HIF‐1α/BNIP3経路阻害 による オートファジーの調節による変形性膝関節症におけるヒドロキシルベニバナイエローAの分子機構

変形性膝関節症 (KOA) は、蔓延する慢性整形外科疾患として、中高年層に影響を及ぼし、生活の質に大きな影響を与えます ^1,2。KOA は広く発生しているにもかかわらず、KOA の根底にある正確な病因と病態生理学的メカニズムは依然として完全には理解されていません。さらに、予防と治癒の両方において、この状態の複雑な病理学的基盤を解明することが緊急であることを強調しています。新たな関心の分野の 1 つは、軟骨恒常性におけるオートファジーの役割であり、軟骨組織内のオートファジーの低下が KOA の変性に寄与することを示唆する証拠が蓄積されています ^3,4。

オートファジーは、細胞の恒常性を維持するために不可欠な細胞分解プロセスであり、軟骨の維持と修復において非常に重要です。関節軟骨内に蔓延する低酸素微小環境では、低酸素誘導因子 1α (HIF-1α)/アデノウイルス E1B 19 kDa 相互作用タンパク質 3 (BNIP3) シグナル伝達経路がオートファジーの極めて重要な調節因子として浮上します。HIF-1α 発現の上昇が KOA 患者で観察されており、この経路の調節不全がオートファジーの障害とその後の軟骨変性に寄与する可能性があることを示唆しています ^5,6,7。

鍼治療、灸、ハーブ、マッサージは、膝関節炎を治療するための伝統的な中国医学の 4 つの古典的な方法です。非ステロイド性抗炎症薬、ヒアルロン酸注射、関節形成術などの現在の治療法は、有用であることが証明されていますが、特定の副作用も伴います⁸。さらに、変形性膝関節症に推奨される日常的な治療法はありません。時間が経つにつれて、KOA の一般的な補完療法として、伝統的な中国医学 (TCM) は、KOA⁹ の治療に有望であることを示す多数の漢方療法を開発してきました。これらの中で、ヒドロキシルベニバナイエローAは、その抗炎症作用とオートファジー調節作用により大きな注目を集めています^10,11。しかし、HSYA が変形性膝関節症 (KOA) に治療効果を発揮する正確なメカニズム、特に HIF-1α/BNIP3 経路を介したオートファジーの調節という点では、依然として不明です。そこで、KOAにおけるHSYAの治療効果のメカニズムを、軟骨細胞オートファジーへの影響とHIF-1α/BNIP3経路との相互作用に着目して検討します。HSYA は、HIF-1α/BNIP3 経路阻害を介してアポトーシスと炎症を抑制しながら、軟骨細胞のオートファジーと増殖を促進することにより変形性膝関節症を軽減するという仮説を立てています。

ヒトサンプルを含むすべての手順は、湛江中央人民病院の倫理委員会によって承認されました (承認番号。KY-YS-2021-09)。サンプル採取前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 患者と研究デザイン

変形性膝関節症 (KOA) と診断され、人工膝関節全置換術を受けている 30 人の患者が募集されました。コホートには、52〜75歳(平均±SD:64.3±12.6歳)の男性14名と女性16名が含まれ、全員が米国リウマチ学会のKOA基準¹²を満たしていました。手術前2週間以内に非ステロイド性抗炎症薬またはステロイドを投与されたか、1か月以内に関節内注射を受けた患者は除外された。

2.初代軟骨細胞培養

関節軟骨は、手術直後に無菌条件下で収集され、冷たいPBSに入れられました。滅菌メスを使用して、軟骨を氷のように冷えたガラス板上で~1 mm³の断片に切断し、10 mLの0.25%トリプシン-EDTAを含む50 mLの遠心分離管に移しました。チューブを37°Cの振とう水浴中で80rpmで30分間インキュベートし、消化を促進するために5分ごとに穏やかに反転させました。上清を吸引し、組織ペレットをPBSで1回洗浄し、200 × g で5分間遠心分離しました。次に、ペレットを10 mLの0.02%II型コラゲナーゼに再懸濁し、振とうしながら37°Cで4時間消化しました。懸濁液を30分ごとに上下にピペットでピペッティングして解離を促進し、70μmのストレーナーに通し、200 × g で5分間再度遠心分離しました。得られたペレットを、10%FBS、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEMに再懸濁し、T25フラスコに播種しました。細胞を5%CO₂とともに37°Cでインキュベートし、培地を2〜3日ごとに交換し、継代1〜2の細胞を実験に使用しました。実験群には、正常対照、ブランクモデル、HSYA (100 μmol/L)、HIF-1α 阻害剤 YC-1 (10 μmol/L)、ラパマイシン (10 nmol/L)、HSYA + YC-1、および HSYA + ラパマイシンが含まれていました。

3. siRNAを介したHIF-lα、BNIP3ノックダウン

初代軟骨細胞を2〜5×10⁵ 細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種し、30%〜50%のコンフルエンシーに達するまで37°Cで培養しました。各ウェルについて、5 μLの20 μM siRNAを250 μL Opti-MEMで希釈し、5 μLの脂質ベースのトランスフェクション試薬を250 μL Opti-MEMで個別に希釈しました。2つの溶液を穏やかに混合し、室温で15〜20分間インキュベートして複合体を形成しました。培地を10%FBSを含む1.5 mLの新鮮なDMEMに置き換え、siRNA-脂質複合体(500 μL)をウェル壁に沿って穏やかに旋回しながら滴下しました。細胞を6時間インキュベートし、培地を完全培地に交換し、培養を48〜72時間継続した。ノックダウン効率は、さらなる治療の前に qRT-PCR とウェスタンブロットによって検証されました。

4. ELISA

細胞培養上清を回収し、200 × g で 5 分間遠心分離し、必要に応じてアッセイバッファーで 1:2 に希釈しました。IL-1β、TNF-α、およびIL-6のELISAキットは、メーカーのプロトコルに従って使用されました。標準試料、ブランク、サンプルは3回に分けて実行されました。基質反応後、マイクロプレートリーダーを使用して15分以内に450 nmで吸光度を測定しました。

5. MTTアッセイ

軟骨細胞を100 μLの完全培地中で5,000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、0時間、24時間、48時間、または72時間インキュベートした。各時点で、20 μLのMTT溶液(PBS中で5 mg / mL)を各ウェルに直接添加し、プレートを37°Cで30分間インキュベートし、ウェルの底に紫色のホルマザン結晶が見えるようになった。結晶を乱さずに上清を注意深く吸引し、各ウェルに150 μLのDMSOを添加し、プレートを100 rpmのシェーカーに10分間置いて結晶を完全に溶解しました。吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して490 nmで測定されました。代謝活性の高い細胞におけるシグナル飽和を避けるために、短いインキュベーション時間を選択しました。

6. フローサイトメトリー

細胞をトリプシン処理によって回収し、200 × g で 5 分間遠心分離し、冷たい PBS で 2 回洗浄しました。それらを 500 μL の結合バッファーに ~1 × 10⁶ 細胞/mL で再懸濁し、5 μL のアネキシン V-FITC と 5 μL PI を添加しました。穏やかに混合した後、細胞を室温で暗所で15分間インキュベートしました。サンプルをフローサイトメーターで分析し、サンプルごとに少なくとも10,000のイベントを収集しました(励起488 nm、発光FITC 530/30 nm、PI >600 nm)。アポトーシス細胞は、標準ソフトウェアを使用して定量化されました。

7.ウェスタンブロッティング

細胞を冷たいPBSで2回すすぎ、プロテアーゼ阻害剤を含む200 μLのRIPAバッファーで氷上で30分間溶解しました。細胞をプラスチック製のスクレーパーで掻き取り、ピペッティングして粘度を下げ、12,000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離しました。 上清を採取し、BCAアッセイを用いてタンパク質濃度を測定した。同量のタンパク質(30 μg)を5×ローディングバッファーと混合し、95°Cで5分間加熱し、10%〜12%のSDS-PAGEゲルで分離しました。電気泳動はスタッキングの場合は80 V、分離の場合は120 Vで実行し、タンパク質を300 mAでPVDF膜上に90分間転写しました。膜を5%脱脂乳中で室温で1時間ブロックし、一次抗体(1:1,000)とともに4°Cで一晩インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、メンブレンをHRP結合二次抗体(1:5,000)とともに室温で1時間インキュベートした。タンパク質バンドをECL基質で可視化し、化学発光検出システムを30〜120秒露光して画像化しました。バンド強度はImageJを用いて定量化し、GAPDHを負荷コントロールとして用いた。

8.モノダンシルカダベリン(MDC)染色

使用直前にストック溶液から50μMのMDC作業溶液を調製しました。細胞を1 mLの4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定し、PBSで2回洗浄し、500 μL MDC作業溶液と暗所で37°Cで30分間インキュベートしました。PBSで2回洗浄した後、カバーガラスを退色防止封入剤で接管し、蛍光顕微鏡(励起355 nm、発光512 nm)で観察した。

9. 透過型電子顕微鏡(TEM)

細胞を回収し、200 × g で 5 分間遠心分離してペレット化し、2% グルタルアルデヒドで 4 °C で一晩固定しました。サンプルをPBSで5分間3回洗浄し、ヒュームフード内で4°Cで1%四酸化オスミウムに1時間ポスト固定しました。脱水は、30%、50%、70%、90%、および100%の段階的なアセトンシリーズを介してそれぞれ10分間実行されました。サンプルに1:1のアセトン/エポキシ樹脂を1時間浸透させた後、純粋な樹脂を一晩浸透させました。包埋を新鮮な樹脂中で行い、60°Cで48時間重合した。50〜70nmの極薄切片をウルトラミクロトームで切断し、200メッシュの銅グリッドに取り付け、2%酢酸ウラニルで30分間染色し、続いてクエン酸鉛で15分間染色し、蒸留水で洗浄し、自然乾燥させ、80kVの透過型電子顕微鏡で検査しました。安全上の注意として、グルタルアルデヒドと四酸化オスミウムは有毒で揮発性であるため、手袋と保護メガネを着用したヒュームフードでのみ取り扱う必要があります。廃棄物は、施設の安全プロトコルに従って、指定された危険容器に廃棄する必要があります。

10. 統計分析

すべての実験は3回に分けて実施されました。データは平均± SD として表されます。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続く LSD 事後検定を使用して評価され、P < 0.05 が有意であると見なされました。

軟骨細胞炎症誘発性サイトカイン(IL‐1β,TNF‐α,IL‐6)発現に対するHSYAの影響
正常な対照群と比較して、他のすべてのグループは、炎症誘発性サイトカイン(IL-1β、TNF-α、およびIL-6)の有意な上昇を示しました(P < 0.05、表1、図1A-G)。HSYA、HIF-1α 阻害剤、オートファジー誘導剤、HSYA + HIF-1α 阻害剤、または HSYA + オートファジー誘導剤による治療は、ブランク モデル グループと比較してサイトカイン レベルを有意に低下させました (P < 0.05)。このうち、併用治療(HSYA + HIF-1α阻害剤またはHSYA +オートファジー誘導剤)はサイトカイン発現をさらに低下させ、モデル群と比較して約35%〜40%減少しました(P < 0.05)。遺伝子干渉実験(図1H-J)では、HIF-1αまたはBNIP3のsiRNAノックダウンにより、モデル+ブランク群と比較してサイトカインレベルが~25%〜30%減少しました。HSYA治療はこれらの効果をさらに高めました。具体的には、siHIF-1α + HSYA群のサイトカインレベルは、siHIF-1α +ブランク群よりも~20%低く、siBNIP3 + HSYA群のレベルは、siBNIP3 +ブランク群よりも~22%低かった(P < 0.05)。

軟骨細胞増殖に対するHSYAの影響
正常な対照群はベースライン増殖活性を示しましたが、ブランクモデル群は有意な減少を示しました(P < 0.05、 図2A)。増殖は、HSYA、HIF-1α阻害剤、またはオートファジー誘導剤による治療後に部分的に回復し、HSYA + HIF-1α阻害剤またはHSYA +オートファジー誘導剤の併用治療により著しく増強されました(P < 0.05)。siRNA実験(図2B)では、HIF-1αまたはBNIP3のノックダウンにより、モデル対照群と比較して増殖が~25%促進されました。HSYA 治療は増殖をさらに促進し、モデル群と比較して増殖が ~40% 高くなりました (P < 0.05)。

軟骨細胞におけるアポトーシスとオートファジー関連タンパク質発現に及ぼすHSYAの影響
ウェスタンブロット分析により、グループ間でタンパク質発現に有意差があることが明らかになりました(表2)。ブランクモデル群は、対照と比較して、HIF-1αの顕著なアップレギュレーションとLC3、P62、Beclin1、およびBNIP3の発現の低下を示しました(P < 0.05)。HSYA、HIF-1α阻害剤、またはオートファジー誘導剤による治療により、LC3、P62、Beclin1、およびBNIP3の発現が増加し、HIF-1αレベルが低下しました(P < 0.05)。HSYA + HIF-1α阻害剤またはHSYA +オートファジー誘導剤との併用治療は、ブランクモデル群と比較してLC3およびBeclin1レベルがほぼ2倍に増加し、最も大きな変化をもたらしました。P62は通常、オートファジーが活性化されると減少しますが、ここではHSYA処理後にそのレベルが上昇しました。これは、オートファゴソームの蓄積の増強または不完全なフラックスを示している可能性があり、この現象は軟骨細胞オートファジーの以前の研究でも報告されています。

軟骨細胞のアポトーシス率に及ぼすHSYAの影響
フローサイトメトリー分析により、ブランクモデル群は正常な対照群よりも有意に高いアポトーシス率を示したことが示されました(P < 0.05、 図3A、B)。HSYA、HIF-1α阻害剤、オートファジー誘導剤はそれぞれアポトーシスを減少させましたが、併用治療(HSYA + HIF-1α阻害剤またはHSYA +オートファジー誘導剤)はアポトーシス率が最も低く、ブランクモデル群と比較して~45%〜50%減少しました(P < 0.05)。siRNA実験では、アポトーシスはHIF-1αまたはBNIP3のノックダウンによっても減少し、HSYA処理によってさらに減少しました。

軟骨細胞におけるアポトーシス率とオートファジー小胞形成に及ぼすHSYAの影響
MDC染色とTEMイメージングにより、グループ間のオートファジー小胞形成の明らかな違いが明らかになりました(図4A-D)。ブランクモデル群は小胞のまばらな分布を示しましたが、HSYA、HIF-1α阻害剤、またはオートファジー誘導剤の処理は小胞数を増加させました。併用治療 (HSYA + HIF-1α 阻害剤または HSYA + オートファジー誘導剤) は最も顕著な増強をもたらし、モデル群と比較して TEM によって観察された小胞が約 2 倍増加しました。これらの所見と一致して、フローサイトメトリーによって測定されたアポトーシス率(図5A-E)は、併用治療群で最も低かった。

データの可用性:
この研究で生成されたすべてのデータは、 補足ファイル 1 で提供されています。

図1:各グループ(n = 3)における軟骨細胞炎症誘発性サイトカイン(IL-1β、TNF-α、IL-6)の発現。 (A-G)IL-1β、TNF-α、およびIL-6のタンパク質発現レベルは、ウェスタンブロッティング(WB)によって検出されました。(HJ)IL-1β、TNF-α、およびIL-6の含有量は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって測定されました(P < 0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:各グループにおける軟骨細胞増殖活性の比較(n = 3)。 (A) 治療群、および (B) HIF-1α および BNIP3 ノックダウン群、P< 0.05。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:各グループのアポトーシス率の比較(n = 3)。 (A)1、正常グループ。2、モデルグループ。3、HSYAグループ;4、HIF-1α阻害剤群;5、オートファジーグループ;6、HSYA + HIF-1α阻害剤群;7、HSYA + オートファジー誘導剤グループ。(B)HIF-1αおよびBNIP3遺伝子ノックダウングループ。正常対照群と比較して、*P < 0.05。空白のモデルグループと比較して、#P< 0.05です。HSYA + HIF-1α阻害剤群と比較して、& P< 0.05。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ミトコンドリアにおけるオートファジー小胞形成のTEMイメージング。(A)ブランクモデル。(B) HSYAグループ。(C) HIF-1α阻害剤群。(D)オートファジー誘導剤グループ。スケールバー = 1 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:各グループの細胞アポトーシス率に対するHSYAの影響(n = 3)。(A)ブランクモデル。(B) HSYAグループ。(C) HIF-1α阻害剤群。(D)オートファジー誘導剤グループ。(E) 通常の対照群と比較した各グループの合計分析、**P< 0.01。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:各グループの炎症誘発性サイトカインレベルの比較。正常対照群と比較して、*P < 0.05。空白のモデルグループと比較して、#P< 0.05です。HASY、HIF-1α阻害剤、オートファジー誘導剤で治療されたグループと比較して、&<0.05。

表2:異なるグループのタンパク質の比較。通常の対照群と比較して、*P< 0.05。HSYA、HIF-1α阻害剤、オートファジー誘導剤で治療されたグループと比較して、#P<0.05。

補足ファイル 1: 研究中に生成された生データ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する利益はないと宣言している。