血管化複合同種移植および遊離フラップの保存戦略を調査するための実験的ヒトDIEPフラップモデル

サマリー

このプロトコルは、実験研究を目的とした、深部下腹上動脈脚に基づくヒト穿孔皮弁モデルの外科的収穫技術を説明しています。

要約

近年では、細胞保護剤注入、 体外 機械灌流、過冷却などの保存アプローチが、虚血性および低酸素性損傷を軽減することで標準臓器および限界臓器の長期保存を強化する戦略として登場しています。有望なものの、血管化複合型アロ移植(VCA)分野への応用は主に前臨床研究に限られています。これまでのところ、VCA灌流戦略を調査する多くの研究は動物モデル、特に豚や齧歯類の複合材料に依存してきました。これらのモデルは貴重な機構的洞察を提供しますが、解剖学的、免疫学的、生理学的な違いが再現性や人間の応用における翻訳的関連性を制限しています。

このプロトコルでは、保存研究のためにヒトの深部下腹腔穿孔器(DIEP)フラップを取得するために必要な各手術ステップを詳細に記述しています。穿孔筋は筋膜下郭清なしで筋膜上を切断し、短くも十分なカテーテル収入のための脚を形成します。このモデルは標準的な腹部形成術で廃棄された組織を利用し、患者に追加のリスクを伴いません。機能的なフラップを手術時間を延長したり患者の安全を損なうことなく収穫するための重要な手順が示されています。その後、実験使用前にフラップの生存可能性を確認するために機能的画像検査を行い、組織の完全性を追跡するために逐次生検を行うことがあります。このモデルは特に部分的な顔面移植のような筋温存VCA手術の研究に適しており、自己軟体皮弁保存の研究にも関連性があるかもしれません。

概要

血管化複合形アロトランスプラント(VCA)は、特に顔面および上肢の複雑な組織欠損を持つ患者にとって有望な再建的解決策を示しています^。しかし、VCAは虚血再灌流損傷に非常に脆弱であり、移植片の生存率や長期的な転帰に影響を及ぼす可能性があります^。この文脈では、細胞保護剤の注入、体外機械灌流、過冷却などの保存アプローチが、保存期間の延長、移植片の質の最適化、移植前の生存可能性評価を可能にする戦略として登場^{しています。}過去10年間で、固体臓器のノーモマティック(生外体外灌流)は実験的な実験技術から臨床実践へと成功裏に応用^{され、有望}な結果を得ていますが、依然としてVCA⁹の研究分野に限られています。

これまでのところ、VCA灌流プロトコルを調査するほとんどの研究は動物モデル、特に豚や齧歯類複合体に依存しています¹⁰。これらのモデルは貴重な洞察を提供しますが、解剖学的、免疫学的、生理学的な差異により再現性や翻訳的関連性を本質的に制限しています(^11,12)。ヒト組織モデルはより関連性の高い洞察を提供しますが、脳死ドナーからの新鮮な組織は研究目的で入手が非常に困難であり、複雑な物流、厳格な規制承認が必要であり、倫理的な懸念も生じます(^13,14)。理想的な代替案は、死体検死に適さず倫理的に受け入れられる人間ベースのフラップモデルであり、完全なVCA手術の複雑さやリスクを伴わず、患者にとって完全に安全であることです。重要なのは、再現可能で拡張可能な研究を促進するために、容易にアクセスできる環境であるべきだということです。

本件では、腹部形成術で廃棄された組織を用いて患者に追加のリスクを負わない、VCA保存研究のためのヒト深部下腹部穿孔器(DIEP)フラップモデルを記述します。

プロトコル

すべての患者はヘルシンキ宣言に従い標準的な人道的ケアを受け、プロトコルは機関倫理委員会(プロジェクト番号)によって承認されました。IRB00014528_2025_32)。患者は研究目的で廃棄された組織を使用することにインフォームド・コンセントを提供しました。

1. 術前ケア

注意:これらの皮膚穿孔弁は筋膜および筋肉を除き、患者の手術廃棄物から得られ、多くは肥満手術後の患者に由来し、予測可能な臍帯移位を伴う既に皮膚脂肪切除術を受けた場合(すなわち重要な腹部パンヌス)でのみ採取可能です。手術中の計画的な脂肪吸引は除外基準です。併発性の離位修復は禁忌ではありません。この処置はフラップ収穫後に行われるためです。腹部パンヌスは一般的に恥骨部分の少なくとも部分的な覆いを提供します。患者は血栓塞栓症の既往歴がなく、体格指数(BMI)が30 kg/m²未満でなければなりません。これは、高い値が肥満と関連し、全身麻酔下の選択的非重要処置のリスクと利益の比が悪くなるためです。過去の腹部手術(脂肪吸引を除く)は通常、ドップラー検査で穿孔筋が特定されるか、術中に直接可視化されている場合に限り禁忌ではありません。この研究手技は、すでに長く複雑な手術であり、追加の術前ステップが非合理的で手技リスクを高める本格的な片側DIEP自由弁再建でも避けるべきです。

1. 患者が立った状態で、皮膚写真ペンで術前皮膚脂肪切除のマーキングを行います。恥骨結合から剣突起までの正中線を特定し、外陰部交連の約7cm上に横線を描きます。この線を左右約7cmずつ横方向に伸ばし、上顎棘の前上方のすぐ下で優しく上方に曲げて合流させます。
2. 患者が仰向け状態で、手持ちの音響ドップラープローブ(8-10 MHz)で臍周辺の穿孔筋を特定します。
   注意:適切な音響結合を確保するために、少量の滅菌超音波ジェルを皮膚に塗布してください。信号を減衰させないように、プローブを45°の角度で軽く接触させて保ちます。強い三相性の脈動音は動脈穿孔を示します。DIEPフラップ収穫前に通常行っているように、皮膚の各穿孔孔に滅菌マーカーで印をつけ、穿孔筋の地図を作成します。
3. ダーモグラフペンを使い、皮膚パドルを希望の寸法の楕円形に描き、内側境界に沿って穿孔筋を含み、臍の両側に広がる形を描きます(図1)。
4. 標準的な腹部手術で通常行われる無菌手術用ドレープを使い、歯突起から大腿の上部3分の1(恥骨部を含む)まで手術フィールドを準備し、ドレープします。

図1:肥満手術後の腹部皮膚脂肪切除術およびDIEPフラップ収穫前の術前評価。 (A) 術前マーキング:音響ドップラーと皮膚写真ペンを用いて、正中線の両側の傍傍穿孔を特定・輪郭を描く。(B) 外科医が切除対象の腹部皮膚および皮下組織の緩みを示し、水平のマーキングラインに沿って切開する前に脂肪皮皮下のパニキュラスを強調すること。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. フラップ調達

1. No.15メスの刃を使って、腹壁から臍を円周切開で下線させて注射器に切り離します。
2. へその縁の両側に長く緩い吸収性の縫合糸を置きます。
3. メイヨーハサミを使って臍を表面から深い平面まで垂直に切り離し、臍の柄を保存しながら完全に自由になるまで続けます。
   注:この段階ではアシスタントの参加が非常に重要です。ギリーズリトラクターは臍部を露出させるために使用し、長く吸収されない縫合線には優しい縦方向の牽引を加えて解離を容易にします。臍根を囲む脂肪はしっかりとした索を形成し、臍帯分離時に簡単に触診できるため、正確な根部の特定と保存を可能にします。
4. 術前マーキングに沿って、外陰交絡の約7cm上に低い横切開をし、両側の前上腸骨棘に向かって緩やかにカーブさせ、No.15またはNo.21のメス刃を使用します。
5. 皮下面で上腹部形成術の弁を下切開から始め、頭蓋に向かって臍に向かって持ち上げます。約50〜70°C、凝固モードで80Wの細かい先端モノポーラ電気焼灼を用いて、前直筋膜を上に覆う皮下組織や皮膚から分離しつつ、解離中は綿密な止血を維持します。
6. 解離が以前に隔離された臍根に近づくと、電気焼灼温度を約20〜30°Cに下げ、凝固モードで80Wの出力を維持し、脚部損傷を避けるためにメッツェンバウムハサミを使った細かい解離を続けます。
7. 深部下腹上部系から発生する2つの優勢な傍傍穿孔を特定し、慎重に分離します。スティーブンスまたは小型のメッツェンバウムハサミを用いて、各穿孔を直接観察して円形に解剖し、その血管柄を保存します。前直筋腱膜のレベルを超えて解離を拡張しないでください(図2)。
   注:パーフォレーターはサイズに基づいて選定されます。直接観察下で大きく脈動しているものが好まれます。臍周辺の解離は、これらの穿孔を傷つけないよう細心の注意を払う必要があります。
8. 脂肪皮膜を縦方向に縦に分け、下恥骨切開の中心から臍まで、No.15ブレードを使い、その後約50〜70°Cで単極電気焼灼を行います。
9. 頭部を縦骨部まで、外側肋縁に沿って電気焼灼を約50〜70°Cに設定し、皮弁の葉柄を保ち分割せずに頭蓋を続けます(図3)。
   注意:このステップ9は、ペディクルが臍上郭離を困難にする場合、実用的な理由から遅延することがあり、手術中の状況に応じてペディクル分割後のステップ12後に実施されることもあります。
10. 中強度の凝固で軽度出血を制御し、標準的な単極電気焼灼を50-60°C、凝固モードで80Wに設定し、正確な止血を維持します。
11. 皮膚パドルの輪郭をダーモグラフィックペンで再調整し、ステップ8で縦に分割された脂肪皮皮層の両側のフラップ内側の内側に穿孔筋が含まれるようにします(図4)。
    注意:試験溶液に曝露される表面積の違いによるバイアスを避けるため、両方のフラップ(2枚を採取した場合)は同じサイズでなければなりません。皮弁の厚さは皮下組織によって決まり、手術で減少させると皮弁の強度が損なわれるリスクがあります。
12. 深部下腹部動脈穿支管ペディクルは、可吸収性の3-0縫合糸または自動クリップで結紮し、筋膜下郭清離なしで穿孔筋膜を筋膜上方で横断します。温虚血の時間を記録してください。
    注:完全な剥離と細胞保護剤注射治療前に約10分間のフラップ虚血が観察されます。
13. 臍上皮膚と皮下脂肪を下に進め、吸収性の縫合糸で下垂腹部弁を正中線の下切開縁に固定し、結び目の片端を長く保ちます。
    注意:このステップでは患者を半屈曲姿勢に置いてください。上腹部皮弁の下向きの牽引は、切除すべき余分な皮膚の量を決定するのに役立ちます。
14. 腹部形成術で通常行われるように、腹部形成術で通常行われるように、過剰な脂肪皮皮層パネルの切除線を皮膚描写ペンで描き、各前上腸骨棘に向かって外側に伸びます。DIEPフラップはこの標示された切除線の下に位置しています(補足図1)。
15. No.15メス刃で術前の刻印に沿ってフラップを切開します。あらかじめ設定された設計に従い、約50-60°C、凝固モードで80Wの単極電気焼灼を用いてパーフォレーターフラップを収穫します(図5)。
    注意:これは最も繊細な工程の一つであり、穿孔器はフラップ内に含めなければなりません。解剖中は、操作者が穿孔器を継続的に視覚的に操作し続ける間、優しい牽引力を提供するための補助が推奨されます。冷たいナイフでの解離は推奨されません。なぜなら、弁の強度を損ない、血管漏れを引き起こす可能性があるからです。
16. 穿孔器のフラップを周囲の廃棄組織から完全に切り離してください。
    注意:2つのフラップを採取し異なる処理を施した場合、そのうちの1つに縫合糸を当てて区別できます。
17. 腹部形成術で除去された余分な皮膚と脂肪に対応する余分な皮膚脂肪組織を切除します。
    注意:実用的な理由で余分な皮膚脂肪組織を切除した後に穿孔弁を採取する場合は、滅菌の使い捨て電池式焼灼ペン(大きな先端、約1,200°C)を使用して剥離を完了してください。この状況では組織が患者から完全に分離しているため、リターン電極は使用できません。DIEP皮弁を採取した後、手術チームは手術室で待機していた研究チームに弁を渡し、その後、あらかじめマークされた切除ラインに沿って解剖して余分な脂肪皮皮パニクルスを剥離・除去して腹部形成術を進めます。

図2:腹部皮膚脂肪切除術の術中図で、深部下腹部穿支管ペディキュアの骨格化 。画像は、臍上郭離および縦方向下部分割前の手術視野を示しています。両側の優勢な2つの傍傍下腹上腹部穿孔は露出され、手術器具で強調されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:両側の深部下腹腹穿孔筋の下腹部穿孔筋を表示した上腹部郭清後の術中図。 穿孔筋は結紮されておらず、その筋膜下の経路と長さは、やさしい牽引(白い矢印)でよりよく理解できます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:結紮前に皮膚上で楕円形に描かれたDIEPフラップの術中ビュー。 (A) 皮膚パドルは皮膚描写ペン(白い円)で楕円形に調整・輪郭を描き、脂肪皮皮層の両側のフラップ内側の内側縁に沿って穿孔管が確実に含まれるようにします。(B) DIEPフラップの輪郭と、術前ドップラーマッピングによる「x」で示された穿孔筋(白い矢印)を示す拡大図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:上腹部皮弁の下向き牽引により、切除すべき余分な皮膚の量を判断します。 臍上部と恥骨部をつなぐ正中線非吸収性縫合線の長端がガイドとして使われます。皮膚写真ペンを使い、縫合線に沿って切除線(白い矢印)を余分な脂肪皮層の薄層に描きます。この線を各前上腸骨棘に向かって横方向に伸ばします。DIEPフラップはこの標示された切除線の下に位置しています。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

図5:収穫中の深部下腹動脈穿支器(DIEP)皮弁の術中図(脚根結紮後)。 (A) DIEPフラップは約10 cm×6 cmで、穿孔管の局在後に外科的マーカーで輪郭が示されています。(B) 皮膚切開およびフラップ採取は、あらかじめ定められたマーキングに沿って行われます。最初の切開はNo.15ブレードで行われ、その後、過剰な皮膚脂肪組織が患者に付着したまま約50〜60°C、凝固モードで80Wの単極電気焼灼を用いて解剖を行います。組織が完全に剥離されたら、滅菌された使い捨て電池式焼灼ペン(大きな先端、約1,200°C)を用いて分離を完了します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. フラップの準備

1. 顕微外科器具を用いて拡大鏡で血管柄を解剖し、動脈と静脈の両方を特定します(図6)。微小血管拡張器で動脈腔を優しく開けます。
   注意:フラップの準備には、顕微外科器具を備えた専用の滅菌台を使用してください。動脈端から2〜3mm切り離し、カテーテル挿入に適したきれいで規則的な縁を得ます。
2. 収穫時に各フラップを重さ測り、後で浮腫の発生を定量化できるようにしてください。
3. 18-24Gのカニューレで動脈をカテーテル挿入し、5-0シルク縫合結紮で内腔内に固定します(図7)。
   注:本実験では、細胞保護剤の評価を単一注射で行うため、24Gカニューレで皮弁をカテーテル化しました。 体外 機械灌流や体外膜酸素化(ECMO)の適用では、より大きな18-20-Gカニューレでカニュレーションを行うべきです。体 外 灌流中にカテーテル閉塞が発生した場合は、ヘパリン化生理食塩水で優しく洗浄するか、カニューレを交換して血流を回復させます。低灌流圧(<25 mmHg)を維持することで再発を防ぐことができます。
4. 造影剤をカテーテルから穿支動脈内に注入し、透視検査で弁を評価します(図8)。
   注意:造影剤は小毛細血管をフラップ全体で均一に放射不透性にし、選択したペディクルが十分な灌流領域を提供していることを示す。この段階では、灌流されていない領域の存在によりモデルがさらなる研究使用に適さなくなったり、弁の遠位部分の切除が必要になることがあります。採取されたフラップは、その後実験プロトコルに使用され、灌流装置やECMO装置に置かれ、または細胞保護剤として試験溶液を注入することが可能です。直径1mmから8mmのパンチ生検は、皮弁の完全性を損なうことなく異なるタイミングで実施でき、組織内の組織学的変化を動態的に評価することが可能です。

図6:研究用DIEPフラップの収穫後の様子。 (A) 採取されたDIEPフラップは、血管ペディクルを解剖・分離したマイクロ外科的鉗子で示されています。動脈端は数ミリ切り詰めてきれいに切り、マイクロ拡張鉗子で内腔を優しく開けます。(B) 顕微外科的鉗子が優位穿孔動脈を固定し、造影剤注入のために24Gカテーテルが腔内に挿入されている様子をクローズアップで見せています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:DIEPフラップペディクルのカテーテル化。 (A) カテーテルは5-0シルク縫合糸で優しく結び、脚の内腔を塞がないように固定されます。(B)注射器を取り付けていないカテーテルの位置、血管内腔へのカテーテル挿入の範囲を示す図。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:血管解剖学を示すDIEPフラップの収穫後の透視。(A,B) 造影剤を24-Gカテーテルを通じて優位穿支動脈に注入し、分岐パターンと血管化領域を示し、2つの異なる皮弁でのフラップの有効性を確認します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

結果

本研究に含まれた6人の女性患者から11枚のフラップを採取しました。フラップ手術と腹部形成術に精通した2人の上級形成外科医が解離を行いました。ある患者では、解離の問題により片側でフラップを摘出しました。採取されたフラップの平均重量は198.6 ± 24.4 g(n = 11)、平均サイズは10 cm× 6 cmで、これらのフラップが使用された保存研究のサンプル要件に合致していました。緩やかな張力で測定した脚柄の長さは平均3.85 ± 0.74 cmで 、キャリパーで測定した外血管径は1.2 ± 0.3 mmでした。 カテーテルは平均1.75cm(n=2)まで挿入されていることが観察されました。すべての弁は動脈造影で良好な灌流を示し、前回の研究で同様に均質かつ完全な血管充填が認められました¹⁵。

臍帯移植を伴う標準腹部形成術の平均手術時間は、6名の症例シリーズにおける合計123±24分でした。これら6件の手術間で手術時間に有意な差は認められませんでした(p

ディスカッション

ヒトモデルは動物実験から臨床実践への研究結果の橋渡し役となり、前臨床研究の関連性と予測性を向上させます16,17,18。安全性と倫理的遵守を確保するために慎重に設計されなければならず、実験の範囲や侵襲性を制限することが多い¹⁷。4つの採取された皮弁全体で追加の解離は不要で、いずれの症例においても手術時間の大幅な延長はありませんでした。このフラップの血管の比較的大きな直径(平均1.2mm)は、動物モデルと比べてカニュレーションが容易です。弁の灌流の臨床観察も腹部皮膚を通じて比較的容易です。臨床で一般的に用いられる弁(DIEPや腹直直筋筋[TRAM])とは異なり、この実験モデルでは腹直筋筋膜の切開や筋肉採取は行われません。したがって、記載されたフラップ柄は短いものの、その長さは実験的な保存研究に十分なままです(図10)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mLと5 mL Luer-Lok注射器	ベクトン・ディキンソン	https://www.bd.com/en-us/products-and-solutions/products/product-page.309646
11.5インチ中型および小型プレミアム Surgiclip II 自動縫合器クリップアプリ	コロビディエン	該当なし
22–24G血管カニューレ鈍先端	メドトロニック社	該当なし
5-0シルク縫合糸		該当なし	互換性のある縫合糸は
使い捨てのバッテリー駆動の焼灼ペン、	ヘルプメディカル、ヨーロッパ	該当なし	1200 & deg;C、ラージチップ
アドソン鉗子	MPM	106-2112A
双極性凝固鉗子	オルセン	20-1320I
使い捨てメス #15 	スカラー	該当なし
エオシン	マイクロム・マイクロテック	U/C0363
ファラブフリトラクター	メディクタ・インストゥルメンツ	該当なし
細かい針焼灼	コルメディカ	該当なし
OEC MiniView Max	GEヘルスケア	該当なし	透視システム
鉗子拡張器	WPI	15910
ヘマトキシリン	マイクロム・マイクロテック	U/C0303
イオヘキソール 300mg I/mL	GEヘルスケア・カナダ株式会社	該当なし
マイクロシザーズ	WPI	504492
バレーラボ単極ダイアサーミー	メドトロニック社
非イオンヨウ素化造影剤培地、Omnipaque 300 mg I/mL	GEヘルスケア	該当なし
携帯型音響ドップラー、8 MHz	パークス・メディカル・エレクトロニクス	https://www.parksmed.com/
生理食塩水 0.9%	ジェンデポ	S0600-101
標準的な形成外科器具セット	アスクラップ	該当なし	メスハンドルNo.3、メッツェンバウム&メイヨーハサミ、アドソン・アンド・ギリーズ鉗子、解離用はさみ、止血器、針ホルダーなどが含まれます。
斜視はさみ	サーテックス	102-4109
サージカルマーキングペン	カーディナルヘルス	212PR
縫合エチロン4.0および3.0	エティコン	1667G
組織鉗子	MPM	106-0511