マイクロンサイズのエアベントホールを備えたマイクロニードル用マスターモールドの製作

サマリー

本記事では、粘性ポリマー鋳造中の空気の閉じ込めを防ぐエアベントホールを備えたマスターモールドの製造方法を紹介し、鋭い先端を持つゼラチンマイクロニードルの製造を可能にします。高粘度ゼラチンの鋳造量を減らすことで、薄壁の中空ピラミッド型マイクロニードルも製造可能となりました。

要約

マイクロニードル(MN)は、皮膚のバリアを低侵襲で通過して薬剤を届けることができる新しい薬物送達システムです。注射よりも痛みが少なく使いやすいため、化粧品や製薬分野での応用が拡大しています。従来のMN製造は、マスターモールドを作成し、そのモールド内でMNを生産するものです。マスターモールドの主な製造方法には、マイクロ電気機械システムプロセス、金属加工、3Dプリンティングが含まれます。しかし、これらの方法で製造されるマスター型の主な弱点は、MNを作るために使われる非常に粘度の高いポリマーを鋳造中に空気が型内に閉じ込められることです。そのため、ミネソタの先端が完全に形成されないことがあります。MNアレイの製造では、これによりMN構造の信頼性が低下する可能性があります。本研究は、マスターモールドの先端に微小なエアベントホール(AVH)を形成することで、空気閉じ込めの解決策を提案します。AVHは空気の逃がしを許しますが、硬化過程で粘性流体の漏れを防ぎます。従来の金属加工や3Dプリント方法には解像度の制限があるため、AVH搭載のマスター金型を作成するためにシリコンマイクロマシニングが用いられました。製作されたAVHの側長は1.4〜7.0μmの範囲でした。この型を用いて、鋭い先端を持つ高さ375μmのゼラチンMNを成功裏に製造しました。さらに、ゼラチン塗布の体積を制御することで、厚さ23μm、内部空洞容量0.027 μLの薄壁中空ピラミッド型MNも製造されました。AVH搭載のマスターモールドは水溶性および不溶性MNの製造が可能であり、次世代の高効率薬物送達システムとして、美容・生物医学分野への応用が期待されます。

概要

マイクロニードル(MN)は、皮膚バリアを非侵襲的に貫通して薬剤を届ける新しい薬物送達システムです。この方法は経口投与の低い生体利用能と注射による痛みや感染リスクを克服します^。その簡単な使い方と高い患者遵守率により、MNは化粧品²、ワクチン³、バイオマーカーモニタリング⁴、ポリマー^薬物送達5などで応用が拡大しています。

MNの製造方法は一般的に成形技術を含みます^。鋳造用金型は金属加工⁷と3D^プリンティング8で製造されます。しかし、これらの方法の使用における障害の一つは、高価な機器や施設を必要とすることです。さらに、分解能の限界により、MNとして用いられる皮膚貫通構造の製造は困難です。さらに、非常に粘性の高い材料が生分解性MNの生成に使われています^9,10。MN材料を型に塗布すると、型の微細構造に空気が閉じ込められ、MN先端の適切な形成が妨げられ、MNアレイの収縮が減少^します。これらの問題に対処する方法として、遠心鋳造¹²、チャン^バー13を用いた真空脱ガス、型¹⁴の親水性表面処理などが報告されており、これらの方法がこの問題を緩和していると報告されています。それでも、よりシンプルで効率的な型型製造プロセスは依然として必要とされています。

通常、溶解性MNは、標的化合物を水溶性ポリマーと液体状態で混合し、その混合物を型¹⁵に鋳造することで製造されます。水溶性物質の場合、標的化合物を蒸留水に溶かし、可溶性ポリ^マー16と混合するなどの簡単な手順で製造が比較的容易です。しかし、水に溶けない物質の場合は、MNに充填するための別のプロセスを開発する必要があります。例えば、不溶性薬物を水とエタノールの共溶媒に溶解し混合し、その後真空濃縮、ろ過、凍結乾燥を前処理し、その後可溶性ポリマー溶液に混合して^MN17を製造することができます。この不溶性薬物をMNにロードするプロセスは複雑で時間がかかります。したがって、より効率的な製造プロセスと、純粋薬物の量を正確に予測する方法の開発が必要です。薬物混合型以外にも、薬剤を別の空間に保管するMNを製造する方法の開発が必要です。

上記の2つの課題に対応するため、本研究では粘性ポリマー鋳造中の空気捕捉を防ぐMN製造用のシリコンマスターモールドを製作し、その有用性を検証しました。MN製造用のポリマー鋳造中、粘性ポリマーが金型空洞を満たすことで、空洞内の残留空気が自然に排気され、空洞は完全に満たされます。高粘度のため、この充填工程はポリマーが型から流れ出ることなく停止します。この工程により、型の形状を忠実に再現でき、鋭い先端のMNを製作できます。粘性ポリマーの体積が型の内部空洞体積より小さい場合、粘性ポリマーは傾斜した金型壁に沿って空気排気口に向かって流れ、MNは内部が空の状態で形成されます。 図1 は、従来の金型(1)を用いた典型的なミネソタ州製造方法と、AVH装備のマスター金型(2)という主要な概念を示しています。

このプロトコルはシリコンウェハ上に両面エッチングを用いて、背面にマイクロスケールのAVHを持つ型を作り出しました。真空下でポリマーを塗布した後、粘性ポリマーが型の空洞を満たし、鋭い先端を持つMNを作り出します。MN材料のディスペンション体積を制御することで、標準的な固体MN(内側に充填)を製造するか、より少ない体積を施す場合は、粘性ポリマーが金型表面を一定の厚さまでコーティングし、内部を空にする中空のMNを製造できます。これにより、さまざまなMNタイプの製造に多彩なプロセスが提供されます。

ゼラチンは高い生体適合性と有利な機械的特性を提供するほか、広く利用可能で低コスト、水溶性、生分解性を持つタンパク質ベースの生体材料として、生物医学用途や溶解・ハイドロゲル形成MNシステムで広く利用されているため、MN製造のマトリックス材料として選ばれました^18,19.過去の研究では、ゼラチン系またはゼラチン-メサクリロイルMNが曲げや骨折なしに皮膚を貫通できることが示されており、ゼラチンネットワークが十分な機械的強度と構造的強度を提供し、信頼できる皮膚挿入に成功していることが確認されています^20,21。

MN製造に用いられる材料では、1gのゼラチンと9mLの蒸留水を混ぜて10.31%(w/v)のゼラチン溶液を製製しました。文献によると、25°Cでの10%(w/v)ゼラチン溶液の粘度は39.43〜46.63 mPa·s²²であり、本研究で使用された10.31%(w/v)ゼラチン溶液と10%(w/v)基準溶液の濃度差は0.31%であり、両値は6.64〜429 mPa·sの粘度範囲に該当し、水性ポリマー配合が型型を用いた^MN23の製造に成功裏に用いられていますこれは、現在のAVH補助型充填アプローチが、粘度がこの範囲内にある水性ポリマー溶液に原則的に適用可能であることを示しています。

制御鋳造を通じて、本研究では2種類のMNを製作・比較し、多孔質MNの代わりにこれらのMNを選びました。MNは多孔性と機械的強度のトレードオフを示し、機械的堅牢性を損なう²⁴:高い機械的強度と挿入信頼性を持ち、優れた皮膚浸透効率を持つ固体MNです²⁵および水に溶けない薬剤を内部空洞内に保存できる中空のMNであり、その後の薬物充填固体MN設計への変換に高い応用性^{を提供します。}薬剤を針状材料と混合できる場合、固体MNは適しており、中空MNは混合が難しい溶解度の低い物質に適しています。

プロトコル

管理された清潔な環境で作業し、すべての機器を開始前に校正することが不可欠です。各工程ごとに専用のツールを使用し、交差汚染を防ぎ、指定された焼き上げ時間と冷却時間を守ること、そしてプロトコルの手順を順番に守ることが推奨されます。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. シリコンマスターモールド製造

1. 4インチ、厚さ525μmのN型(100)両面ポリッシュド(DSP)シリコンウェハ(H₂SO₄ + H₂O₂ = 4:1、120°C、10分)でピラニアクリーニングを行います。
   注意:ピラニア溶液は有機物と激しく反応し、強い熱放出やガス発生のリスクがあります。常に煙幕の中で酸に過酸化水素を加えてゆっくり混ぜ、フェイスシールド、耐酸エプロン、耐酸手袋を着用してください。使用後は、酸性の酸化廃棄物として残った溶液とすすぎをすべて酸性の通気容器に集めます。実験室で中和しないでください。国家実験室廃棄物規則²⁷に基づき、機関のEHS有害廃棄物プログラムを通じて回収を申請してください。
2. 1100°Cで90分間の乾・湿・乾熱酸化を行い、厚さ~0.6μmの熱酸化層を成長させます(図2A)。
3. 前面フォトリソグラフィ:ウェハー前面に以下の手順を行います。
   1. スピンコートAZ GXR-601フォトレジスト(14 cP)を3000rpmで35秒間塗布します。その後、90°Cで1分間ソフトベイクします。
   2. マスクアライナーを使い、ウェハーをUV(365 nm、10 mW/cm^²)に5秒露光させ、その後2.38%(w/w)TMAH現像液で1〜2分間現像します。
      注意:TMAHは皮膚から吸収されると有毒です。排気フードで扱い、二重ニトリル手袋、安全ゴーグル、エプロンを着用してください。皮膚が触れた場合は、すぐに水で洗い流してください。使用後は、使用済み溶液と洗浄液を強いアルカリ性の第四紀アンモニウム廃棄物として専用の容器に集めます。酸や酸化剤と混ぜないでください。指定された廃棄物処理手順に従ってEHS回収を申請してください²⁷.
   3. ウェハースを100°Cで2分間ハードベイクします。
4. 前面側面のエッチング:
   1. パターン入りウェハをICPエッチングチャンバーに入れ、露出した熱酸化層を選択的に除去するために2〜3分間のドライエッチングを行います。
      注意:ガス(CHF₃/CF₄)は10/30 sccm、RF出力は50W(ICP出力は900 W)、圧力は3.8 mTorrに設定してください。この条件下での酸化物エッチング速度は~260 nm/minです。
   2. ウェハーをチャンバーから取り出し、PRストリッパー(アミン系溶媒、超音波攪拌なしの静的浴で60°Cに10分間加熱)でフォトレジストを剥離します(図2B)。
   3. エッチングバスに30%(w/w)KOH溶液(または20%(w/w)TMAH溶液)を注ぎ、蓋をします。
   4. エッチングバスを一定温度のバスに入れ、温度を90°Cに設定します。
   5. 1時間予熱した後、蓋を開けてシリコンウェハを溶液に浸し、エッチングを開始します。エッチング速度は~0.85 μm/minです。
   6. 少なくとも440分エッチングした後、シリコンウェハーを取り出し、水で洗い流します。
   7. 顕微鏡でエッチング面を調べてV字溝が形成されているか確認してください。(図2C)
      注意:KOHは強いアルカリエッチング剤で、皮膚や目に重度の火傷を引き起こす可能性があります。常に排気フード内で作業し、フェイスシールド、化学物質安全ゴーグル、全身の耐化学物質手袋、化学エプロンを着用してください。もし露出した場合は、すぐに少なくとも15分間水で洗い流し、医療機関を受診してください。使用後は、使用済み溶液と汚染物質をアルカリ性無機有害廃棄物として対応容器に収集してください。明確にラベルを貼り、EHS有害廃棄物プログラム²⁷を通じて処分を依頼してください。
      注:エッチング開口部のサイズは530μm×530μmで、自己エッチストップの深さは375μmです。エッチングは異方的であるため、その深さで自動的にプロセスが停止します。
5. シリコンウェハにピラニアクリーニングを行います。
6. 1100°Cで90分間熱湿式酸化を行い、新たな熱酸化層を成長させます。
7. 背面フォトリソグラフィ:ウェハー背面で、ステップ1.3と同じ手順と条件でフォトレジストコーティング、露光、現像、焼き付けを行います。
8. 裏面酸化膜のパターン化:裏面酸化膜のパターン化のためにバッファード酸化物エッチング(BOE)(HF:_{NH 4}F = 1:7)を行い、その後ストリッパーでフォトレジストを除去します(図2D)。
   注意:BOE溶液にはHFが含まれており、皮膚に浸透して組織損傷(壊死)や低カルシウム血症を引き起こす可能性があります。必ずフムフード内で作業し、HF耐性手袋(ニトリル手袋の上に)を着用してください。使用後は、HF/BOE廃棄物として明確に表示されたHDPE容器にすべてのHF含有液体および固形物を収集してください。カルシウムグルコン酸ゲルを近くに置き、指定された廃棄物プロトコル^27,28に従って即時のEHS回収を依頼してください。
9. BOEエッチング中は、エッチングの端点を監視するためにDI水湿点チェックを行います。
   1. 熱酸化物のBOEエッチング速度(110-120 nm/min)を考慮し、完成時間が近づくにつれてシリコンウェハを脱イオン水に短時間浸し取り出し、水滴の濡れ挙動を観察します。
   2. 酸化物が選択的に除去されていること(水湿しがないことで示される)を確認し、熱酸化物除去の完了を示します。
10. ステップ1.4と同じ条件で、90°Cで~180分間、裏側異方性シリコンエッチングを行います(図2E)。
    注意:ウェハー厚の許容誤差が±25μmの場合、約150分後(例:顕微鏡を用いて)からスルーホール形成の確認を始め、エッチングを停止するタイミングを判断してください。
11. 裏面エッチングが完了した後、EBEディップを行い、エッチングされたウェハ上に残った酸化膜を除去します(図2F)。
12. DI水の濡れ確認を行い、すべての酸化物が除去されているか確認してください(「シート剥がれ」効果が観察)。
13. エッチングされたシリコンウェハに対して、ICPエッチャー上でC₄F₈ プラズマ堆積(60 sccm、ICP 800 W、RF 10 W、10 mTorr、60秒、静水接触角≥100°)を用いて、エッチングされたシリコンウェハに対して疎水性表面処理を行います。次に、ニッケルボンドダイヤモンドハブブレード(スピンドル30,000rpm、送り速度50 mm/s、露光=4×ブレード厚さ、DI水冷却剤0.5 L/min)を備えたダイシングソーでウェハーを刻みます。
    注:疎水性プラズマ処理により、シリコンモールドの表面は濡れない状態になり、硬化したポリマーMNとシリコン構造の分離を促進します。

2. ポリマー溶液の調製

1. 10 mLの使い捨てシリンジを使い、50 mLの円錐形遠心分離機チューブに蒸留水9mlを加えます。
2. S/Tスプーンとグリースプルーフペーパーを使い、精密天秤に1gのゼラチン粉末を重み、円錐形のチューブに移します。
   注意:グリースプルーフ紙からチューブにゼラチン粉末を移す際、静電気で粉末が紙に付着し、1g未満の粉末が加えられることがあります。転写前後の紙の重さを比較し、足りないゼラチン粉末を加えます。
3. S/Tスプーンで、チューブ内のゼラチンの塊を時計回りに5分間かき混ぜて、溶液の回転がこぼれないように注意してください。
4. 蒸留水4リットルの水浴槽を満たします。
5. 水浴の温度を60°Cに設定し、目標温度に達するまで~30分待ちます。
6. ゼラチン溶液を入れたチューブを60°Cの水浴に30分間浸し、ゼラチンを溶かします。
7. チューブを取り出し、3,300rpmで1分間渦巻きして残ったゼラチン粒子を完全に分散させます。
8. 使用前に粘度変化やゲル化を防ぐため、ゼラチン溶液は60°Cの水浴で維持され、最終体積9.7 mLは10.31%(w/v)のゼラチン溶液に相当します。
   注意:ゼラチン溶液はMN製造に使用される前に、60°Cの水浴で少なくとも5時間保持してください。

3. 固体および中空のMNの製造

1. 顕微鏡スライド2枚(76mm×26mm×1mm)をペトリ皿に平らに置き、7mm間隔で置き、両面の不織りテープで固定します。
2. 製作されたシリコンマスターモールドを2枚の顕微鏡スライドの上に置き、裏側(AVHが入っている側)を下向きにします。
3. AVHが2枚のスライド間の隙間に中央になるように金型の位置を調整します。
4. ペトリ皿(シリコンマスターモールド付き)を真空乾燥器(約260mm×260mm×100mm)の中央に置きます。
5. 1mLの使い捨てシリンジを使い、シリコンマスターモールドの中心に0.3mLのメタノールを塗布します。
   注意:メタノールは可燃性で揮発性かつ有毒な溶媒です。その蒸気の吸入や皮膚の吸収は、視神経障害、失明、または全身中毒を引き起こす可能性があります。常に安全ゴーグル、フェイスシールド、二重ニトリル手袋を着用し、通気の良い場所(できればフムフード内)で取り扱ってください。使用後は、残留メタノールと洗浄液を可燃性有機溶媒廃棄物として密閉・適合容器に二次封じ込めで収集します。国家実験室廃棄物規則²⁷に基づき、機関のEHS有害廃棄物プログラムを通じて回収を申請してください。
6. シリンジの先端を型の表面に沿って優しく動かし、メタノールを端に均等に分布させます。
   注意:メタノールは非常に粘度が低い(~0.594 mPa·s)なので、わずかな乱れでも型からこぼれ落ちることがあります。あふれを防ぐために正確に塗布するために、注射器の先端をメタノールで湿らせてください。
7. 真空乾燥機を密封し、真空ポンプで-80 kPaの真空を2分間かけて、メタノールがシリコンマスターモールドに完全に浸透できるようにします。
8. メタノール中の残った気泡を取り除くために真空を解除します。
9. 水浴から準備済みのゼラチン溶液を取り出し、クリーンルーム用ワイプでチューブの外側の水を拭き取ってください。
10. 固体MNの場合は、20〜200μLのマイクロピペットを使って、シリコンマスターモールドの中心に100μLのゼラチン溶液を分散します。中空のMNの場合は、ゼラチン溶液40 μLを投与します。
11. 真空乾燥機を密閉し、-80 kPaを2分間加えます。
12. ゼラチン溶液中の残った気泡を取り除くために真空を解除します。
13. ペトリ皿を水平に保ち、60°Cの水槽に2分間浸します。
    注意:ペトリ皿が浴槽の水に直接触れないようにしてください。60°Cの環境は溶液の粘度を下げ、浴槽内の相対湿度は100%であるためゼラチンの乾燥を防ぎます。
14. ペトリ皿を水浴から取り出し、水平を保ちます。
15. ゼラチン溶液の表面をピンセットで触れ、型の端まで均等に広げて、型全体に薄い溶液の層を塗りつけます。
    注意:溶液が冷すぎると粘度が高いためピンセットにくっついて伸びてしまいます。したがって、60°Cの浴槽から型を取り出した直後に、ゼラチンの粘度がまだ低いうちに溶液を素早く広げてください。
16. 型を水平に保ち、40°Cのオーブンに入れて少なくとも4時間乾燥させます。
17. 完全に乾燥したら、シリコンマスターモールドとMNベースの間にピンセットを差し込み、慎重にひねって持ち上げて脱型し、硬化した溶けたポリマーMNを得ます。

結果

この研究では、AVHを備えたマスターモールドを導入し、鋭い先端を持つMNの製造が可能となり、従来のマスターモールドの使用からは逸脱しました。高精度シリコンエッチングを用いてAVH装備のマスターモールドを成功裏に製造し、そこからMNを製造しました。製造されたシリコンマスターモールドは場放出走査型電子顕微鏡(SEM)で画像化され、製造されたMNはデジタル顕微鏡と電界放出SEMの両方で観察されました。

図3はシリコンマスターモールドのレイアウトと、実際に製造された金型のAVHおよびSEM画像(トップおよび断面図)を示しています。厚さ525μmの4インチ(100)シリコンウェハが使用され、エッチング開口は530μmでした。図3Bに示すように、V字溝が金型先端の中心で交わる地点でAVHが成功裏にエッチングされました。図3Cは、シリコンウェハの異方性エッチングプロファイルを示す断面SEM画像です。上層と下層のエッチン...

ディスカッション

この研究では、AVHを用いたシリコンマスターモールドを両面エッチングで製造し、粘性ポリマー充填時に空気の閉じ込めを防ぎ、MN先端までの完全な充填を実現し、鋭く均一なMNの形成を可能にしました。適切な先端形成の重要な要素は、背面エッチングによって作られるAVHの大きさです。シリコンウェハーの厚さ(±25 μm)の変動を考慮すると、裏面エッチングの時間を正確に予測するのは困難です。エッチングが長すぎるとAVHサイズが大きくなり、MN先端が大きくなります。これにより皮膚挿入時の接触面積が増え、必要な挿入力²⁹が増加しますが、使用時に痛みを引き起こす可能性があります。AVHが完全に開いているかどうかを判別するには、エッチングからウェハーを取り出し、洗浄し、顕微鏡で確認する必要があり、手間がかかります。実験では、背面エッチング速度は150μmの厚さに対して~0.85μm/min(すなわち10分で~8.5μm)でした。ウェハー厚の許容範囲を考慮すると、約30分間の不確実性が続き、頻繁な点検は実用的ではありません。これを克服するために、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クリーンルームワイプ	朝日カセイ	ベムコット M-3	25mmと時間;25mm
円錐形遠心分離機チューブ	コーニング	352070	50 mL
ダイシングソー	ディスコ	DAD-3220	スピンドル回転30,000rpm、送り50 mm/s、露光=4&回;刃の厚さ、DI-ウォーター冷却液 0.5 L/min
デジタル顕微鏡	ヒロックス	KH-7700	MXG-5040RZカメラレンズと組み合わせて使用
使い捨て注射器	韓国ワクチン	コバックス・シリンジ	1 mL &10 mL
蒸留水	三春純化学	000W0054
両面不織りテープ	3歳	ID-8370S	厚さ0.16 mm
電界放出SEM	日立ハイテック	S-4300SE
ゼラチン粉末	シグマ・オルドリッチ	G1890	豚の皮膚から、タイプA、粉末、ジェル強度~300g、ブルーム
グリースプルーフ紙	PT. パリシンド・プラタマ		100mmおよび時間;100mm
ICPエッチャー	オックスフォード・インスツルメンツ・プラズマ技術	プラズマプロ100コブラ
マスクアライナー	プロ・ウィン	M-150
メタノール	シグマ・オルドリッチ	34860
マイクロピペット	PZ HTL S.A.	4045-DV	20–200 & マイクロ;L
顕微鏡スライド	ポール・マリエンフェルト有限会社 &KG中隊	マリエンフェルト・スペリオル	76mmおよび時間;26mmと時間軸;1 mm
オーブン	ジェイオテック	OF-02G
ペトリ皿	SPLライフサイエンス	10150	150mmと時間;20mm
精密バランス	RADWAG Wagi Elektroniczne	WTC 200
PRストリッパー	メルク	AZ 100 リムーバー	製品番号 1000100
S/Tスプーン	韓国材料科学		20 cm
ピンセット	アイデアルテックS.A.	2AB.TA
真空乾燥機	iNexus	インVS	260mmと時間;260mmと時間;100mm、6.7L
真空ポンプ	ロッカー・サイエンティフィック	ロッカー300
ボルテックスミキサー	大韓サイエンティフィック	VM-10
水浴	ハンベク・サイエンティフィック	HS-205WS	330mmと時間;300mmと時間;150mm、15L