単細胞ヒストーンの翻訳後修飾(sc-hPTM2)の多重解析のための自動サンプル調製

Summary

ここでは、同位体2重ラベリング戦略とArgC消化を用いて、単細胞ヒストンの翻訳後修飾解析を自動化するプロトコルを紹介します。このワークフローにより、クロマチンの異質性およびエピジェネティック応答の定量的かつ再現性が高く高感度なプロファイリングが単一細胞分解能で実現します。

Abstract

ヒストン翻訳後修飾(hPTMs)はクロマチンの組織化と遺伝子発現の中心的な調節因子です。彼らの調節障害は発達、がん、老化に関与しています。hPTMを研究する際には質量分析法が主流ですが、ほとんどのプロトコルはバルクサンプル向けに設計されており、細胞間変動を解消することはできません。したがって、ヒストンPTM解析を単一細胞レベルに拡張することは不可欠ですが、ヒストンは存在量が少なくリジンが豊富で、重度に修飾されているため技術的には困難です。

ここでは、ナノ液体処理を用いたヒストンPTM解析のための自動化された単一細胞プロテオミクスワークフローについて説明します。このシステムは、最小限の取り扱いと高い再現性で個々の細胞をナノリットルスケールで処理することを可能にします。ワークフローにはArgCウルトラプロテアーゼによる消化が含まれており、アルギニン残基を切断し、ヒストンプロテオミクスで通常必要とされるリジン阻害誘導化の手順を回避します。条件間の定量比較を可能にするため、プロピオン無水物およびその重水素化類似物であるプロピオン無水物d10の二重ラベリング戦略を適用します。この自動サンプル調製、同位体多重化、ArgC Ultra消化の組み合わせにより、単細胞ヒストンPTM解析の効率的かつ感度の高いプロトコルが実現しています。

この手法により、クロマチンの異質性や単一細胞分解能におけるエピジェネティックな乱れの影響の調査が可能となります。ワークフローの実証として、HepG2/C3A肝細胞がん細胞から球状体を生成し、高アセチル化を誘導するヒストン脱アセチルゼ阻害剤であるブチレートナトリウムで処理しました。

Introduction

ヒストンはクロマチンの繰り返し単位であるヌクレオソームのタンパク質成分です。彼らのN末端の尾はリジンおよびアルギニン残基が豊富で、アセチル化、メチル化、リン酸化などの翻訳後修飾(PTM)によって強く調節されています。これらの修飾はDNAのアクセスに影響を与え、転写、複製、修復などのプロセスを制御します。変異したヒストンPTMパターンは、がんから神経変性^、加成に至るまでの疾患状態と強く関連しています^1,2。このため、ヒストンPTM解析はエピジェネティクスやプロテオミクスの研究において大きな関心を集めています。質量分析(MS)はヒストン修飾の部位特異的かつ定量的な分析を提供しますが、ヒストンは独自の分析課題を伴います。アミノ酸組成、複数の修飾部位、複雑な組み合わせパターンにより、通常のタンパク質よりも解析が困難です。確立されたプロトコルでは、化学的誘導化によって消化前にリジン残基をブロックし、ペプチド回収とクロマトグラフィー性能の向上を図っています³.大量解析では効果的ですが、これらの多段階の派生化プロトコルは単一セル入力に問題となる損失を生じさせることがあります。単一細胞解析は、生物学的システムが本質的に異質であるため、ますます重要になっています。バルクヒストンは多くの細胞間の平均シグナルを解析するため、この変動性を捉えきれません。細胞のサブポピュレーションはクロマチン状態が異なることがあり、これらの違いが発生、細胞の再プログラミング、薬物反応を促進することがあります^4,5。

ここでは、多重単細胞ヒストンPTM解析(sc-hPTM2)のための自動サンプル準備法を紹介します。この方法はCellenONEシステムに依存しており、個々の細胞やナノリットル規模の試薬を自動化的に精密に投与できます。この方法は、ナノプロテオーム試料調製法(nPOP)の変形であり、これはガラススライド⁶で液滴処理を初めて導入した方法です。nPOPプラットフォームは高度な自動単細胞プロテオミクスを備えていますが、標準的なトリプティック消化プロトコルはリシン含有量が高く修飾密度が高いためヒストンには最適とは言えません。ここでは、CellenONEシステムをプロピオン無水物によるゴールドスタンダードのヒストン誘導化に適応させ、同位体標識を導入することで、ヒストンの翻訳後の修飾を単一細胞分解能で正確かつ包括的に定量化できるようにしました。具体的には、タンパク質消化にArgCウルトラプロテアーゼを使用することでプロトコルを簡素化しています。トリプシンとは異なり、ArgCはアルギニン残基のみを切断し、リシンブロッキングを必要としません。これにより、二段階の派生化戦略が不要となり、プロトコルが簡素化されます。さらに、この手法はプロピオン無水物およびプロピオン無水物d10を用いた二重同位体標識スキームを採用しており、2つの細胞を同時に解析^{できます。}消化および標識後、単細胞サンプルは回収され、データ非依存取得(DIA)を用いた液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)/MSによって分析されます。私たちの手に入ったこの方法は、従来の方法と比較してヒストンPTMの定量において感度と再現性の両方を向上させることが示^{されています8。}

この方法を実証するために、HepG2/C3A肝細胞癌細胞由来の球状体における単細胞ヒストンのPTM動態をプロファイリングしました。これらの球体には、ヒストンアセチル化を増加させるヒストン脱アセチルゼ阻害剤である酪酸ナトリウムを処理^{しました。これは}クロマチン調節のプローブの基準となります。対照とナトリウムブチル酸処理球体を単一細胞分解能で比較することで、代表的な結果の原理実証を示し、クロマチン生物学およびがんエピジェネティクスにおけるより広範な応用の可能性を強調しました。特に、プロトコルに関しては、3D球体の成長と処理を記述した先行論文¹⁰、質量分析¹¹におけるヒストンペプチドの取得、およびEpiProfile¹²ソフトウェアを用いたデータ解析を参照しています。

Protocol

1. バッファーと試薬

1. HepG2/C3A細胞の細胞増殖培地:10%胎児用牛血清(FBS)、非必須アミノ酸(1% v/v)、L-グルタミン(1% v/v)、ペニシリン/ストレプトマイシン(0.5% v/v)を含むDulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM、4.5g/Lグルコース)を準備します。成長培地は4°Cで保存されます。
2. マスターミックス:ArgC Ultra 60 ng/μL、HEPES 6 mM、n -ドデシル-β-D-マルトシド(DDM) 0.03%、ジチオスレイトール(DTT) 10 mMをLC-MSグレードの水で調製します。
3. HA溶液:LC-MSグレードの水に1%(v/v)のヒドロキシアミンを準備します。
4. 洗浄液:0.1%(w/w)の蟻酸を含む50:50のアセトニトリル/水混合物(すべてLC-MSグレード)を10mL準備します。
5. モバイル相A(MPA) - 0.1%蟻酸:濃縮蟻酸1 mLをHPLCグレードの水999 mLに加え、よく混ぜます。
6. モバイルフェーズB(MPB) - 80% HPLC グレードアセトニトリル + 0.1% 蟻酸:HPLC グレードのアセトニトリル 800 mL を HPLC グレードの水 199 mL に加えます。次に、この溶液に1mLの濃縮蟻酸を加えて混ぜます。

2. 球状体の調製

1. 球状体の調製については、Stransky Sら¹¹を参照してください。
2. HepG2/C3A肝細胞がん細胞を回転式三次元(3D)バイオリアクターで5〜7日間培養し、均一な球状体形成を促進し、直径~400〜600μmに達するまで促進します。DMEMに10%のFBS、1%非必須アミノ酸、1%のL-グルタミン、0.5%のペニシリン/ストレプトマイシンを補足して使用してください。処理まで球状体は37°C、_CO2 濃度5%に保ちます。
   注: 図1A は参考文献で球状体を準備するために使用された装置を表しています。

3. 細胞培養と処理

1. 2 mLの増殖培地を含む組織培養6ウェルプレートに~10個の球状体を置きます。
2. 細胞を37°Cで加湿した5%_CO2 インキュベーターで培養します。
3. 球体は5 mMの酪酸ナトリウムで24時間処理するか、対照群には同じ量の水を加えます(図1B)。

4. 細胞分離および単細胞懸濁の調製

1. 処理24時間後、細胞を37°Cで1mLのトリプLEで3〜5分間培養します。
2. 球体が分解して単一セルが得られるまで、優しく上下にピペットを動かします。
3. 細胞を15 mLのチューブに採取し、最大10 mLまで氷のように冷たい1x PBSで希釈し、500gで4°Cで5分間遠心分離し、上清液を吸引します。
4. 細胞を1 mLの氷で冷たく1x PBSに再懸浮させ、最終濃度1 μMのSytoxグリーン死細胞染色を加えます。
5. 暗い環境で20分間、シトックスグリーンで細胞を氷の上で20分間孵育します。
6. 細胞を10mLの氷で冷たくした1xPBSで洗浄し、500gで遠心分離機で4°Cで5分間過ごし、上清液を吸引します。
7. 細胞を氷のように冷たく1xPBSを1mLに再懸浮させ、最終濃度0.5%のパラホルムアルデヒド(PFA)を加えます。
8. 細胞をPFAで氷の上で15分間潜伏させます。
   注:Sytox greenは通常、膜透過による固定と相容れませんが、細胞では固定後8時間経ってもSytox Green細胞の割合が変わらず、ヒストンタンパク質漏れの兆候はありません。
9. 細胞を10mLの氷で冷たくした1xPBSで洗浄し、500gで遠心分離機で 4°Cで5分間過ごし、上清液を吸引します。
10. 最終濃度200〜500 cells/μLで細胞を再構成します。
    注:沈着しにくい小さな細胞には500セル/μLの濃度が推奨され、沈着しやすい大きな細胞では200セル/μLの濃度が推奨されます。細胞懸濁液が凝集しやすい場合は、吸引前に40μmのストレーナーに通し、ノズルの詰まりを防ぎます。40μmを超える細胞が関心があり、試料中に存在する可能性が高い場合は、70μmのストレーナーを用いて非常に大きな集合体を除去できます。
11. 細胞は機器に積み込むまで氷の上に保管して選別します。

5. ソフトウェア接続とシステム初期化

1. cellenONEシステムを起動し(図2A)、制御コンピュータを起動し、ソフトウェアを起動して v2.0-nPOP2 ユーザーワークスペースを開きます。nPOPに必要なフィールドファイルや実行テンプレートはすべてそこにあらかじめ読み込まれています。
2. 機器のチラーが作動していることを確認し、機器が報告する内部温度に基づいて露点チェイス値を設定してください。
3. 画面上の説明に従い、スロット1および3にPDC-70コーティングタイプ2ディスペンシングノズル(図2B)を設置してシステムをプライムします。
4. 各ノズルのパルス幅と駆動電圧をメーカーのパッケージに記載された値に設定します。
   注意:2つの別々のノズルを使用することで、ディスペンスの一貫性が保たれます。1つはセル懸濁液を、もう1つは試薬を供給するため、ノズルに付着したゴミが後続の滴下を妨げることはありません。最終採取段階で両方のノズルを使用することで、サンプル回収も加速します。
   1. (重要な一歩)最大のピックアップ効率を得るためには、2つのノズル間のzオフセットは<50μmの差をつけるべきです。各ノズルの最適な接点位置を定義し、ノズルセットアップタブのZ高度表示を比較することでこれを決定してください。
5. 加湿器の貯水槽に脱イオン水を指定された充填ラインまで満たします。

6. 液体ハンドラーの事前実行設定

1. 準備するガラススライドの枚数(図2C)を選択します。この選択は、解析予定のセル数を直接的に定義します。
2. 2重性多重化方式(図3A)では、320セルのスライドを1枚にロードします。

7. スライドの縁にジメチル硫化物(DMSO)の「堀」を供給する

注: 図3B はDMSOの堀から始まるcellenONEの試料準備手順を示しています。液滴蒸発を防ぐ追加の対策として、スライドの縁に沿ってDMSOが散布されます。

1. メインタブで「 0_Dispense_DMSO_Moatまでのラン」を選択します。
2. ターゲット 設定 タブに行き、適切なスキームフォルダから DMSO_Moat.fld ファイルを読み込み、処理予定のスライド数に合わせてフィールド 数 を Yに設定します。
3. 新しいPCRチューブにLC-MSグレードDMSOを150μL分注し、チューブキャップを機器ドアに向けた状態でCellenWASHステーションの位置2に置きます。
4. 「ラン」タブを開き、「スタートラン」をクリックします。システムは10μLのDMSOを吸引し、液滴の安定性を確認するために一時停止します。自動ドロップテストドロップを3つ発射します(図4A);3つすべてが完璧に形成されている場合は、「Continue Run」をクリックしてください。
5. ディスペンス後、ノズルは自動的にフラッシュされ、機器はすべてのスライドで画像を撮影して品質管理を行います。画像を確認し、すべてのスライドで均一なDMSO滴を確認し、落下または目標外の滴がないか確認してください(図4B)。

8. DMSOの配薬

1. メインタブで「ラン・トゥ・1_Dispense_DMSO」を選択します。
2. ターゲットセットアップタブを開き、適切なスキームディレクトリからフィールドファイルDMSO.fld(図4C)を取り込み、処理予定のスライド数に合わせてフィールド数をYに設定します。
3. 新しいPCRチューブにLC-MSグレードDMSOを150μL分注し、チューブキャップを機器ドアに向けた状態でCellenWASHステーションの位置2に置きます。
4. 「ラン」タブを開き、「スタートラン」をクリックします。システムは10μLのDMSOを吸引し、液滴の安定性を確認するために一時停止します。オートドロップテストドロップを3回発射;3つすべてが完璧に形成されている場合は、「Continue Run」をクリックしてください。
5. 仕上げをディスペンする際、ソフトウェアは自動的にノズルをフラッシュし、すべてのスライドで画像を撮影して品質保証を行います。画像を確認し、すべてのスライドで均一なDMSO液滴を確認し、欠損や目標外の滴がないか確認してください。

9. 細胞の配分

1. メインタブで2_Dispense_Cellsまでのランを選択します。
2. ターゲット 設定 タブで、選択した多重化スキームディレクトリの Cells Field Files サブフォルダを開きます。
3. 実験には2つの条件があるため、ソート直前のサンプルに合うフィールドファイル(CellType_A.fldかCellType_B.fld)を選びます。
4. ファイルが読み込まれた後、 フィールド数 を Yに設定し、このランのスライド数の合計と等しくなります。
5. ステップ4.11のセル懸濁液を真空ポンプで氷の上で10分間脱ガスします。
6. 準備済みセル懸濁液150μLをクリーンなCellenVIALに移し、バイアルをCellenWASHカルーセルのスロット1に置き、キャップは機器ドアの方を向いています。
7. ノズルセットアップタブ>タスク実行を行って、バイアルからサンプルを吸引するTake10ul_CellenVIAL_nozzle1を実行してください。
8. ノズルセットアップタブに留まり、セルディスペンシングビューア(図5A)を起動し、サイズと伸長に基づいて射出ゾーンとゲートオブジェクトを定義するマッピングルーチンを実行します。図5Aに示された単細胞分離パラメータは、球状体から解離したHepG2/C3A細胞の分離に用いられる正確な設定に対応しています。
9. 次に 、T > Fを選択して蛍光モードを起動します。選択モードをネガティブに設定してください。サイズと強度の分離パラメータ範囲を最小値から最大値に拡大し、死んだ細胞が分離されないようにします。
10. マッピングパラメータで確認し、「 実行 」タブを開いて 「実行開始」をクリックし、ソフトウェアの指示に従ってください。ディスペンス終了時には、機器が自動的にノズルをフラッシュし、スライド画像を撮影して液滴の位置や均一性を確認します。
    注:セルソート中は、実行中に分離された各セルの画像が撮影されます(図5B)。
11. セルのソートが終わったら、ディスペンスウィンドウを閉じます。
12. セクション9が終わるまで、残ったセルの懸濁液は氷上に保管しておくこと。余剰分は後でバルクサンプル、経験的ライブラリ構築、または追加の検証研究に利用できます。

10. 消化マスターミックスディスペンス

1. メインタブで「ラン・トゥ・2_Dispense_Digest_10ulPickup」を選択します。
2. ターゲットセットアップタブを開き、適切なmultiplexing-schemeフォルダからDigest.fldを読み込み、フィールド数をYに設定して、このランのスライド数と等しいようにします。
3. 新鮮な消化マスターミックスを準備し、真空ポンプで氷の上で10分間脱ガスします(マスターミックス:ArgC Ultra 60 ng/μL、HEPES 6 mM、DDM 0.03%、DTT 10 mM、LC-MSグレードの水に溶かします)。
4. マスターミックス20μLをピペットで384ウェルプレートにし、そのプレートをX1システム内に置きます。
5. 「実行」タブで「開始実行」をクリックし、プロンプトに従ってください。システムが試薬を吸引した後、指示があれば液滴の安定性を確認します。
6. 仕上げをディスペンスすると、機器は自動的にノズルをフラッシュし、すべてのスライドを撮影します。各液滴が均一に消化混合物を受け取ったかどうかを確認するために画像を確認しましょう。
7. スライドは一晩孵化させ、指定された湿度と露点の設定を維持して消化します。各液滴には~13.5 nLの消化混合物が含まれています。消化は相対湿度~75%で一晩行い、露点はチャンバー温度より1〜2°C低く保ち、液滴の蒸発を防ぎます。

11. 一晩の孵化

1. メインタブで4_Incubation_16hのランを選択します。
2. 「ラン」タブに切り替え、「スタートラン」をクリックします。
   注意:機器は30分ごとにスライドの写真を撮影し、飛沫の状態を監視します。孵化中に乾燥や膨張が起きた場合は、必要に応じて露点設定を調整してください。
3. インキュベーションが完了すると、インキュベーション完了のメッセージが表示されます。
   注:酵素から基質へのより効果的な条件下では、急速消化(≤4時間)が可能かもしれません。ここでは評価されなかったため、検証された条件は16時間のままです。

12. 蒸発

注意:ラベル付け作業に進む前に、水滴の状態を確認し、水で膨張しすぎていないか確認することをお勧めします。水はラベル表示の効率を妨げる可能性があります。この目的のために蒸発相が推奨されます。

1. メインタブで5_Evaporationのランを選択します。
2. ファイル、冷却ユニット制御、露点制御の部分で固定制御温度を23°Cに設定してください。
3. 「ラン」タブに切り替え、「スタートラン」をクリックします。乾燥は5分間続き、機器は乾燥後自動的にスライドの写真を撮影します。
4. 写真を調べてください;水滴が十分に乾いたら、流しを止めます。もしそうでなければ、 続け てさらに5分間乾燥させてください(図6A)。
5. 走り終わったら、以前の デューポイントコントロールに戻してください。

13. ラベルの発行

1. メインタブで6_Dispense_PA_Labelsを選びます。
2. ターゲット設定タブに行き、適切なスキームフォルダからLabels.fldファイルを読み込み、処理予定のスライド数に合わせてフィールド数をYに設定します。
3. CellenWASHステーションのスロット2にLC-MSグレードDMSOを150μLアリコートで注入します。
4. 多重ヒストン誘導化用の2つの標識株のストック溶液を準備します:DMSOに25%(v/v)プロピオン無水物、25%(v/v)プロピオン無水物-_d10 をDMSOで使用します。
   注意:気泡の発生を最小限に抑えるため、両方の溶液を板に移す前に脱ガスしてください。
5. 各ラベル試薬を20μLを384ウェルプレートの指定ウェルに分散し、プレートをX1システム内に設置します。各液滴には~10 nLの標識試薬(25%プロピオン酸無水物または25%プロピオン酸無水物-_d10 in DMSO)が受け取ります。
6. 「Run」タブに切り替え、「Start Run」をクリックし、指示に従ってください。
7. ラベルをスライド上で1時間反応させます。
8. ディスペンス後、機器は自動的にノズルをフラッシュし、すべてのスライドを撮影します。画像を確認し、均等な分布とすべてのスライドでの滴の位置を正しく確認してください。

14. HA ディスペンス

1. 使用前にHA溶液を準備し、ガスを抜いてください。
2. バイアルを装填しろ。HA溶液150μLをきれいなPCRチューブにピペットで注ぎ、CellenWASHスロット2に位置し、キャップを機器ドアの方に向けて調整します。
3. ランプロファイルを選択します。 メイン タブで 7_Dispense_Quenchを選択します。
4. フィールドファイルを設定してください。 ターゲットセットアップ タブを開き、適切なマルチプレックススキームフォルダからHA.fldを読み込み、フィールド 数 を Y に設定してスライド数の合計と等しくなります。
5. ランを始めろ。 「走る」に移動し、「 走る」をクリックし、画面上の指示に従ってください。
6. 孵化しろ。スライド上でHAを30分間反応させてください。
7. ディスペンションを確認してください。完了後、システムはノズルを洗浄し、各スライドの画像を撮影します。これらの画像を確認して、滴の位置と体積が均一であることを確認します。

15. サンプルの回収

1. 洗浄液はWashTray XLで準備します。
2. 献金用の皿を用意しろ。新鮮な384ウェルプレートの各ウェルに、LC-MSグレードの水で0.01%(w/w)DDMを2μL投入し、プレートを液体ハンドラー内に置きます。
3. ピックアップランを選びましょう。 メイン タブでプロファイル 8_Pickup_2plexを選択します。
4. フィールドファイルを読み込め。 ターゲットセットアップ タブを開き、正しいマルチプレックススキームディレクトリから Pick-up.fld を取り込み、フィールド 数 を Y に設定してスライド数と一致させます。
5. ランを実行しろ。 「Run 」タブに切り替え、「 Start Run」をクリックし、指示に従ってください。装置は各液滴を収集し、ノズルを洗浄し、スライドの画像画像を撮影してすべてのサンプルが回収されたことを確認します。

16. ピックアップ後の処理

1. 384井板を接着箔で封閉し、遠心分離機で短時間だけ水滴を井戸の底に導きます。
2. ホイルを剥がし、真空濃縮器で低温で試料を乾燥させます。
3. プレートを接着箔で密封し、乾燥したプレートを-80°Cで保存し、LC-MS/MS分析の準備が整うまで保管します。

17. バルクサンプルの調製

1. セクション9の残った懸濁液を使い、セルをスピンダウンし、1xPBSで再懸濁して2,000セル/μLの濃度を得ます。これはセクション10の修了後に実施されるべきです。
2. 熱解解:残った懸濁液を-80°Cで10分間スナップ冷凍し、その後90°Cで10分間熱衝撃します。
3. チューブを室温まで冷やしてください。
4. 25μLの溶解液をPCRチューブに移し、事前に準備した消化混合物を5μL加えます。
5. サーマルサイクラーで37°Cで1≈16時間の1晩を培養します。
6. ライトラベル誘導化:アセトニトリルに新鮮な25%(v/v)のライトラベル5μLを加え、1時間培養します。
7. 反応クエンチング:1%(水/水)ヒドロキシアミン(HA)溶液を5μL加え、30分間培養します。
8. サンプルを低温の真空濃縮器で乾燥させ、LC-MS/MSの準備まで-80°Cで保存します。

18. LC/MSのセットアップとデータ取得

注:本稿のデータ収集のために、75μm内径×25cm×1.7μmのイオン光学カラムを備えたLC-MS\MSシステムをセットアップしました。

1. HPLCで動作させるための移動相の準備:
   移動相A(MPA):HPLCグレード水中の0.1%の蟻酸
   モバイル相B(MPB):HPLCグレードのアセトニトリル中に0.1%の蟻酸
2. HPLC法を30分間のアクティブ勾配にプログラムします:25.7分で5-23% MPB、2.6分で23-35% MPB、1.7分で35-45% MPB、流量200 nL/minで。オートサンプラーを0.1% FA + 0.01% DDMで再懸浮させて「ドライ」ピックアップに設定します。
3. データ非依存取得(DIA)を行うためのMS取得方法の設定:
   注意:これらの設定はFAIMS Pro Duoを搭載したThermo Exploris 480専用であり、楽器によって異なる場合があります。以下に説明するようなm/z範囲に近いDIA単細胞プロテオミクスに共通するものを使用することが推奨されます。
   1. MSは300-1100 m/zのフルスキャン、解像度120,000、AGC目標300%、最大注入時間246ms、FAIM CVを-50 Vに設定します。
   2. MS/MSは300-1100 m/zのDIAスキャン、解像度60,000、アイソレーションウィンドウ50 m/z、HCD衝突エネルギー27%、120 m/z、AGCターゲット1000%、最大注入時間118ms、FAIM CV-50 Vに設定されます。
4. 単一セルを含む384ウェル板のホイルシールを取り外します。100セル/μLで0.1% FA + 0.01% DDMでバルクサンプルを再構成し、P24などの空井戸に10μLを移します。その後、プレートをピアス可能なゴムマットで密封し、オートサンプラーに積み込みます。
5. キューアップ実行:まずバルクサンプルを実行し、その後単一セルのセットを実行します。

19. データ分析

1. EpiProfile2.1で生データを実行し、プロピオン無水物で標識された細胞のペプチドホルムの存在比の出力を得ます。
   注意:EpiProfile 2.1をデータ処理に使用するには、サンプルをThermo機器で取得する必要があります。このソフトウェアは標準版で約250種類のペプチドフォームを抽出しますが、生物の種類や追加の修飾、変異などに応じて編集^{可能です。}
2. 生データをEpiProfile2.1_D5で処理すると、プロピオン酸無水物d10で標識された細胞のペプチドフォーム存在比の出力が得られます。
3. 量子QCプログラムでメタデータとエピプロファイル出力をリンクするマッピングを実行します。
4. 失敗したサンプルは空欄と比較してフィルタリングします。
5. 少なくとも50%のサンプルに含まれていないペプチドフォームをろ過してください。
6. 単一細胞の強度の信号が空白の150%信号より大きくないペプチドフォームをフィルタリングします。
7. 結果表(図7A)を取得し、必要に応じてデータをさらに処理します。

Results

単細胞ヒストンプロテオミクスワークフローの応用を示すために、5 mMのブチ酸ナトリウムで処理されたHepG2/C3A細胞の球状体を24時間解析しました。LC-MS/MS取得後、生データをEpiProfileで処理し、軽度(プロピオン酸無水物)および重度(プロピオン無水物-d10)の標識を行い、ペプチドおよびヒストンマークの存在比を示す正規化データを得ました。その後、QuantQC Rパッケージを用いて液体ハンドラーの取得メタデータをEpiProfile出力にマッピングし、各細胞のペプチド含有量および関連存在比の情報を取得し、少なくとも50%の単一細胞で一貫して検出されないペプチドフォームをフィルタリングし、単一細胞の強度の信号が空格の150%信号より大きくないペプチドフォームを除外しました。その後、データはlog(1+x)変換を用いて正規化され、下流解析に用いられる結果表が得られます。このテーブルは、さまざまなペプチドフォームの列と、各セルごとに同定されたペプチドフォームの存在比を示す列から成ります。

図7A は、定量化さ...

Discussion

ヒストンの翻訳後修飾を単一細胞レベルで測定できる能力は、クロマチン調節の真の異質性を理解するための重要な一歩です。従来のバルク法は組織間のhPTMの平均分布に関する貴重な洞察を提供してきましたが、細胞間の変動を覆い隠し、生物学的に意味のあるものとしてますます認識されています⁵。単細胞プロテオミクス手法により、この隠れた複雑さの層を解明し、異なる遺伝子調節、細胞可塑性、疾患脆弱性の基盤となる可能性のある異なるクロマチン状態を明らかに^{しています。}ヒストン修飾は、転写結果を導く組み合わせ情報をコードしているため、単細胞の問い合わせに特に適している。例えば、H3K9acとH3K14acマークが同時に存在することは、^{これらのマークのいずれか}よりも転写活性化の強い指標となります。このような共生パターンを単一細胞分解能で捉えることは、クロマチンの地形とその動態を特徴づける新たな視点です。

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ	バイオ・ラッド	2239480
1000 & micro;L幅のパイプ先端はL幅が広い	フィッシャー・サイエンティフィック	14222703
200 & マイクロ;L幅のパイプ先端はL幅が広い	フィッシャー・サイエンティフィック	14222730
384井戸PCRプレート Lo Bind	エッペンドルフ	30129547
96ウェル真空マニホールド	ミリポール	MAVM0960R
アセトニトリル、オプティマ LC-MS/MS グレード	フィッシャー・サイエンティフィック	A955-1
接着式PCRプレートホイル	サーモ・フィッシャー	AB0626
無水アセトニトリル	フィッシャー・サイエンティフィック	AA42311AK	バルク用のストック溶液をラベル付け
Arg-C Ultra、質量分析グレード	プロメガ	VA1831
細胞培養グレードの水	コーニング	25-055-CV
セレンヴィアル	スキエニオン	/	カタログ番号には引用文が付いています
DMSO、無水	サーモ・フィッシャー	D12345	ラベル ストック溶液
DTT	シグマ	D0632-5G
ダルベッコ改良鷲の中型(DMEM)	フィッシャー・サイエンティフィック	MT17205CV
胎児用牛血清	フィッシャー・サイエンティフィック	MT35010CV
蟻酸	熱力学	28905
蟻酸 98%–LC-MSリクロプルに100%賛成	シグマ	5330020050
ハンクのバランスソルトソリューション(HBSS)	フィッシャー・サイエンティフィック	MT21022CV
HEPES(ウルトラピュア)	サーモ・フィッシャー	11344041
HPLCグレードアセトニトリル	フィッシャー・サイエンティフィック	A955-4
HPLCグレードの水	フィッシャー・サイエンティフィック	W5-4
ヒドロキシルアミン溶液はH2O中に50 wt.%を含んでいます	シグマ	438227-50ML
L-グルタミン	フィッシャー・サイエンティフィック	MT25015CI
n-ドデシルベータ-マルトシド(DDM)洗剤	フィッシャー・サイエンティフィック	BN2005
非必須アミノ酸	フィッシャー・サイエンティフィック	MT25025CI
オービトラップ・エクスプロリス480質量分析計	サーモ・フィッシャー	BRE725539
パラホルマルデヒド 16%水溶液 EMグレード	電子顕微鏡科学	15710-S
PDC-CM(タイプ2コーティング)	スキエニオン	/	カタログ番号には引用文が付いています
ペニシリン・ストレプトマイシン	フィッシャー・サイエンティフィック	MT3002CI
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10x、pH 7.4、RNaseフリー	サーモ・フィッシャー	AM9625
ピアースジメチルスルホキシド(DMSO)、LC-MSグレード	サーモ・フィッシャー	85190
ピペットガン	エッペンドルフ	Z666467(ミリポール・シグマ)
プロピオン無水物&99%	シグマ	240311-50G
プロピオン無水物-d10 ≥98原子 % D、および ge;99%(共産党)	シグマ	615692-1G
冷蔵遠心分離機	熱力学	75-217-420
SciCHIP H1コーティングガラススライド	スキエニオン	/	カタログ番号には引用文が付いています
SpeedVac真空濃縮器(96ウェル板)	熱力学	15308325	サヴァントSPD1010
無菌フード	熱力学	1375
滅菌血清学的ピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	1367549
SYTOX グリーンデッドセル染色、フローサイトメトリー用	サーモ・フィッシャー	S34860
TrypLEエクスプレス酵素(1X)、フェノールレッドなし	サーモ・フィッシャー	12604013
渦	シグマ	Z258415
水浴	フィッシャー・サイエンティフィック	FSGPD10