方法論記事

CD63-GFPリポーターマウスモデルを用いた脂肪細胞由来細胞外小胞分泌の生体およびin vitroでの特徴付け

DOI：

10.3791/69670

⸱

2025年12月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、脂肪細胞特異的CD63-GFPレポーターマウス系統を用いて、脂肪細胞由来の細胞外小胞(EV)の分泌を可視化・定量化し、前身細胞による取り込みを実証し、脂肪組織内のパラクリン経路を明らかにします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂肪細胞は、タンパク質、脂質、核酸を豊富に含む大量のEVを分泌する活発な内分泌細胞としてますます認識されています。しかし、EV分泌を制御するメカニズムや、異なる生物学的文脈におけるEV放出の動態はまだ完全には解明されていません。このギャップを埋めるために、GFPタグ付きCD63の発現がアディポネクチンプロモーターによって駆動され、AdEVsの選択的標識と追跡を可能にする新規の脂肪細胞特異的CD63-GFPレポーターマウス系統を生成 しました。このレポーターモデルを用いて、AdEVの分泌と脂肪組織内のAPCへの送達を調査しました。共焦点イメージングとフローサイトメトリーにより、AdEVはAPCによって積極的に取り込まれていることが明らかになり、脂肪微小環境内でのパラクリンコミュニケーションのこれまで過小評価されてきたメカニズムが浮き彫りになりました。

生 体内 研究を補完するために、分化した脂肪細胞からのEV分泌を直接監視できる in vitro システムが確立されました。APCは報告マウスの皮下白色脂肪組織から単離され、成熟脂肪細胞への分化を誘導した。これらの細胞では、CD63-GFPシグナルが離散的な点として観察され、EV分泌が阻害されると細胞膜で濃縮され、放出阻害後の小胞蓄積と一致しました。通常の成長条件下では、培養培地に分泌されたEVを濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製することで、下流の機能分析および生化学的解析が可能となりました。

このプラットフォームは、他の脂肪デポから派生したAPC(エピディジマルホワイト組織や茶色アディポ組織など)にも適用でき、またデポ特異的なアディポサイトに分化することで、異なるアディポサイト間でEV分泌の比較が可能になります。

これらのアプローチは、堅牢な遺伝学的ツールと補完的な in vitro システムを導入し、AdEVの分泌と標的化の動態を解析します。これらの進展は脂肪体内の細胞コミュニケーションに光を当て、AdEVが健康や疾患に与えるより広範な代謝的影響を理解する基盤を築いています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂肪組織は、全身のエネルギー恒常性1,2,3,4,5において重要な役割を果たす動的な内分泌器官としてますます認識されています。脂質貯蔵拠点としての古典的な機能を超えて、脂肪細胞は全身性インスリン感受性を調節し、脂肪量の異常—過剰または欠乏—はインスリン抵抗性や代謝疾患に関連しています。6,7,8,9。この調節能力に寄与するメカニズムの一つが、分泌因子を通じた細胞間コミュニケーションです。アディポキンは脂肪組織10,11,12,13,14,15,16,17,18の主要な内分泌シグナルとして確立されていますが、脂肪細胞は脂質、タンパク質、核酸、代謝物を含む膜結合粒子である細胞外小胞(EV)も大量に放出します。脂肪細胞分泌型EV(AdEVs)が他のタイプのEVと同様に糖団も運ぶかどうかは、まだ不明です。脂肪細胞はEVの主要な供給源であることが証明されており、マウスモデルでは約80%の循環外小体マイクロRNAが脂肪細胞由来であることが示されています。これは、ベースライン条件の下、脂肪細胞特異的Dicerノックアウトマウスを用いて示されています25。AdEVsの代謝、炎症、インスリン感受性、脂肪生成における役割は報告されていますが、まだ完全には解明されていません 26,27,28,29。他の潜在的な機能、特に他の細胞タイプや器官とのクロストークの媒介は、まだほとんど知られていません。EVの存在量が26個であることは、局所的および体系的なシグナル伝達において重要な役割を果たす可能性を示唆していますが、AdEVの生物学的意義や作用機序はほとんど解明されていません。この知識のギャップは、AdEVの分泌と機能を研究するための堅牢で専門的な手法の必要性を浮き彫りにしています。

このギャップを埋めるために、Adipoectin-CreマウスとStopfl/fl/CD63-GFP(株#:036865、JAX)を交配して脂肪細胞特異的CD63-GFPマウス(AdipCD63-GFP)を作製しました。Creが欠如している状態でCD63-GFPを発現しなかったストップfl/fl/CD63-GFPの兄弟姉妹犬が対照群として用いられた。CD63-GFPレポーター株は、内皮およびニューロン由来のEVを含む細胞型特異的EVを体内で追跡するために成功裏に用いられています30,31。アディポネクチンは成熟した脂肪細胞にのみ発現し、脂肪細胞前駆細胞(APCs)では発現しません32,33、そしてCD63はEVs34のマーカーであるため、循環や組織で検出されるGFP+EVsはAdEVとして特異的に同定できます。したがって、本研究ではAPC内で検出されたGFP+EVを、これらの前駆細胞に取り込まれたAdEVと解釈します。このリポーターシステムは、生体内およびin vitroで小胞放出および潜在的な標的相互作用を直接監視し、他の脂肪組織細胞型におけるAdEVの研究を可能にします。重要なのは、AdEVは他の細胞タイプのEVと比べて特に脂質が豊富であり、浮力が高く、壊れやすく、従来の超遠心分離法での回収が困難であることです。35,36,37。高い遠心力はこれらの小胞を損傷させたり、サンプルの損失や汚染を引き起こし、下流の解析を複雑にします。これらの制約を克服するため、複数の低速遠心分離とサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせたワークフローを最適化し、せん断応力を最小限に抑え、小胞の完全性を保ち、純度と収量を向上させ、正確な定量化と機能研究を可能にします。CD63-GFPシステムとこの最適化された分離パイプラインは、脂肪組織のクロストークおよび全身代謝調節におけるAdEVの分泌と機能を調査するためのアクセス可能かつ再現性の高いアプローチを提供します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アルバート・アインシュタイン医科大学の動物飼育・使用ガイドラインに従い、オスマウスは22°C、相対湿度30〜70%でグループ収容され、12時間の明暗・12時間暗循環で行われ、 自由に 食物と水を供給し、C57BL/6Jの背景で維持されました。

1. APCによる吸収による分泌されたAdEV のin vivo 検出

  1. バッファーの調製
    1. 消化バッファー:HEPESバッファーDMEMを、1 M HEPES 0.5 mLと脂肪酸の乏しい牛血清アルブミン(BSA)0.5 gを50 mLのDMEMに加えて調製します。溶けるまで混ぜます。
    2. 洗浄バッファー:PBSを2.5 mMのエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)と4%の胎児用牛血清(FBS)で調製します。
    3. リベラーゼおよびDNase 1ストックを5 mg/mLおよび5 KU/mLで準備します。-20°Cで保存します。 使用直前に解凍してください。
  2. 鼠径部脂肪組織の採取と消化
    注:生後4か月のAdipCD63-GFPおよびCD63-GFP対照マウスは、二酸化炭素吸入により安楽死されました。
    1. 無菌技術で脂肪組織を切除し、0.5mLの消化バッファーに1gの組織を入れ、無菌ハサミで1mm以下の細かい塊に組織を細かく刻みます。
    2. 挽いた組織を、0.5 mg/mL Liberaseおよび50 U/mL DNase 1を含む消化バッファー10 mLに懸浮させます。
    3. 軌道シェーカー(100 rpm)で37°Cで30〜60分間インキュベートします。培養中にチューブを数回逆さまにして組織を優しく混ぜます。溶液が濁って見え、組織の断片が見えない場合、消化は完了したとみなされます。
  3. 装甲兵員輸送車の孤立
    1. 消化バッファーの2巻で懸濁液を希釈し、チューブを3〜4回優しく反転させます。
    2. 未消化組織を除去するために、無菌の100μmフィルターに通します。
    3. ろ過液を300× g で4°Cで5分間遠心分離します。
    4. 上清液の脂肪細胞部分を廃棄し、ペレットを間質血管分数(SVF)としてラベル付けします。
    5. 新鮮な1×赤血球(RBC)溶解緩衝液を無菌水で準備します。SVF内の赤血球を溶除し、光から守って5分間氷で培養します。
    6. 洗浄バッファーを2巻加え、遠心分離機で400× g で4°Cで5分間ろ過します。
    7. 脂肪組織前駆細胞分離キット(マウス)プロトコルに従い、SVFを組織1グラムあたり80μLのバッファー(PBS、pH7.2、0.5% BSA、2 mM EDTA)で再懸濁します。
    8. 組織1グラムあたり20μLの非脂肪細胞前駆除カクテルを加えます。
    9. 混ぜて暗闇で2〜8°Cで15分間培養します。
    10. サンプルをLSカラムに通し、流れを回収します。
    11. 4°Cで300 × g の流れを遠心分離し、APCを取得。
  4. 共焦点顕微鏡によるAPC取り込みによる分泌AdEVの検出
    1. AdipCD63-GFPまたはCD63-GFPマウスから分離したAPC250 μL(1 ×4 cells/mL)をコラーゲン被覆の8ウェルチャンバースライドにシードし、約6時間細胞を付着させます。
    2. 細胞とEV構造を保存するために、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。
      注:これらのアッセイではGFPシグナルがAdEVをマークし、共焦点顕微鏡によるAPC内での検出は、これらの前駆細胞によるAdEVの取り込みを示します。
    3. スライドをPBSで3回洗浄し、アンチフェードメディウムでマウントし、63×の油浸漬対物レンズを備えた共焦点顕微鏡でGFP信号を捕捉します。488nmレーザーを用いて0.5μmステップサイズのzシリーズスタックとして画像を取得し、GFP励起と500〜550nmの発光検出を行います。
  5. APC取り込みによるフローサイトメトリーによる分泌AdEVの検出
    1. APCを数え、生存性染料(例:ゾンビ)を1:1000で1倍PBSに希釈します。細胞を100μLあたり1 ×10 6個で懸浮します。光から保護して氷上で20分間インキュベーションします。
    2. セルをウォッシュバッファーで一度洗います。遠心分離機で300 × g 、4°Cで5分間加熱します。
    3. 細胞を100μLあたり10〜10×6セルの 鮮やかな染色バッファーに懸浮します。
    4. 非特異的結合をFc受容体阻害試薬(例:抗CD16/CD32)で1:100の氷で10分間ブロックします。
    5. 6,000 × g で4°Cで10分間、スカイア1抗体をプリスピンします。 次に、1μLのSca-1抗体をAPCチューブに加え、チューブをホイルで覆いながら氷の上で20分間培養します。
    6. 洗浄バッファー1mLで2回洗い、300 × g で遠心分離機で4°Cで5分間洗います。
    7. フローサイトメトリーの選別のために、約1×10〜10個の6個セル /500μLのウォッシュバッファーに細胞を懸浮させます。405nmのバイオレットレーザー(パシフィックブルー用450/50nmフィルター)と488nm青色レーザー(GFP用530/30nmフィルター)を搭載したスペクトルフローサイトメーターでSca1+ およびGFP+ 細胞のデータを取得します。Sca1+ セルをゲートし、この母集団内のGFP+ サブセットを解析したまま、機器の実行ソフトウェアを用いてサンプルを解析します( 図2参照)。

2. 分泌されたAdEVのin vitro検出および解析

  1. APCから成熟した脂肪細胞への分化
    注:特に記載がない限り、すべての培養は37°C、8%CO2 で維持されています。
    1. 0日目:0.2%ゼラチンを室温(RT)で30分間コーティングし、吸引してDMEM/F12 + 15% FBS + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S) + 0.1% プリモシンで分離したばかりのAPCを100%の結合度に到達させ、分化前に100%のコンバーシティを達成します。
    2. 1日目から8日目:MesenCultの脂肪生成分化培地(合計50 mL:塩基45 mL + サプリメント5 mL + GlutaMAX 0.5 mL + プリモシン50 μL)に置き換え、4日目に新しい分化培地に切り替えます。
    3. 9日目:脂肪細胞をPBSで2回洗浄し、成熟脂肪細胞培養培地(DMEM +1% BSA + 0.2% プリモシン)に交換し、16時間維持。
  2. AdEVの分離と精製
    1. 上記の15 mLの脂肪細胞培養液を、まず40 μmフィルター、次に30 μmフィルターを通して通します。
    2. ろ過液を500×gで5分間遠心分離し、次に2,000×gで10分間遠心分離して残留細胞やゴミを除去します。
    3. ろ過液を0.8μmのフィルターに通し、100 kDaのカットオフ超ろ過ユニット(15 mLサンプル体積)を用いて、4,000 × g で15分間遠心分離して15 mLから0.5 mLの培地を濃縮します。
    4. 自動分画収集器を用いてサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムに試料を積載し、F1-8分画を採取します。
    5. 収集したEV分画を100 kDaカットオフ超ろ過ユニット(4 mLサンプル体積)で濃縮し、それぞれの分画のEV含有量をウェスタンブロット、ナノ粒子追跡解析装置、透過電子顕微鏡(TEM)で検証します。
  3. AdEVの検証、定量化、サイズ/形態評価
    1. EVマーカーのウェスタンブロット解析
      1. 各分画を400μLから25μLまで濃縮し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補足した50μLの放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを追加します。試料を2×のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ローディングバッファーを加えて変性させ、4-12%トリスグリシンゲル上にタンパク質を分離します。
    2. ナノ粒子追跡解析装置を用いたEVのサイズ、濃度、品質の解析。
      1. 分析前に、EVサンプルを無菌の0.1μmろ過PBSで1:1000の比率で希釈し、粒子濃度が最適な検出範囲(約107〜109 particle/mL)内に収まることを確認します。希釈したサンプルを優しく混ぜて泡ができないようにしてください。
      2. 高感度の科学的補完金属酸化物半導体(sCMOS)カメラ、532nmのグリーンレーザーモジュール、検出閾値10nm(最大1,000nm)/106 〜109 mLの検出閾値を搭載した装置にサンプルを積み込みます。
      3. 動的観測体積ベースの集中アルゴリズムを適用したNS Xplorerソフトウェアスイートを使用して画像化および定量化を行います。
    3. 透過電子顕微鏡(TEM)によるEV形態の検証
      1. 集中前に収集した50μLのEVをコア施設に提出し、EVのネガティブ染色を行います。プラズマクリーナーでプラズマ洗浄されたカーボンのみの400メッシュ銅グリッドにEVを適用してください。
      2. 短時間吸着後、蒸留水でグリッドをすすいで、1%(w/v)ウラニル酢酸塩で負酸化染色を施し、フィルターペーパーで余分な染みを除去してから自然乾燥させます。次に、120 KVで動作する透過電子顕微鏡でグリッドを画像化します。

3. 安全と廃棄物情報

  1. パラホルマルデヒドと酢酸ウラニルは、個人用防護具(PPE)とともに排気フードで取り扱いましょう。どちらも有毒です。ウラニル酢酸廃棄物を危険物とラベル付けした容器に回収してください。
  2. すべての生物サンプルは感染の可能性があるものとして扱い、施設動物ケア・利用委員会(IACUC)が承認した施設のバイオセーフティ方針およびプロトコルに従って処分してください。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このAdEV検出法を用いて、共焦点顕微鏡によるAPC取り込みを用い、AdipCD63-GFPおよびStopfl/fl/CD63-GFPマウスの鼠径腺脂肪組織からAPCを単離し、核の可視化のためにDAPI染色しました。共焦点顕微鏡検査では、Stopfl/fl/CD63-GFPマウスのAPCに検出可能なGFP点は検出されませんでした(図1A)。対照的に、AdipCD63-GFPマウスから分離されたAPCは、細胞質全体に多数の異なるGFP点を示しました(図1B)。GFPシグナルは、CD63-GFPラベルが成熟脂肪細胞でのみ発現するアディポネクチンプロモーターによって駆動されるため、APCsによるAdEVの取り込みを示しています。30,31。これらの結果は、アプローチの特異性を確認し、プロトコルがAdEVの取り込みイベントを特定できる能力を検証しています。

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、AdEVおよびAPCによる取り込みを単離・特徴付けるための堅牢かつ再現性の高いシステムを提供することで、重要な方法論的ギャップを埋めています。他のEVと比べて、AdEVは脂質が豊富で浮力も高いため、従来の超遠心分離によるEV隔離技術は効率が劣ります。しかし、AdEV精製の多くの公表プロトコルは依然として超遠心分離に依存しており、これは小胞形態に影響を与え、EV集合体を引き起こし、タンパク質汚染を引き起こす可能性があります37,44。代わりに、直列低速遠心分離(≤ 4,000 × g)とサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を組み合わせてAdEVを精製します。同様の連続遠心分離-SEC法は、非脂肪細胞EVでも収量と純度の向上により検証されています45。さらに、非脂肪細胞由来のEVは、超遠心分離...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には申告する金銭的利益はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FACSのアインシュタインフローサイトメトリーコアと、すべての画像解析を担当してくださった分析画像施設に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金DK128839およびNCIがんセンター支援助成金P30CA013330の一部で支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTA、pH 8.0フィッシャーAM9260G500倍の希釈
10倍PBSフィッシャー・サイエンティフィック70-013-032水で1000倍の希釈
1 M HEPESギブコ156300801000倍の希釈
脂肪組織前体分離キット、マウスミルテンニ・バイオテック30-106-639使用準備完了
アミコン超遠心フィルター、100 kDa MWCOシグマUFC910015 mL サンプル容量
アミコン超遠心フィルター、100 kDa MWCOシグマUFC91004 mL サンプル
BSAシグマA6003使用準備完了
カルネキシン抗体カルネキシンAB225951000倍の希釈
CD63抗体アブカムab217345500倍の希釈
CD81細胞シグナル伝達技術10037500倍の希釈
コーニング BioCoatとnbsp;コラーゲンI培養スライドシグマCLS354630使用準備完了
コーニング セルストレーナーシグマCLS43175040 & mu;mの孔径
コーニング セルストレーナーシグマCLS431752100 & mu;mの孔径
COX IV抗体細胞シグナル伝達技術48441000倍の希釈
DMEMギブコ11965092使用準備完了
DMEM/F-12、グルタMAXサプリメントサーモフィッシャー10565018使用準備完了
DNASE 1シグマD4513ストック5 KU/mL、-20度、C
グルタMAXサプリメントギブコ35050061100倍の希釈
停泊・貿易;プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテル(100倍)サーモフィッシャー78444使用準備完了
HSP70抗体アブカムAB1816061000倍の希釈
Invitrogen eBioscience 10X RBC Lysis Buffer(多種)フィッシャー・サイエンティフィック50-112-9743水中の希釈10倍
アイゾンサイエンスUSA Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPフィッシャー・サイエンティフィックNC2042225使用準備完了
ライカ ステラリス8 共焦点顕微鏡ライカ顕微鏡該当なし
リベラーゼTM研究グレードシグマリブトム・ローストック5 mg/mL、-20度、C
Millex MCEシリンジフィルターシグマSLAA0250.8 & mu;mの孔径
ナノサイト・プロマルバーン・パナリティカル該当なし
ノベックス・トリスグリシン・ミニプロテインゲル、4–12%,サーモフィッシャーXP04120BOX使用準備完了
Novex Tris-Glycine SDSサンプルバッファー(2回)サーモフィッシャーLC2676使用準備完了
パシフィックブルー抗マウス Ly-6A/E(Sca-1)抗体バイオレジェンド10811925倍の希釈
パラホルムアルデヒド溶液(16%)フィッシャー・サイエンティフィック50-980-487PBSで4%まで希釈してください
pluriStrainer S / 30 & micro;m(セルストレーナー)フィッシャー・サイエンティフィックNC092245930 & mu;mの孔径
ポンソーS解シグマP7170-1L使用準備完了
プリモシンインビボジェンNC9141851500倍の希釈
ProLong 金アンチフェード試薬(DAPI搭載)細胞シグナル伝達技術8961S使用準備完了
精製抗マウスCD16/32抗体バイオレジェンド101301100倍の希釈
RIPA buffer フィッシャー・サイエンティフィックPI89900水中の希釈10倍
スペクトルフローサイトメーター(オーロラ3)サイテック・バイオサイエンス該当なし
シンタキシン4抗体シナプス系1100425000倍の希釈
テクナイ20(透過電子顕微鏡)FEI該当なし
タージオ-EMPIE Scientific LLC該当なし
ビンキュリン抗体アブカムAB185085000倍の希釈

参考文献

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