Research Article

高血糖刺激内皮細胞の統合トランスクリプトミクスおよびセクレトームプロテオミクス解析および標的化合物のスクリーニング

DOI:

10.3791/69578

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December 30th, 2025

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1Hebei Luoxue Innovation Medicine Research Institute, 2State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 3Hebei University of Chinese Medicine, 4Hebei Medical University, 5Chengde Medical University

In This Article

Summary

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本プロトコルは、トランスクリプトームとプロテオームの統合されたマルチオミクスパイプラインとネットワーク薬理学的スクリーニングを組み合わせ、糖尿病合併症における内皮機能障害の分子ドライバーおよび治療標的を特定することを目的としています。

Abstract

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内皮機能障害は糖尿病性腎疾患(DKD)の主な要因ですが、その全身的な分子メカニズムは完全に解読されていません。統合マルチオミクス解析により、高血糖誘発性内皮損傷をマッピングし、再利用可能な治療薬を特定できると仮説を立てました。再利用可能な計算パイプラインを用いて、高血糖性内皮細胞および糖尿病腎臓からのトランスクリプトミクス/セクレトームプロファイルを統合しました。この研究では、534の一般的に上位調節される遺伝子やタンパク質が特定されました。機能的豊富化により、細胞外マトリックスの再構築、細胞間コミュニケーション、炎症経路の活性化が明らかになりました。クロスデータベース検証により278の高信頼度メディエーターが精準化され、タンパク質間相互作用ネットワーク解析により10のハブ遺伝子が特定されました。ネットワーク薬理学を用いて、承認された薬剤ライブラリーをスクリーニングし、このネットワークを標的とする可能性のある複数の候補化合物(例:ブルーセアンチン、イデラシブ)を特定しました。さらに、転写因子調節や模範的な分子ドッキングシミュレーション(例:CTCF/BRD4を用いたイデラシブ)は、実験的検証のための機構的仮説を提供しました。結論として、本研究はDKDにおける内皮病原性メカニズムを明確にし、再利用可能な薬剤候補を指名する再利用可能なマルチオミクスフレームワークを確立し、メカニズム的かつ治療的発見のための戦略的アプローチを提供します。

Introduction

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糖尿病は世界的な健康課題として、2021年に5億2,900万人に影響を及ぼし、2050年までに13億1,000万人が影響を及ぼすと予測されています。グリセミックコントロールを超えて、長期的な合併症が罹患率、死亡率、生活の質低下の主な原因となっています。これには、微小血管合併症(例:糖尿病腎疾患(DKD)、網膜症、神経障害)や大血管合併症(例:加速性動脈硬化)が含まれます。重要なのは、DKDが糖尿病患者の30%〜40%に影響を及ぼし、世界で末期腎疾患(ESRD)の主な原因であることです。これらの合併症の深刻な負担は、その根本的なメカニズムを標的とした新規治療法の緊急未充足の必要性を強調しています。

内皮細胞(EC)は、すべての血管の内壁を形成し、血管の健康の重要な門番です。高血糖誘発性内皮機能障害は、糖尿病性血管症および臓器損傷の中心的な要因となっています3,4。高血糖値はEC内で不適応反応の連鎖を引き起こし、一酸化窒素(NO)の生体利用能調節障害、エンドテリン-1(ET-1)分泌の増加、接着分子発現のアップレギュレーション(例:VCAM-1、ICAM-1)、過剰な活性酸素種(ROS)生成(例:NAD....

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Protocol

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動物実験は河北夷陵医学研究所動物研究倫理委員会(承認番号:N2024082)の承認のもと実施されました。本研究で使用される実験材料および機器については、 材料表 をご確認ください。トリゾール(皮膚・眼刺激物、フェノールを含む)やプロテアーゼ阻害剤(呼吸器・皮膚感作剤の可能性がある)などの有害試薬を扱う際は、適切な個人防護具(PPE)を厳格に着用しなければなりません。生物・液体廃棄物はオートクレーブ可能な袋に、有害化学廃棄物は施設の有害廃棄物処理用の指定された容器に分けてください。廃棄前に消耗品を除染してください。

糖尿病性腎症マウスのモデリング

オスのdb/dbおよびdb/mマウス(生後12週)は、特定の病原体なし(SPF)条件下で、22度±2°C、56%±湿度、12時間の明暗 サイクル、自由 に餌や水を得て飼育されました。1週間の順応期間の後、マウスには数値識別子がランダムに割り当てられ、実験群に割り当てられました。DB/dbマウスには6週間高タンパクの食事を与えられ、DKDを確立しました。良好なモデリングは、尿中のアルブミン対クレアチニン比(UACR)がdb/mと比較して有意に上昇していることで確認され、早期DKD12の主要な機能バイオマーカーとしてUAC....

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Results

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高血糖性内皮分泌物体が腎細管に与える病原性影響の実証

本研究は、高血糖性内皮分泌物の病原性効果の検証から始まりました。高血糖ヒト糸球体内皮細胞(HG-CM)からの条件付け培地は、対照群と比較してヒト近位小管上皮細胞(HK-2)の生存可能性を著しく低下させました。

この機能的証拠を基に、統合型糖尿病腎トランスクリプトミクスおよび高グルコース治療下の内皮分泌体解析(LC-MS/MS OF HG-CM)が実施されました。これにより、一致して上位調節された病原性遺伝子のコアセットと、それに対応する分泌タンパク質が特定されました。これらの共通の病原性標的を活用し、L1000CDS2化合物ライブラリーは、発現や活性を機能的に抑制すると予測された.......

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Discussion

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本研究は、統合されたマルチオミクスおよび計算的手法を通じて、高血糖誘発性内皮分泌物異常が糖尿病性腎障害の重要な要因であることを確立しました。腎細管に対するセクレトーム介有の細胞毒性が、534の内皮由来因子の系統的な異常と一致し、DKDの病因におけるマトリックスリモデリング、酸化ストレス、炎症コア経路に収束していることが示されています。278の高信頼度メディエーターの同定(機構的に検証されたCCL2、VWF、SERPINE1、THBS1(1.15から2630倍の共アップレギュレーションを示す)は、内皮転写再プログラミングが分泌される線維化促進・炎症効果にどのように変換されるかをマッピングし、重要な知識ギャップを解消した26,33。特に注目すべきはCCL2(MCP-1)で、これは単球/マクロファージを腎組織に誘導する強力なケモカインです。臨床的および実験的証拠は一貫してCCL2が糖尿病性腎障害進行の中心的媒介因子であり、その過剰発現はアルブミン尿、間質性炎症.......

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Disclosures

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著者たちは何も明かすことはありません。

Acknowledgements

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この研究は中国国家自然科学基金(32200644)、河北省科学技術プログラムプロジェクト(246W2501D、252W7716D)、および燕兆黄金プラットフォーム(A20240022)の支援を受けました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCL2 ELISAキットサーモフィッシャー・サイエンティフィック#88-7399-88
CCR2阻害剤メルク・ミリポール#227016
セルバイアビリティ検査キットセブン・バイオテクノロジーCCK-8、SC119-01
DNAシーケンサーイルミナノヴァセク6000
高性能液体クロマトグラフィーシステムサーモフィッシャー・サイエンティフィックUltiMate 3000 バイナリRSLC
HRGECの培養培地上海中枢新周バイオテクノロジー有限公司1001
ヒト腎臓糸球体内皮細胞(HRGEC)上海中橋新州バイオテクノロジープリ-H-00038
ヒト腎腎管上皮細胞完全培地 プロセルCM-H193
ヒト腎臓管状上皮細胞(HK2)プロセルCP-H193
オスのDB/d&mマウス(生後4週間)杭州紫源バイオテック有限公司SCXK 20190004
質量分析計サーモフィッシャー・サイエンティフィックアストラル
マイクロプレート吸光リーダー分子デバイススペクトラマックス iD5
プロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTAフリー)ロッシュcOmplete, #5056489001
RNA抽出試薬サーモフィッシャー・サイエンティフィックトリゾール、#15596026
RNA品質分析装置アジレント・テクノロジーズ5300フラグメントアナライザー、M5311AA
RNA定量装置サーモフィッシャー・サイエンティフィックQubit 3.0, Q33216
ROS検出キットサーモフィッシャー・サイエンティフィック#EEA019
超ろ過遠心装置(3 kDa MWCO)メルク・ミリポールアミコン ウルトラ4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuttle, K. R., et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference. Diabetes Care. 37 (10), 2864-2883 (2014).
  2. Gu, H. F. Genetic and Epigenetic Studies in Diabetic Kidney Disease. Front Genet. 10, 507(2019).
  3. Młynarska, E., ....

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