研究記事

ランソプラゾールは、脳内出血のマウスモデルにおいて腸損傷を緩和 することで 長期的な神経機能を改善する

DOI：

10.3791/69596

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2026年1月16日

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1Department of Gastroenterology, Yantaishan Hospital, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University, 3Shandong Xiehe University

この記事について

サマリー

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コラーゲナーゼ誘発マウスモデルを用いた脳内出血(ICH)をランソプラゾールで治療しました。ランソプラゾールはICHによる腸障害を緩和し、リポ多糖(LPS)およびIL-1βのレベルを低下させただけでなく、脳の炎症も抑制しました。ランソプラゾールはICHマウスの学習と記憶(長期神経機能)を高めました。

要約

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脳内出血(ICH)は消化管を損ない、腸の損傷を引き起こすため、臨床結果の悪化に寄与します。本研究は、ICHを持つマウスにおけるランソプラゾールが腸の損傷および神経機能に与える影響を調査しました。マウスにはコラーゲン酵素を立体的に注射し、ICHモデルを確立しました。神経機能、脳水分含有量、血液脳関門の透過性、腸損傷、腸の透過性が評価されました。血液および脳中のLPSおよびIL-1βのレベルも測定されました。ランソプラゾール治療は、ICHマウスにおける腸障害の緩和、血液および脳中のLPSおよびIL-1βの低下、脳水分含有量の減少、脳炎症の抑制と関連していました。ランソプラゾール投与はガルシア、前肢配置、ロタロッドテスト(短期神経機能)でのパフォーマンス向上にはつながらなかったが、学習と記憶(長期神経機能)を有意に向上させた。これらの結果は、ICHマウスにおけるランソプラゾール治療が長期的な神経学的転帰の改善および腸損傷の減少と関連していることを示しました。

概要

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出血性脳卒中は死亡率と障害率が高いです。近年、中国における脳卒中の有病率が増加し、死因のトップとなっています。脳内出血(ICH)は稀ですが、虚血性脳卒中よりも明らかに致死的です。研究ではICHの1か月以内に40%の死亡率が報告されています。さらに、生存者の約75%は1年後には自立して生活することができません。

脳は迷走神経、腸神経系、腸内微生物代謝など複数の経路を通じて消化管とコミュニケーションを取っています。脳腸軸はよく知られ、臨床的に重要な調節システムです。3.腸の粘膜は水分、電解質、栄養素の吸収を調整し、病原体や毒素の血流への侵入を防ぎます。ICHはこの腸の障壁を損ない、消化器系の障害を引き起こす可能性があります。バリア機能障害は、栄養失調、免疫抑制、臨床アウトカムの悪化に寄与します。ICHによる腸の透過性の増加により、有害な内因性物質が血流に入り込み、全身性炎症反応や多臓器機能障害症候群を引き起こします。ICH後の腸粘膜損傷により腸内細菌が血流に移動し、全身感染を引き起こす可能性があります5.多くの患者が腸の運動不全、微生物の不全、粘膜出血、敗血症を発症します。以前の研究では、ICHが腸内病原体や毒素の脳への移動を引き起こすことが示されました。

プロトンポンプ阻害剤(PPI)であるランソプラゾールは、プロトンポンプを不可逆的に阻害し、胃酸分泌を減少させます。胃および十二指腸潰瘍、侵食性食道炎、胃食道逆流症、非ステロイド性抗炎症薬関連胃潰瘍の治療に用いられます7。以前の研究では、PPI予防療法が虚血性脳卒中の患者の転帰に悪影響を及ぼすことが示されています。他の発表された研究では、PPI使用と認知機能低下の関連が示唆されています。疫学的研究では、PPIを投与された患者は認知症およびアルツハイマー病の発症リスクが増加していることが示されました。長期PPI使用者と非使用者を比較した前向きコホート研究では、PPI使用が認知症リスクの増加と関連していることが示され、著者らは予防策としてリスクのある患者へのPPI使用を推奨しませんでした10。本研究は、ICHマウスにおける腸障害および短期および長期の神経機能(特に学習と記憶)に対するランソプラゾールの影響を調査するために実施されました。我々は、ランソプラゾールが腸の障壁保護効果によりLPSの浸透を阻害し、全身および神経学的な炎症を緩和し、ICHマウスの神経機能を改善する可能性があると仮説を立てています。

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プロトコル

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これらの実験は、国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと利用に関するガイド(NIH出版物番号8023、1978年改訂)に従って実施されました。このプロトコルは煙台大学倫理委員会によって承認されました(承認番号:YTDX20240526)。有害物質は機関の化学廃棄物処理プロトコルに従って処分されました。 図1 は実験設計の回路図を示しています。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 動物の詳細

体重22〜25gのオスのCD-1マウスは、12時間/12時間の明暗サイクルを持つ部屋に収容されました。動物たちは自由に食べ物と水を得ることができました。

2. ICHマウスモデルの準備

ICHのマウスモデルは、以前の報告書11に基づいて確立されました。マウスは簡単に、キシラジン(10 mg/kg)とケタミン(90 mg/kg)で麻酔され、立体走行フレームに置かれました。右冠縫合線(正中線より外側2.2mm、ブレグマ後方0.2mm)に小さなバー穴が開けられました。マイクロシリンジが頭蓋骨表面から3.5mmの深さで右脳に挿入されました。マイクロインフュージョンポンプを用いて、細菌コラーゲナーゼ(0.075 U、0.5 μLリン酸緩衝生理食塩水[PBS])を0.15 μL/minの速度で注入しました。5分後に優しく針を抜きました。シャム群のマウスはコラーゲン酵素の代わりに同等量のPBSを受け取りました。骨ワックスでバーホールを塞ぎ、頭皮の切開部を縫合しました。動物の体温は目覚めるまで37°Cに保たれていました。

3. 実験設計

オスのCD-1マウスは、シャム、モデル、ランソプラゾールの3つのグループに無作為に割り当てられました。ICHモデルは前述の通りに確立されました。ICH誘導から30分後、ランソプラゾール群のマウスに30 mg/kgの用量(ランソプラゾールの用量は以前の報告に基づいて選択)を投与し、3日間連続で1日1回投与しました。偽グループおよびモデル群のマウスには腹膜内注射PBSが投与されました。ICH後3日目には、ガルシア検査、前肢配置検査、ロータロッド検査を用いて短期神経機能評価を行いました。ICH誘導後29日目に、新しい物体認識および水中迷路試験が実施され、長期的な神経機能評価が行われました。

4. ガルシア検査

2人の研究者は、グループを盲目に認識され、以前に報告されたプロトコル13に従ってガルシア検査を実施しました。神経機能は0から21までのスコアリングシステムを用いて評価されました。評価は7つのサブテストで構成され、それぞれ0から3のスコア(0=最悪、3=ベスト)が評価されます。

5. 前肢位置試験

ガルシア検査の後、前肢配置試験は前述の方法14に従って実施されました。マウスはテーブルトップと平行に垂直に保持され、ビブリッサが表面を擦るようにしていました。前肢の位置は10回連続試験で観察されました。左前肢の位置割合は、左前肢の位置 ÷ (左前肢の位置+右前肢の位置)× 100%と計算されました。

6. ロタロッドテスト

前肢の配置テストの後、マウスは5回転の回転する棒に3分間置かれてトレーニングを行いました。ロッドは5回転から30回転に4分かけて加速されました。各マウスがロッドに留まった時間は5分間で記録され、脱出遅延は15と記録されました。

7. 腸の透過性と脳浮腫のアッセイ

ロタロッドテストの後、各グループから6匹のマウスが無作為に選ばれました。前回の方法16では、FITCデキストランは胃内投与で300 mg/kgの用量でした。3時間後、マウスはイソフルラン麻酔を受け、後眼窩静脈神経叢から血液を4°C、11,000 g ×で5分間遠心分離しました。FITCデキストラン含有量は蛍光プレートリーダーを用いて485nm励起、528nm放射波長で分析しました。その後、動物の首を切断し、脳の右半球を収集して体重測定し、湿った重さを得ました。組織は100°Cで24時間乾燥させ、乾燥重量を測定しました。脳の水分含有量(%)は次のように計算されました:[(湿重 − 乾重)/ 湿重] × 100%。

8. 血液脳関門(BBB)透過性評価

ロタロッドテスト後、各グループから6匹のマウスを無作為に選び、BBBの透過性を評価しました。2%エバンスブルー溶液を腹腔内に4 mL/kgで投与しました。3時間後、マウスにイソフルラン麻酔を施し、PBSを用いた心腔灌流を実施しました。脳の右半球は50%トリクロロ酢酸で3:1の比率で均質化されました(脳組織はトリクロロ酢酸)。ホモジネートは15,000× g 、4°Cで20分間遠心分離されました。その後、500μLの上清液を70%エタノール500μLと混合し、夜間4°Cで夜間培養しました。エバンスブルーの濃度は610nmで測定され、標準曲線を用いて定量化されました。データは脳組織1mgあたりのエバンスブルーμgとして示されます。

9. 腸および脳の組織病理学的検査

ロタロッドテストの後、各グループから3匹のマウスが無作為に選ばれました。マウスにはイソフルラン麻酔が施されました。空腸、回腸、脳は10%ホルムアルデヒドで採取・固定されました。組織は厚さ5μmで切片され、ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色が行われました。腸と脳の組織病理学的検査は、グループ課題を盲検された2人の実験者によって顕微鏡を用いて行われました。血腫を取り巻くミクログリアの数は代表的な切片で数えられました。細胞数は、動物ごとに3つのセクションにまたがる5つの任意の視野で実施されました。

10. LPSおよびIL-1βの測定

ロタロッドテストの後、各グループから6匹のマウスが無作為に選ばれました。マウスにはイソフルラン麻酔が施され、血液が採取されました。血液サンプルは5,000 ×g 、4°Cで10分間遠心分離し、血清を採取しました。脳の右半球を採取し、脳均質物質を1:3(脳重量グラムとPBS体積ミリリットル)の比率で調製しました。ホモジネートは12,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離されました。上清液中のタンパク質濃度はBCAキットを用いて測定されました。血清および脳均質液中のLPSおよびIL-1βのレベルは、製造元の指示に従いELISAキットを用いて測定されました。

11. 透過電子顕微鏡

電子顕微鏡検査では、回転テスト後に各グループから3匹の動物が無作為に選ばれました。マウスはイソフルラン麻酔を受け、2%グルターアルデヒドと2.5%パラホルマルデヒドを0.1 M PBSで経心尿流(機関承認プロトコルに従い)受けました。その後、脳、空腸、回腸を採取し、2%グルターアルデヒドに0.1 Mカコジル酸緩衝液(pH 7.4)を4°Cで一晩置きました。その後、試料は室温で1%四酸化オスミウムに1時間移送されました。組織は極薄(50nm)に切断されました。脱水後、切片は透過電子顕微鏡下で観察するためにウラニル酢酸塩とクエン酸鉛で染色されました。すべての切片はブラインド方式で評価され、透過電子顕微鏡で撮影されました。

12. 新しい物体認識

ICHモデリングから29日後に、マウスの学習および記憶機能を評価するために新しい物体認識テストが実施されました。初日は装置に物体を置かず(長さ40cm、幅40cm、高さ40cm)、マウスは5分間自由に探索できました。2日目には、同じ物体を2つ装置に入れ、マウスたちは5分間それらを探索させられました。24時間後、そのうちの一つの物体が新しい物体に置き換えられた。マウスたちは再び5分間、2つの物体を探索しました。探索時間は、ネズミの鼻が物体に触れたとき、またはマウスの頭が1cm以内の物体に向けられているときに記録されました。この新しい物体を探査するのに費やした時間は測定・計算されました。新しい物体の探索時間が長いほど、学習能力や記憶能力が向上します。

13. モリス水の迷路

ICHモデリングから32日後、モリス水迷路を用いて学習機能と記憶機能が評価されました。装置は直径100cm、高さ40cmの円形プールで、水深25cmで満たされ、温度は22°C±1°Cで維持されていました。 脱出プラットフォーム(直径9cm)は水面下1cmに沈んでいました。ナビゲーションテストでは、マウスが1日に4回の試験を受けました。プラットフォームを見つけるのにかかった時間は脱出遅延として記録されました。60秒以内にプラットフォームを見つけられなかったネズミは優しく誘導されました。5日目には60秒のプローブテストが実施されました。メモリ機能の評価は、脱出遅延、プラットフォームの通過回数、目標象限での滞在時間を記録することで評価されました。データはビデオトラッキングソフトウェアを用いて分析されました。

14. 統計分析

データはGraphPadプリズムソフトウェアバージョン7.0を用いて解析されました。結果は平均と標準偏差±示されます。シャピロ・ウィルク検定は、各グループのデータが正規分布に従っているかどうかを評価するために用いられました。グループ間の差は一方向ANOVAで分析し、その後Tukeyの事後検定を行った。非パラメータ比較には、クルスカル・ウォリス検定の後にダン検定が用いられました。p値は<0.05と統計的に有意とされました。

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結果

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ICHマウスにおけるランソプラゾールの短期神経機能への影響

偽群と比較して、ICH群のマウスはガルシア検査で有意に低いスコアを示しました(p < 0.01)。しかし、ランソプラゾール群のマウスはICH群と比較してガルシアスコアの改善は認められませんでした(p > 0.05)(図2A)。同様に、ICH群は左前肢の位置割合が偽群に比べて有意に減少しました(p < 0.01)。ガルシア検査の結果と一致して、ランソプラゾール治療は左前肢の位置率を増加させませんでした(p > 0.05)(図2B)。ロタロッドテストでは、ICH群の方が偽組に比べてロッドにかかる時間が著しく短くなりました(p <...

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ディスカッション

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腸損傷はICH患者によく見られる合併症です。ICHによる腸障害は、栄養失調、長期入院、不良な予後、さらには死亡率を引き起こす可能性があります17。ICH動物モデルを用いて、この研究は初めてランソプラゾールがICHマウスの腸障害を軽減することを示しました。ランソプラゾールは短期的な神経機能に有益な効果を示しませんでしたが、長期的な神経学的転帰を有意に改善しました。

脳卒中は虚血性であれ出血性であれ、世界的に主要な死因の一つです。脳卒中後、体は全身性ストレス反応を起こし、脳以外の臓器に病理学的変化を引き起こすことがあります。腸はこの全身的反応の主な標的の一つです。臨床的には、粘膜損傷、腹部膨張、便秘などの脳卒中による消化器症状が一般的に観察されます18,19。虚血性脳卒中モデルでは、動物は腸関門の機能障害を示し、腸内細菌が肺など他の臓器に移座・拡散する

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開示事項

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著者たちは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

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本稿の草稿の英語原文を編集してくれたLiwen Bianji(Edanz)(www.liwenbianji.cn/)のアンジェラ・モーベンに感謝いたします。本研究は山東省台山学者資金プロジェクトからの助成金により支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BCAキットビヨタイム・バイオテクノロジーP0009
コラーゲン酵素シグマ・オルドリッチ128M4107v
エヴァンスブルーダイシグマ・オルドリッチMKCG7507
FITCデキストランシグマ・オルドリッチ46944
GraphPad プリズム 7.0GraphPad統計ソフトウェア、ボストン、
MA、アメリカ、www.graphpad.com		プリズム7.0
ランソプラゾール 山東育新製薬有限公司524093053
LPS ELISAキットクサビオ・バイオテック株式会社M25036407
ネズミ濟南鵬岳実験動物育種株式会社SCXK20220006 
マイクロインフュージョンポンプワールド・プレシジョン・インスツルメンツマイクロ3
マイクロシリンジ  ハミルトン社SYR 10 & mu;L
オリンパス顕微鏡 オリンパス株式会社IX-70
ロータロード パンラボ株式会社LE8205
立体定向フレームコップ・インストゥルメンツモデル902-A
TNF-およびα;ELISAキットビヨタイム・バイオテクノロジーPI301
透過式電子顕微鏡JEOL 株式会社。JEM-100SX
ビデオトラッキングソフトウェア パンラボ株式会社スマート3.0

参考文献

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