研究記事

異なる生育期における カメリア・オレイフェラ の栄養分量と代謝の差異解析

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DOI：

10.3791/69560

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2026年3月17日

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1College of Resources and Environmental Engineering, West Anhui University, 2Anhui Provincial Engineering Laboratory for Conservation and Sustainable Utilization of Traditional Chinese Medicine Resources, West Anhui University, 3Anhui Key Laboratory of Biomimetic Sensing and Detection Technology, West Anhui University, 4College of Forestry and Landscape Architecture, Anhui Agricultural University, 5College of Life Sciences, Anhui Agricultural University, 6Traditional Chinese Medicine Institute of Anhui Dabie Mountain, West Anhui University

この記事について

サマリー

本記事は、 C. oleifera の葉の3つの成長および発育段階における栄養分含有量および関連する代謝経路に関する初の報告を行い、葉の老化の分子メカニズムを理解するための基盤を提供するプロトコルを提示します。

要約

C. oleiferaの栄養価、窒素代謝に関連する遺伝子発現、でんぷんおよびショ糖代謝の異なる成長期間の変化を示すために、C. oleifera 'Dabieshan 1'品種の葉は幼年(2歳)、初期果実期(6歳C. oleifera)、およびピーク果実期(10歳C. oleifera)で採集されました)が実験材料として選ばれました。初期開花期の葉サンプルに対して栄養素の決定とトランスクリプトームシーケンス解析が行われ、異なる生育期間におけるC. oleiferaの栄養素含有量および関連する代謝経路を体系的に研究しました。結果は、幼年期およびピーク結果期の両方で採集されたC. oleiferaの葉をKEGGデータベースで比較した結果、窒素代謝に関連する9つの相同遺伝子と、デンプンおよびショ糖代謝に関連する24個の相同遺伝子を区別しました。樹木の年齢が進むにつれて、C. oleiferaの葉における窒素代謝やデンプンおよびショ糖の代謝経路の変化が進みます。C. oleiferaはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ経路とショ糖生合成の両方を促進します。これにより、C. oleiferaの葉中の可溶性タンパク質と可溶性糖のレベルが増加しました。本研究は、C. oleiferaが栄養成長から生殖成長へと移行する過程で、窒素代謝、でんぷんおよびショ糖代謝、栄養素含有量の変化メカニズムについて新たな知見を提供します。この理論は、その果実期を理解するための理論的参考文献と、開花と果実を促進するための葉面肥料の適用方法を提供します。

概要

幼生期には、C. oleiferaは通常主幹が分かれておらず、主に栄養成長を遂げますが、花芽の分化や開花などの繁殖過程は持ち合わせていません。C. oleiferaの苗木接ぎ木では、成虫段階に入った春の芽を穂木として利用するのが一般的で、これらは開花を促す能力があります。しかし、植え付け初期のC. oleiferaは幼生期に、花芽の形成に苦労し、活発な植生成長のため花芽の分化が困難になることがあります。環境条件が花芽の形成を制限することがあります。それでも、C. oleiferaは幼生期を経て初次果実期に至り、最終的に果実のピークに達すると、徐々に通常の花芽形成と開花能力を発達させます。 C. Oleiferaは複雑な形状と、同時に果実と花が咲く特徴を持っています。初期の果実期には数枚の花を咲かせることもありますが、ピークの果実期に入るとより多くの花を咲かせます。C. oleiferaの最盛期には生殖成長が優勢となり、光、温度、水分、栄養素への需要が増加します。C. oleiferaのような木質果樹は開花前に長い成長期間を持つことが明らかであり、これにより栽培サイクルを短縮し早期の高生産性を達成する可能性が制限されています6。

窒素は植物の成長や発達に非常に重要です。植物の種類によって窒素の量が異なり、同じ種内でも成長期によって窒素含有量に大きな差が存在します。植物が生殖成長段階に移行すると、窒素は花、果実、種子などの器官に徐々に蓄積されます。窒素は酵素、タンパク質、特定のホルモン、核酸、その他の重要な物質に不可欠であり、代謝活動を指揮します8。花芽分化の過程は重要な転換点であり、植物を栄養期から生殖期へと移行させる複雑な発生過程を伴います。栄養素の蓄積は植物の花芽の分化の基本的な基盤となります。現在の合意では、花蕾の成功する分化は炭水化物の蓄積にかかっているとされています。果樹の花芽分化過程では、可溶性糖分の変動が直接的または間接的に過程に影響を与えます。研究により、Prunus salicinaの葉の炭水化物レベルと花芽分化には密接な相関関係があることが示されており、生理的な花芽分化期の水溶性糖レベルは花芽形態分化期よりも高く、P. salicinaは花芽分化中に炭水化物の急速な枯渇を経験しました11.それにもかかわらず、花芽分化中にフィカス・カリカで可溶性デンプン含有量に有意な変動が見られないという報告もあります。常緑植物は春の花芽分化期に子房内にデンプンを蓄積し、落ち葉植物は芽の休眠期にデンプンを貯蔵します。上記の情報から、花芽分化の際に種ごとに炭水化物含有量の変化の軌跡に違いがあると結論づけることができます。Yingら14は、ヴェルニシア・フォーディイにおける窒素代謝やショ糖・デンプンなどの基本的な気象経路に関与する重要な酵素遺伝子の発現パターンを、花芽分化の2段階で解析しました。この分析は、タングツリー花芽の生理学的および生化学的指標の動的変化と組み合わせられ、タングツリー花芽分化における栄養蓄積、利用、輸送、分布の詳細な解明を提供しました。Lai Chengchunらの研究では、2枚の葉を取り除くことで発現遺伝子であるショ糖リン酸合成酵素(SPS)、中性インバーターゼ(NI)、細胞壁インバーターゼ(CWI)、α-アミラーゼ(AMY)が調節され、糖合成とその後のデンプン蓄積を促進し、果実の成熟、芽の発芽、開花に必要な栄養基盤を提供することがわかりました13,15。

しかし、C. oleiferaの栄養素含有量、窒素代謝、でんぷんおよびショ糖代謝の変化に関する研究は、段階ごとにほとんど報告されていませんでした。ほとんどの研究は、単一塩基多型(SNP)マップの作成、SSRマーカーの開発、低温または高温条件下でのC. oleiferaの生理学的および分子的応答の解析に焦点を当てています。16,17,18,19,20。したがって、本研究では一般的なC. oleifera品種「Dabieshan 1」を選定し、C. oleiferaの異なる生育期(幼生期、初期果実期、ピーク果実期)の春芽の葉サンプルを収集して栄養分および転写体の配列解析を行いました。目的は、C. oleiferaの葉で観察される成長と発達の各段階における栄養素含有量、窒素代謝、ショ糖およびデンプン遺伝子発現の違いを特定することでした。窒素代謝、ショ糖およびデンプンの代謝経路とそれらが関連栄養素と関係していることを明らかにすることで、C. oleiferaの花芽分化のメカニズムを研究する基盤を築き、C. oleiferaの開花の分子メカニズムを明らかにすることができます。

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プロトコル

1. 実験材料

C. オレイフェラ 「ダビエシャン1」の葉は、発生の3つの重要な段階で採取されました:約2歳の幼虫期、この個体は約6歳で早期の果実期に進み、最終的に約10歳でピークの果実期に達します。上記の3つの発育段階のすべての C. oleifera 植物は、C . oleifera 'Dabieshan 1'と同じ仕様のコンテナ栽培苗木を使用して植えられました。 C. oleifera 森林地帯の土壌の物理的および化学的性質は 表1に示されています。

2. コレクションサイト概要

実験材料は安徽省の中心に位置する和平鎮から収集されました。樹城県は省の中央部に位置し、大別山脈の周辺地域に属しています。座標は北緯31度11分、東経116度47分、平均標高は90メートルです。土壌は黄褐色に分類されます。この地域は湿潤な亜熱帯モンスーン気候パターンを持ち、年間平均気温は15.6°Cを維持し、年間降雨量は通常約1,100mm、年間約1,969時間の日照を享受し、霜のない期間は224日間あります。

3. サンプル採取と前処理

サンプルは開花前の期間(9月下旬)に選ばれました。各発育段階ごとに、類似し、一貫して、かつ強い成長を持つ C. oleifera の植物が選ばれました。各植物からは、C . oleifera 樹冠の外側の東、西、南、北方向から適度に伸びる春の芽を上から下へ取り除きました。サンプルにはシリアルの文字と数字が記されており、C . oleifera の葉は幼生期、早期果実期、ピーク果実期にそれぞれYAT1、YA2、YAT3と記されています。これらは液体窒素に収集・保管されました。各段階から5つのランダムサンプルツリーが1つの生物学的複製として選ばれ、すべての段階で3つの生物学的複製が設置されました。選ばれた標本は同日に実験室に持ち帰られ、-80°Cで保存されました。

4. 生理指標の決定

可溶性糖分はアントロン比色法21によって測定されました。有機炭素含有量は、二クロム酸カリウム酸化-硫酸鉄滴定法22によって測定されました。可溶性タンパク質の含有量は、Coomassie Briliant Blue法23によって得られました。総窒素濃度はKjeldahl法22によって定量化されました。

5. 完全なRNAの単離を行い、その後補完的なDNA(cDNA)ライブラリーの構築とその後のシーケンスが行われました

植物RNA抽出キットを用いて、C. oleiferaの葉から異なる段階で総RNAを抽出しました。全RNA濃度は全スペクトルの紫外線可視光度計で測定されました。RNAの完全性と明晰度は生物学的分析装置によって測定されました。cDNAライブラリの構築と検証後、配列ごとにシーケンスする高スループットシーケンシングプラットフォームを用いてトランスクリプトミックシーケンスが行われました。シーケンス手順により、それぞれ100塩基対24、25、26の個別リードが生成されました。シーケンスプロセスアラインメントの結果はRSEMソフトウェア27を用いて統計解析が行われました。C. oleiferaのさまざまな発生段階における差異発現遺伝子(DEGs)は、DESeq差分解析ソフトウェアを用いて同定されました28,29。

6. De novo アセンブリとUniGene注釈

SeqPrep http://github.com/jstjohn/SeqPrep)およびSickle(http://github.com/najoshi/sickle)は生データのフィルタリングに用いられ、低品質のシーケンスや汚染されたアダプターの除去が含まれていました。その後、各サンプルから得られたクリーンリードをTrinityソフトウェア30,31で組み立てました。組み立てられたすべての転写は、Swiss-Prot、真核生物完全ゲノムの直系同子群クラスター、KEGGデータベースに対してBLASTXアラインメントを順番に照射しました。典型的なカットオフE値(E値<10−5)が関数注釈を取得するために設定されました。KEGGは関連する代謝経路の解析に適用されました。

7. 遺伝子の機能注釈および差異発現遺伝子解析

遺伝子およびアイソフォームの豊富度はRSEMソフトウェアを用いて統計的に解析されました。差分発現遺伝子(DEGs)を特定するために、カットオフ(P < 0.05、FDR < 0.01、|log2FC|>1)を設定しました。転写本1kbあたりの推定断片数(FPKM)は、現在最も広く使われている遺伝子発現レベル推定の方法です。成長および発生の3段階(YAT1、YAS2、YAT3)のすべての遺伝子のFPKM値を計算しました。階層的クラスタリング解析を用いて遺伝子発現レベルの差異を調べました。一方、KEGG経路はKOBAS29を用いた全トランスクリプトームと比較して、ボンフェローニ補正P ≤0.05で代謝経路に有意に富むDEGsを特定するために準備されました。

8. 解析的手法

データはExcelを用いて平均値と標準偏差を算出しました。分散分析(ANOVA)はSPSSソフトウェアによる統計解析に用いられ、ダンカンの多重範囲検定は3段階間の栄養素含有量の有意な差異を評価するために用いられました。その後、グループ間の有意差を、LSD(最小有意差)法による事後多重比較を用いて決定しました。グラフやチャートはOriginソフトウェアを用いて、実験的および分析的な結果を可視化しました。統計的有意性は「ns」で示されませんでした(P > 0.05)。統計的に有意な差は、それぞれ「*」(P < 0.05)、「**」(P < 0.01)、「***」(P < 0.001)、および「****」(P < 0.0001)で示されました。

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結果

異なる生育時期におけるC. oleiferaの葉に含まれる窒素化合物含有量の比較

窒素は植物の成長と発達を促進する上で極めて重要であり、繁殖過程に深い影響を与えました。したがって、植物の窒素全体の含有量を理解することは研究において非常に重要です。C . oleifera の葉の総窒素含有量は、幼生期から果実開始、そして果実のピークに至るまで徐々に減少し、それぞれ14.76 g/kg、13.84 g/kg、13.21 g/kgの測定値が示されました(図1)。

図2は、異なる生育期間における可溶性タンパク質含有量の変動を示しています。 C. oleifera の葉中の可溶性タンパク質含有量...

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ディスカッション

水溶性糖は植物における重要なエネルギー源および構造的要素として機能し、さまざまな生理活動や生合成プロセスを支えています。可溶性糖分の変化は、果樹の植物芽から花芽への変換過程に直接的または間接的に影響を与えます。一部の研究では、豊富な可溶性糖の必要性が果樹の花芽分化にあったことが判明しています。可溶性タンパク質は物質合成において重要な役割を果たします。植物の花芽が分化する前に枝や葉に可溶性タンパク質が大量に蓄積され、花芽の発達に栄養的かつ構造的な基盤を提供することが観察されています34。可溶性タンパク質は植物の花器官形成の材料およびエネルギー基盤として機能し、花芽分化期間中にかなりの量が必要となります。この研究では、C . oleifera の葉の初期果実期およびピーク期における可溶性糖および可溶性タンパク質の含有量が...

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謝辞

本研究は安徽省自然科学基金若手研究者基金(2008085QC135)、万西学院博士研究作業所研究プロジェクト(WXBSH2020003)、安徽省博士後科学研究プログラム(2024A767)、安徽理工教員企業出向プログラム(2024jsqygz79)、および安徽省林業研究イノベーションプロジェクト文書番号4[2024]の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バイオアナライザー2100アジレント・テクノロジーズ社(米国)—RNAの完全性と明瞭度を評価するために使用
DESeqソフトウェアソースコード3.2微分式解析に使用
EASYspin Plusキット(Total RNA分離)エイドラボ・バイオテクノロジー株式会社(中国)RN 28(エイドラボ)C. oleiferaの葉から全RNA抽出に使用されます
HiSeq 2000 シーケンシングプラットフォームイルミナ(中国)—トランスクリプトームシーケンスに使用、リード長100塩基基
Kjeldahl method/Kjeltec 2300フォス・テカトル(スウェーデン)—総窒素濃度について(Bao 2007)
可溶性タンパク質の測定方法濃硫酸6104-58-1(アラジン)陳建勳(Chen et al. 2015)によって開発された手法
可溶性糖の測定方法アントロン90-44-8(マックリン)張志朗s方法(Zhangら 2003)
二クロム酸カリウム酸化 - 硫酸鉄滴定法二クロム酸カリウム硫酸鉄NA(アラジン)7782-63-0(アラジン)有機炭素測定のために(Bao 2007)
RSEMソフトウェアソースコード1.2.3配列アライメント統計解析に使用
サーモサイエンティフィック NanoDrop 2000C 分光光度計 ABI(アメリカ)—RNA濃度の測定に用いられます

参考文献

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