細胞(HIBCPP細胞)と内皮細胞(iHCPEnC)からなるヒトCPの2細胞型 in vitro モデルを生成するプロトコルを説明します。このプロトコルを実行する際は、培養物のTEER値を定期的に監視することが重要です。これは障壁機能の信頼できる検証となります。プロトコルのセクションでは、共培養を設置するタイミング(ステ...

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開示事項

著者たちは利益相反がないと宣言しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシン-EDTAライフ・テクノロジーズ 25200056
12ウェル細胞培養プレート スターラボCC7682-7512
12ウェルフィルターインサート(3 & micro;Mの毛穴)グライナー・バイオ・ワン665631
24ウェル細胞培養プレート スターラボCC7672-7524
24ウェルフィルター挿入 (0.4 & micro;Mの毛穴)グライナー・バイオ・ワン662641
24ウェルフィルターインサート(3 & micro;Mの毛穴)グライナー・バイオ・ワン662631
6ウェル細胞培養プレート スターラボCC7682-7506
AffinityScript cDNA合成キット(cDNA合成)アジレント600559
付着係数セルシステム4ZO-500コンプリート・クラシック内皮ミディアムキットの一部です。
ブリリアントII SYBR Green qPCRマスターミックス(リアルタイムPCR)アジレント600828
チョップスティック電極ミリポールMERSSTX01この製品は生産終了です。
コンプリート・クラシック内皮培地(iHCPEnC 培地)セルシステム4ZO-500このキットには、培地、サプリメント、コーティング用のアタッチメントファクターが含まれています。
DMEM/F-12(1:1)フェノール(10% HIBCPPミディウム)配合サーモ・フィッシャー31330-038
DMEM/F-12(1:1)フェノールなし(HIBCPPメディウム1%)サーモ・フィッシャー11039-021
胎児の子牛血清(FCS)(1%および10%のHIBCPPミディアム)サーモ・フィッシャー10270-106
インスリン(1%および10%HIBCPP培地)シグマI9278
リポポリサカリド(LPS)シグマL3024
ミリセル ERS2 ミリポールMERS00002この製品は生産終了です。
ナノドロップ(分光光度計)サーモ・サイエンティフィックND1000この製品は生産終了です。
No.11 穿孔鉄WüRTH880223211
PBSライフ・テクノロジーズ 14190169
プライマー設計ツールNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
プライマー シグマVC00021
Qiagen RNeasy microキアゲン74004
RLT+b-ME(Qiagen Rneasyマイクロキットの一部)キアゲン74004
T25細胞培養フラスコサーステットAG&コ・KG83,39,10,002
T75細胞培養フラスコサーステットAG&コ・KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc(別膜)サビウSK4580
紫外線カール・ロスH469.1

参考文献

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