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研究記事

HIF‐1α/BNIP3経路阻害 による オートファジーの調節による変形性膝関節症におけるヒドロキシルベニバナイエローAの分子機構

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DOI:

10.3791/69491

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2025年11月4日

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1Emergency Department, Zhanjiang Central People's Hospital, 2Management Department of Medicine, Zhanjiang Central People's Hospital, 3Department of Orthopedics and Traumatology, Zhanjiang Central People's Hospital, 4New Drug Research and Development Technology Center, School of Pharmacy, Sun Yat-sen University

この記事について

サマリー

ヒドロキシルベニバナイエローA(HSYA)は、HIF-1α/BNIP3経路阻害 を介して アポトーシスと炎症を抑制しながら、軟骨細胞のオートファジーと増殖を促進することにより変形性膝関節症を軽減します。

要約

軟骨組織におけるオートファジーの減少は変形性膝関節症 (KOA) の発症と密接に関連していますが、ヒドロキシルベニバナイエロー A (HSYA) が保護効果を発揮するメカニズムは完全には理解されていません。この研究では、ヒト KOA 軟骨細胞を単離し、正常対照、ブランク モデル、HSYA、低酸素誘導因子-1α (HIF-1α) 阻害剤、オートファジー誘導剤、HSYA と HIF-1α 阻害剤の併用、および HSYA とオートファジー誘導剤の併用。炎症誘発性サイトカイン(IL-1β、TNF-α、IL-6)をELISAで定量し、HIF-1α、BNIP3、オートファジー関連マーカーのタンパク質発現をウェスタンブロッティングで調べ、ミトコンドリアのオートファジー小胞をモノダンシルカダベリン染色と透過型電子顕微鏡で評価しました。正常対照と比較して、ブランクモデル群は、IL-1β、TNF-α、IL-6、およびHIF-1αのレベルが大幅に増加し、アポトーシス率の上昇、増殖の減少、およびオートファジー関連タンパク質のダウンレギュレーションを伴いました(P < 0.05)。HSYA、HIF-1α阻害剤、またはオートファジー誘導剤による治療により、オートファジー関連タンパク質の発現が有意にアップレギュレートされ、炎症性サイトカインレベルが低下しました。さらに、HSYA と HIF-1α 阻害剤またはオートファジー誘導剤を組み合わせると、最も顕著な効果が得られ、サイトカイン放出とアポトーシスが著しく減少し、軟骨細胞増殖とミトコンドリアオートファジー小胞形成が促進されました (P < 0.05)。これらの発見は、HSYA が少なくとも部分的には、HIF-1α/BNIP3 経路の阻害を通じて KOA で軟骨保護効果を発揮し、それによってオートファジーを促進し、軟骨細胞の炎症性損傷を軽減することを示しています。

概要

変形性膝関節症 (KOA) は、蔓延する慢性整形外科疾患として、中高年層に影響を及ぼし、生活の質に大きな影響を与えます 1,2。KOA は広く発生しているにもかかわらず、KOA の根底にある正確な病因と病態生理学的メカニズムは依然として完全には理解されていません。さらに、予防と治癒の両方において、この状態の複雑な病理学的基盤を解明することが緊急であることを強調しています。新たな関心の分野の 1 つは、軟骨恒常性におけるオートファジーの役割であり、軟骨組織内のオートファジーの低下が KOA の変性に寄与することを示唆する証拠が蓄積されています 3,4。

オートファジーは、細胞の恒常性を維持するために不可欠な細胞分解プロセスであり、軟骨の維持と修復において非常に重要です。関節軟骨内に蔓延する低酸素微小環境では、低酸素誘導因子 1α (HIF-1α)/アデノウイルス E1B 19 kDa 相互作用タンパク質 3 (BNIP3) シグナル伝達経路がオートファジーの極めて重要な調節因子として浮上します。HIF-1α 発現の上昇が KOA 患者で観察されており、この経路の調節不全がオートファジーの障害とその後の軟骨変性に寄与する可能性があることを示唆しています 5,6,7。

鍼治療、灸、ハーブ、マッサージは、膝関節炎を治療するための伝統的な中国医学の 4 つの古典的な方法です。非ステロイド性抗炎症薬、ヒアルロン酸注射、関節形成術などの現在の治療法は、有用であることが証明されていますが、特定の副作用も伴います8。さらに、変形性膝関節症に推奨される日常的な治療法はありません。時間が経つにつれて、KOA の一般的な補完療法として、伝統的な中国医学 (TCM) は、KOA9 の治療に有望であることを示す多数の漢方療法を開発してきました。これらの中で、ヒドロキシルベニバナイエローAは、その抗炎症作用とオートファジー調節作用により大きな注目を集めています10,11。しかし、HSYA が変形性膝関節症 (KOA) に治療効果を発揮する正確なメカニズム、特に HIF-1α/BNIP3 経路を介したオートファジーの調節という点では、依然として不明です。そこで、KOAにおけるHSYAの治療効果のメカニズムを、軟骨細胞オートファジーへの影響とHIF-1α/BNIP3経路との相互作用に着目して検討します。HSYA は、HIF-1α/BNIP3 経路阻害を介してアポトーシスと炎症を抑制しながら、軟骨細胞のオートファジーと増殖を促進することにより変形性膝関節症を軽減するという仮説を立てています。

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プロトコル

ヒトサンプルを含むすべての手順は、湛江中央人民病院の倫理委員会によって承認されました (承認番号。KY-YS-2021-09)。サンプル採取前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 患者と研究デザイン

変形性膝関節症 (KOA) と診断され、人工膝関節全置換術を受けている 30 人の患者が募集されました。コホートには、52〜75歳(平均±SD:64.3±12.6歳)の男性14名と女性16名が含まれ、全員が米国リウマチ学会のKOA基準12を満たしていました。手術前2週間以内に非ステロイド性抗炎症薬またはステロイドを投与されたか、1か月以内に関節内注射を受けた患者は除外された。

2.初代軟骨細胞培養

関節軟骨は、手術直後に無菌条件下で収集され、冷たいPBSに入れられました。滅菌メスを使用して、軟骨を氷のように冷えたガラス板上で~1 mm³の断片に切断し、10 mLの0.25%トリプシン-EDTAを含む50 mLの遠心分離管に移しました。チューブを37°Cの振とう水浴中で80rpmで30分間インキュベートし、消化を促進するために5分ごとに穏やかに反転させました。上清を吸引し、組織ペレットをPBSで1回洗浄し、200 × g で5分間遠心分離しました。次に、ペレットを10 mLの0.02%II型コラゲナーゼに再懸濁し、振とうしながら37°Cで4時間消化しました。懸濁液を30分ごとに上下にピペットでピペッティングして解離を促進し、70μmのストレーナーに通し、200 × g で5分間再度遠心分離しました。得られたペレットを、10%FBS、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEMに再懸濁し、T25フラスコに播種しました。細胞を5%CO2とともに37°Cでインキュベートし、培地を2〜3日ごとに交換し、継代1〜2の細胞を実験に使用しました。実験群には、正常対照、ブランクモデル、HSYA (100 μmol/L)、HIF-1α 阻害剤 YC-1 (10 μmol/L)、ラパマイシン (10 nmol/L)、HSYA + YC-1、および HSYA + ラパマイシンが含まれていました。

3. siRNAを介したHIF-lα、BNIP3ノックダウン

初代軟骨細胞を2〜5×105 細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種し、30%〜50%のコンフルエンシーに達するまで37°Cで培養しました。各ウェルについて、5 μLの20 μM siRNAを250 μL Opti-MEMで希釈し、5 μLの脂質ベースのトランスフェクション試薬を250 μL Opti-MEMで個別に希釈しました。2つの溶液を穏やかに混合し、室温で15〜20分間インキュベートして複合体を形成しました。培地を10%FBSを含む1.5 mLの新鮮なDMEMに置き換え、siRNA-脂質複合体(500 μL)をウェル壁に沿って穏やかに旋回しながら滴下しました。細胞を6時間インキュベートし、培地を完全培地に交換し、培養を48〜72時間継続した。ノックダウン効率は、さらなる治療の前に qRT-PCR とウェスタンブロットによって検証されました。

4. ELISA

細胞培養上清を回収し、200 × g で 5 分間遠心分離し、必要に応じてアッセイバッファーで 1:2 に希釈しました。IL-1β、TNF-α、およびIL-6のELISAキットは、メーカーのプロトコルに従って使用されました。標準試料、ブランク、サンプルは3回に分けて実行されました。基質反応後、マイクロプレートリーダーを使用して15分以内に450 nmで吸光度を測定しました。

5. MTTアッセイ

軟骨細胞を100 μLの完全培地中で5,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、0時間、24時間、48時間、または72時間インキュベートした。各時点で、20 μLのMTT溶液(PBS中で5 mg / mL)を各ウェルに直接添加し、プレートを37°Cで30分間インキュベートし、ウェルの底に紫色のホルマザン結晶が見えるようになった。結晶を乱さずに上清を注意深く吸引し、各ウェルに150 μLのDMSOを添加し、プレートを100 rpmのシェーカーに10分間置いて結晶を完全に溶解しました。吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して490 nmで測定されました。代謝活性の高い細胞におけるシグナル飽和を避けるために、短いインキュベーション時間を選択しました。

6. フローサイトメトリー

細胞をトリプシン処理によって回収し、200 × g で 5 分間遠心分離し、冷たい PBS で 2 回洗浄しました。それらを 500 μL の結合バッファーに ~1 × 106 細胞/mL で再懸濁し、5 μL のアネキシン V-FITC と 5 μL PI を添加しました。穏やかに混合した後、細胞を室温で暗所で15分間インキュベートしました。サンプルをフローサイトメーターで分析し、サンプルごとに少なくとも10,000のイベントを収集しました(励起488 nm、発光FITC 530/30 nm、PI >600 nm)。アポトーシス細胞は、標準ソフトウェアを使用して定量化されました。

7.ウェスタンブロッティング

細胞を冷たいPBSで2回すすぎ、プロテアーゼ阻害剤を含む200 μLのRIPAバッファーで氷上で30分間溶解しました。細胞をプラスチック製のスクレーパーで掻き取り、ピペッティングして粘度を下げ、12,000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離しました。 上清を採取し、BCAアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。同量のタンパク質(30 μg)を5×ローディングバッファーと混合し、95°Cで5分間加熱し、10%〜12%のSDS-PAGEゲルで分離しました。電気泳動はスタッキングの場合は80 V、分離の場合は120 Vで実行し、タンパク質を300 mAでPVDF膜上に90分間転写しました。膜を5%脱脂乳中で室温で1時間ブロックし、一次抗体(1:1,000)とともに4°Cで一晩インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、メンブレンをHRP結合二次抗体(1:5,000)とともに室温で1時間インキュベートした。タンパク質バンドをECL基質で可視化し、化学発光検出システムを30〜120秒露光して画像化しました。バンド強度はImageJを用いて定量化し、GAPDHを負荷コントロールとして用いた。

8.モノダンシルカダベリン(MDC)染色

使用直前にストック溶液から50μMのMDC作業溶液を調製しました。細胞を1 mLの4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBSで2回洗浄し、500 μL MDC作業溶液と暗所で37°Cで30分間インキュベートしました。PBSで2回洗浄した後、カバーガラスを退色防止封入剤で接管し、蛍光顕微鏡(励起355 nm、発光512 nm)で観察した。

9. 透過型電子顕微鏡(TEM)

細胞を回収し、200 × g で 5 分間遠心分離してペレット化し、2% グルタルアルデヒドで 4 °C で一晩固定しました。サンプルをPBSで5分間3回洗浄し、ヒュームフード内で4°Cで1%四酸化オスミウムに1時間ポスト固定しました。脱水は、30%、50%、70%、90%、および100%の段階的なアセトンシリーズを介してそれぞれ10分間実行されました。サンプルに1:1のアセトン/エポキシ樹脂を1時間浸透させた後、純粋な樹脂を一晩浸透させました。包埋を新鮮な樹脂中で行い、60°Cで48時間重合した。50〜70nmの極薄切片をウルトラミクロトームで切断し、200メッシュの銅グリッドに取り付け、2%酢酸ウラニルで30分間染色し、続いてクエン酸鉛で15分間染色し、蒸留水で洗浄し、自然乾燥させ、80kVの透過型電子顕微鏡で検査しました。安全上の注意として、グルタルアルデヒドと四酸化オスミウムは有毒で揮発性であるため、手袋と保護メガネを着用したヒュームフードでのみ取り扱う必要があります。廃棄物は、施設の安全プロトコルに従って、指定された危険容器に廃棄する必要があります。

10. 統計分析

すべての実験は3回に分けて実施されました。データは平均± SD として表されます。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続く LSD 事後検定を使用して評価され、P < 0.05 が有意であると見なされました。

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結果

軟骨細胞炎症誘発性サイトカイン(IL‐1β,TNF‐α,IL‐6)発現に対するHSYAの影響
正常な対照群と比較して、他のすべてのグループは、炎症誘発性サイトカイン(IL-1β、TNF-α、およびIL-6)の有意な上昇を示しました(P < 0.05、表1、図1A-G)。HSYA、HIF-1α 阻害剤、オートファジー誘導剤、HSYA + HIF-1α 阻害剤、または HSYA + オートファジー誘導剤による治療は、ブランク モデル グループと比較してサイトカイン レベルを有意に低下させました (P < 0.05)。このうち、併用治療(HSYA + HIF-1α阻害剤またはHSYA +オートファジー誘導剤)はサイトカイン発現をさらに低下させ、モデル群と比較して約35%〜40%減少しました(P < 0.05)。遺伝子干渉実験(図1H-J

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ディスカッション

変形性関節症 (OA) は、蔓延する慢性疾患であり、患者の生活の質を著しく損ないます。さまざまな OA サブタイプの中で、KOA が最も一般的であり、世界的な疾病負担の一因となっています。発生率が高いにもかかわらず、KOA の正確な病因と根底にある病態生理学的メカニズムはとらえどころのないままです。関節軟骨内の機械的プロセスと生化学的プロセスの間の複雑な相互作用、特に軟骨細胞機能の調節は、KOA の病因において非常に重要です。特に、オートファジー活性の著しい低下が、KOA の開始と進行における極めて重要な要因として浮上しています13,14。したがって、オートファジーの強化は、軟骨細胞の生存を促進し、疾患の重症度を軽減するための有望な治療戦略となります。

変形性膝関節症 (KOA) の管理は、段階的な原則に従います。非薬物治療(減量、運動、理学療法など)が基礎となります。副作用がなく、変性を遅らせるこ...

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開示事項

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

謝辞

この研究は、広東省の伝統的な中国医学局の支援を受けました

(助成金番号20221446)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1% 四酸化オスミウム電子顕微鏡科学19150TEM分析のためのさらなる定形および染色サンプル
2% グルターアルデヒドシグマ・オルドリッチG5882TEM試料準備のためのセル固定
4% パラホルマルデヒドサービスバイオG1101MDC染色およびTEM試料準備のためのセル固定
AG1478セレック・コーポレーションS1005ラットモデルにおける20 mg/kgの静脈注射、ErbB受容体キナーゼ阻害剤
Annexin V-FITC/PI アポトーシス検出キットバイオスワンプBS3030フローサイトメトリー検出のためのアポトーシス細胞の染色
オートファジー誘導物質(RAPA)シグマ・コーポレーションR0395ラパマイシン、オートファジー誘導物質、軟骨細胞実験で10 nmol/Lで使用
ベクリン1抗体サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-48341オートファジー関連タンパク質ベクリン1のウェスタンブロット検出用一次抗体
BNIP3抗体サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-517348BNIP3のウェスタンブロット検出のための一次抗体
二酸化炭素インキュベーターイーヘンBPN-150CW細胞培養のために
ジメチルスルオキシド(DMSO)シグマ・オルドリッチD2650MTTアッセイでホルマザン結晶を溶解します
DMEMビヨタイムC0001軟骨細胞培養用に10% FBSを補う細胞培養培地
ELISAマイクロプレートリーダーサーモフィッシャー・サイエンティフィックマルチスカンFCELISAおよびMTTアッセイにおけるOD値を測定
増強化学発光(ECL)試薬サーモフィッシャー・サイエンティフィック32106ウェスタンブロットでタンパク質バンドを可視化
エポキシ樹脂(EPON812)電子顕微鏡科学14120TEM断片のための埋め込みサンプル
FBSビヨタイムC0205軟骨細胞栄養のためにDMEMに加えた胎児用牛血清
フローサイトメーターベックマン(アポトーシスで言及)CytoFLEX S軟骨細胞のアポトーシス速度と細胞マーカーを検出します
蛍光顕微鏡オリンポスIX73MDC染色された自己吸収小胞を観察
ジェルイメージングシステムバイオ・ラッドケミドック XRS+ウェスタンブロットからタンパク質バンドを捕捉・定量
HIF-1&α;抗体サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-13515HIF-1およびαのウェスタンブロット検出用一次抗体;
HIF-1&α;阻害剤(YC-1)セレック・コーポレーションS1047HIF-1&α;経路阻害剤は10およびミューで使用されました。細胞実験におけるmol/L
高速冷蔵遠心分離機エッペンドルフ5430R部品分離に使用
HRP結合二次抗体ジャクソン免疫研究115-035-003ウエスタンブロットで一次抗体に結合し、シグナル増幅を行います
IL-1とベータ;ELISAキット聖公生物学C5236IL-1とベータを定量化します。ELISAによる細胞上清液のレベル
IL-6 ELISAキット聖公生物学C5237ELISAを用いて細胞上清液中のIL-6レベルを定量化
LC3抗体サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-398822オートファジー関連タンパク質LC3のウェスタンブロット検出のための一次抗体
リポフェクタミン3000試薬サーモフィッシャー・サイエンティフィックL3000001タンスフェーション用の脂質系トランスフェクション試薬
モノダンシルカダベリン(MDC)シグマ・オルドリッチD40080.05 mol/L、蛍光顕微鏡用に自己吸収性小胞を染色します
MTT試薬ビヨタイムC00090.5 mg/mL、軟骨細胞増殖を評価するためにMTTアッセイで使用
ナノドロップ2000サーモフィッシャー・サイエンティフィックND-1000RNAの濃度を決定する
NRG1 ELISAキットアブカム(イギリス)AB213961ELISAを用いて心臓組織内のNRG1濃度を測定
P62抗体サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-28359オートファジー関連タンパク質P62のウェスタンブロット検出のための一次抗体
リン酸化Erb4(p-Erb4)抗体親近感AF3445活性化ErbB4のウェスタンブロット検出用一次抗体
PrimeScript RT Reagent KitタカラRR047AqPCR実験のテンプレートを提供するためのRNA逆転写
リアルタイム定量PCRシステムバイオ・ラッドCFX96RT-PCR検出のための
組換えヒトNRG1(rh-NRG1)R&Dシステムズ396-HBラットモデルにおけるNRG1/Erb4経路活性化のための5 mg/kg静脈注射
RIPAバッファメイルンビオMA0151プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤を用いた溶解バッファー(タンパク質抽出用)
サフラワーイエローA(HSYA)成都万西バイオテクノロジー有限公司Must-160601カルタマス・ティンクトリウスL.のバイオアクティブ成分は100 & μで使用;軟骨細胞治療のためのmol/L
SDS-PAGE機器バイオ・ラッドミニプロテアン・テトラウェスタンブロットでは分子量でタンパク質を分離します
TBグリーン・プリミックス エクス・タックIIタカラRR820AqPCR実験のために
TNF-およびα;ELISAキット聖公生物学C5238TNF-およびαを定量化します。ELISAによる細胞上清液のレベル
総ErbB4抗体プロテインテック1994年1日全ErbB4のウェスタンブロット検出のための一次抗体
透過電子顕微鏡(TEM)日立(オートファジ性小胞で言及)H-7650超微構造レベルでミトコンドリアの自己食性小胞を観察
トリゾール試薬サーモフィッシャー・サイエンティフィック15596026RNA抽出のために
トリプシン-EDTAGibco(サーモフィッシャー)25200056関節軟骨の酵素的消化に用いられ、軟骨細胞を分離するために
タイプIIコラーゲン酵素(0.02%)ワージントン・バイオケミカルCLS-2軟骨組織を消化して軟骨細胞を分離します
&β;カテニン抗体サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-7963ウェスタンブロット正規化のための内部参照抗体

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