上顎チタンインプラントの埋め込みおよびポルフィロモナス歯肉結紮誘導 による ラットインプラント周辺炎モデルの確立

サマリー

本研究では、上顎チタンインプラントを用いたインプラント周囲炎のラットモデルを確立し、歯の抜歯、チタン製器具の外科的埋め込み、治癒後にインプラント首部にポ ルフィロモナス浸染性結紮を施すことによる炎症性骨減少の誘導を含みました。

要約

インプラント周囲炎(PI)は、炎症性軟部組織病変や進行性骨の喪失を特徴とする歯科インプラント失敗の主な原因であり、機構的および治療的研究のために信頼できる動物モデルを必要としています。この研究は、機械的刺激と細菌感染を相乗的に組み合わせ、ヒトPIの病因をよりよく模倣する新しいラットモデルを確立しました。12頭のオス・スプラグ・ドーリーラット(生後4週間)で上顎第一大臼歯を抜歯し、8週間の治癒期間を経て、チタン製インプラントが挿入されました。4週間の骨統合後、PI群(n=6)はインプラント頸部に Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis) を浸した結紮を施し、陰性対照群(n=6)は結紮処置を受けませんでした。誘導後2週間で 、マイクロコンピュータ 断層撮影(micro-CT)および組織学による解析により、PI群で著しい歯槽骨の喪失と重度の軟部組織炎症、顕著な炎症性細胞浸潤および組織破壊が認められました。この検証済みモデルは臨床PIの主要な特徴を効果的に再現しました。その制約には、単一病原体チャレンジが簡素化されていることや、ヒトPIに比べて病気の経過が加速していることが挙げられます。それでも、調査および治療研究において堅牢で臨床的に関連性の高いツールを提供します。

概要

補綴歯科の進歩により、歯科インプラントは^{臨床応用を}継続的に拡大しています。しかし、最も多い合併症であるインプラント周炎症(PI)は、インプラントの長期的な生存を著しく損なうとともに、患者の口腔健康に持続的な悪影響をもたらします²。PIはインプラント周囲組織の病理的炎症性疾患であり、主にプラークバイオフィルムマイクロバイオームの不均衡によって引き起こされ、インプラント周囲軟部組織の進行性炎症とその後の支持骨の喪失を特徴^{とします。}患者レベルの有病率とインプラントレベルの有病率はそれぞれ19.53%と推定^{され、管理}の複雑かつ高コストな性質を考慮すると、PIは臨床および公衆衛生にとって大きな負担となっています⁶。

PIの複雑な病因の解明と効果的な治療法の開発は、^{人間の疾患を}忠実に再現する堅牢な動物モデルに根本的に依存しています^7,8。犬やミニピッグのような大型動物モデルは解剖学的には類似性があるが、深部機構調査での利用は高コスト、倫理的・飼育上の懸念、種特異的分子ツールの不足により制限されている(⁹.一方、齧歯類モデルはコスト効率、取り扱いの容易さ、豊富な遺伝子操作性という利点を持ち、分子経路の詳細な調査を容易にします¹⁰。しかし、マウスモデルはその小型化と外科手術の技術的課題によりしばしば制限^{されています。}これらの制限は、局所性やマウス歯周^{炎モデルに}共通する早期結紮脱失など、確立された方法における手続き上の問題によってさらに複雑化しています。このマウスは実用的な妥協案として登場し、より広い手術分野、骨治癒研究における確立された有用性、そして特定の遺^伝因子を探るための遺伝子転換株の利用可能性を備えており、PIモデリングに非常に適した候補となります。その可能性にもかかわらず、ラットPIモデルの採用は、信頼性の高い抜歯や一貫したインプラントの挿入など、外科手術における技術的な複雑さによって制限されています。

既存のラットモデル誘導技術には、シルクリガチャー配置^14,15、局所病原体接種¹⁶、脂多糖注入¹⁷があります。経口細菌洗浄に依存していた従来の感染モデルは、しばしばバイオフィルムの不安定な形成や不安定な炎症反応を引き起こすことがありました¹⁸。シルクリガチャー法は、プラークの急速な蓄積を促進するために一般的です。しかし、結紮だけでは生理学的でない機械的損害を与え、制御された病原性挑戦を組み込むことができず、PI¹⁹の感染症病因を十分に示していません。一方、P. gingivalisのような病原体による単一感染は、安定したバイオフィルムの形成に苦労し、強靭な炎症を一貫して誘発できない^{ことがあります。}我々は、結紮術が二重の損傷をもたらすと仮説を立てます。絹縫合は機械的刺激物であり、複雑なバイオフィルム形成の足場として機能し、一方で投与された主要病原体であるP. gingivalisは、不適合性の炎症反応を引き起こし、持続させると仮説を立てます²¹。この統合された二重病原アプローチとその時間的進行を視覚的に要約するために、この結合P. gingivalis-ライゲーションラットモデルを確立するための実験手順とタイムラインの概略的な概要を示します(図1)。本記事では、ヒトPIの重要な骨および軟部組織の病理を信頼性高く再現することを目的とした、この結合型ギンジバリス-リゲーションモデルの確立と検証について詳述し、モデルの臨床的関連性と前臨床研究への有用性を高めています。

図1:細菌負荷縫合結紮法によって誘発されるラットインプラント周囲炎モデルを確立するための実験的手技タイムラインの概略図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル

サンプルサイズは、既に発表された齧歯類インプラント周囲炎(PI)モデルの一般的な慣行と^{利用可能な資源の}制約に基づいて決定されました。12頭の4週齢オスのスプラグ・ドーリーラット(サウスウエスト医科大学実験動物センター提供、ライセンス番号:SCXK (Chuan) 2024-0046)が、抜歯、インプラント挿入、PI誘導に使用されました。すべてのラットは標準的な特異的病原体フリー(SPF)バリア施設で管理され、異なる実験群の動物は別々に飼育されました。ラック内のケージの位置は週ごとにランダム化されていました。ラットはランダムナンバージェネレーターを用いて、ネガティブコントロール群(NC)またはPI(グループあたりn=6)のいずれかに割り当てられました。すべてのラットに対する手術の順序はランダム化されています。すべての処置は南西医科大学動物研究倫理委員会(承認番号20241111-012)によって承認され、動物福祉ガイドラインに準拠しています。本研究は倫理的な動物研究の3R原則(代替、還元、精錬)に従って実施されます。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 抽出前準備

1. すべての手術器具(#5デンタルエクスプローラー、針ホルダー、眼用鉗子、医療用綿棒、組織鉗子など)はオートクレーブで滅菌してください。その後のすべての手順はクラスIIのバイオセーフティキャビネット内で行い、無菌状態を維持します。
2. 23番のラットにトリブロモエタノール(250 mg/kg)腹腔内注射を行い、ラット²³ を麻酔させます(機関承認プロトコルに従い)。後足でつねられた際に引き込み反射が現れないことで、麻酔の深さを確認してください。
3. 処置中の角膜乾燥を防ぐために眼科潤滑剤を塗布してください。
4. 75%エタノール溶液ですべての作業面を徹底的に消毒してください。
5. ラットを安定した手術台の上で仰向けに置きます。上顎切歯と下顎切歯をゴムバンドで引っ張り、最大限の口開きを達成・維持します。手術用ヘッドライトで口腔内を照らします。
6. 組織鉗子で舌を優しく掴み、片側に引き戻します。舌をしっかり固定し、上顎臼歯をはっきりと見やすく保ちましょう。

2. 抜歯手術

1. 手術部位をポビドンヨウ素で消毒してください。#5歯科探検器を上顎第一大臼歯の遠位面(第一大臼歯と第二大臼歯の近位間)に置き、近心遠隔力を加えて初期脱臼を達成します(図2A)。
2. 探検器を第一大臼歯の近心面に位置移し、近心遠位力を加えて歯をさらに動かします(図2B)。
3. エクスプローラーの先端を口蓋の歯肉溝に置きます。優しい口腔口蓋の回転運動と、歯の長軸に沿った持続的な咬合圧を組み合わせて加えます。歯がソケットから完全に脱臼するまで続けます(図2C,D)。
4. 抜歯した歯を直接視線で慎重に調べ、すべての根が無傷で骨折がないか確認してください。空洞のソケットに無菌注射器からの生理食塩水を優しく洗浄し、残留した血栓やゴミを取り除きます(図2E,F)。
5. 滅菌綿棒で1分間圧をかけて止血を達成します。舌を解剖学的な位置に戻してください。麻酔が完全に回復するまで、動物を温熱パッドの上に置いたままにしてください。
6. 1週間、ソフトダイエットと抗生物質補充飲料水(アモキシシリン250mg/kg)を提供します。
   注意:脱臼時は制御された漸進的な力を加え、急な動きを避けることで根の骨折や歯槽骨の損傷を防ぎましょう。

図2:抜歯の手順。 歯科プローブをラット上顎臼歯の遠位および近位部に挿入し、歯周靭帯(A,B)を解放しました。口蓋に回転力と咬合力を加えて歯を脱臼させる(C,D)。ソケットは残留根断片(E)がないか徹底的に検査されました。無傷のラット上顎第一臼歯が示されています(F)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. インプラント挿入手術

1. 抜歯から8週間後、無菌の12cブレードを使って無突起隆起に5mmの近中近距離切開を行い、骨表面まで貫通します(図3A)。
2. 鈍的解離には#5エクスプローラーを使用し、全層の粘膜骨蓋を上げて手術部位を露出させます(図3B)。
3. 直径1.5mmのタングステンカーバイドドリルを手動ドライバーアダプターに接続し、時計回りに手動回転させ、間欠的に生理食塩水灌漑を行って体温制御を行い、治癒した抜歯ソケット内に4mm深さのインプラントを準備しつつ、皮質穿孔を防ぐために継続的な触覚フィードバックを維持します(図3C)。
4. 時計回りに回転させて、直径1.8mm、長さ3.2mm、機械加工面のカスタムチタンインプラントを挿入します。エクスプローラー適用時の可動性の欠如によって安定性を検証します(図3D-F)。
5. 先述のソフトダイエットと抗生物質の継続で1週間の回復期間を設けてください。
   注意:上顎洞底の医原性穿孔を防ぐために、優しい手術技術を用い、過度な軸方向の力を避けてください。

図3:インプラントの挿入手順。 中近傍中位切開はNo.12の曲面刃(A)を用いて行われました。粘膜皮弁は歯科プローブ(B)で反射されました。1.5mmのタングステンカーバイドドリルビットを手ドリル(C)に取り付けて骨切り術を行いました。インプラントはカスタマイズされたインプラントキャリア(D)を介して顎骨に埋め込まれました。着床後、プローブを使って可動性(E、F)を調べました。カスタムメイドのチタンインプラント(滑らかな表面のねじ、直径1.8mm、長さ3.2mm)、対応するインプラントキャリア(G,H)、ミニハンドドリル(I)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. P. gingivalis - 結紮縫合の準備

1. P . gingivalis を37°Cで無酸素培養し、5 mLの脳心臓輸液(BHI)ブロスで10⁹ CFU/mL(OD₆₀₀ =1.0)に達するまで培養します。
2. 1:20の希釈液で懸濁液を10mLの新鮮BHI培地に移します。
3. 滅菌3-0シルク縫合糸を接種培地に完全に浸します。37°Cで無酸素状態で48〜72時間培養し、成熟したバイオフィルムを形成します。

5. PI誘導法

1. 植込みから4週間後、無菌針ホルダーを使ってインプラント首部の周りにP. gingivalis浸した縫合糸を結紮します。歯肉組織に隣接するトリプルノットで固定します(図4A-D)。
2. 炎症の進行を監視しながら2週間結紮を続けてください。
3. 毎日の結紮点検を行いましょう。緩んだり紛失した場合は無菌技術で交換してください。
   注意:結び目を結ぶ際は、軟部組織を優しく分けて裂けないようにし、縫合結び目は歯肉下に位置していることを確認してください。

図4:縫合誘導PI手技:準備された細菌浸染性縫合糸(3-0)をインプラントの遠位端の歯肉下位置に置いた(A)。最初の結び目は結び目を結び、針ホルダーで固定して結び目が脱臼しないようにしていました(B)。その後、縫合糸の滑りを防ぐために三重結び目を結びます(C、D)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. 安楽死とサンプル採取

1. 2週間の誘導期間の後、動物は機関で承認されたプロトコルに従い、深層イソフルラン麻酔 下で 子宮頸部脱臼によって安楽死させます。インプラントを使った無傷の上顎骨を鋭利な器具で切り離してください。
2. 直ちに標本を4%パラホルムアルデヒドに浸し、24時間固定します。PBS洗浄で残留軟部組織を除去し、70%エタノールに保存してください。
   注:この段階では実験を一時停止し、70%エタノールで4°Cの長期保存を行う場合があります。

7. マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)解析

1. 確立された方法論に従ってマイクロコンピュータ断層撮影による標本のスキャン²⁴.
2. スキャナーとコンピューターの電源を入れて。取得ソフトウェアを起動します。 放射線安全 アイコンをクリックして15分間のウォームアップを許可してください。
3. スキャンチャンバーを開けろ。試料を低密度フォームで安定化した15 mLの円錐形チューブに取り付け、チューブを回転ステージに固定してスキャンチャンバー内に位置させます。
4. X線源(90 kV、80 μA)を起動します。 プレビュー アイコンをクリックして最適な位置を確認してください。パラメータを設定してください: 解像度12μm 、露光 20Hz 、合計 4000 フレーム。
5. Recon 1.7.4.0ソフトウェアを使って画像を再構築できます。
6. Avatar 1.7.4.0ソフトウェアで、上顎第一大臼歯領域のROIを解析し、以下の骨パラメータを解析します:骨体積分数(BV/TV)、骨表面と骨体積比(BS/BV)、小梁厚(Tb.Th)、および小梁数(Tb.N)。

8. 組織学的処理

1. 固定標本は10%EDTA(pH7.4)で脱灰し、溶液を72時間ごとに交換し、4週間にわたり行います。針の貫通試験で完成を確認してください。
2. エタノールシリーズによる脱水試料:75%エタノールを4時間、85%エタノールを2時間、90%エタノールを2時間、95%エタノールを1時間、そして100%エタノールを2回交換してそれぞれ30分間。
3. 透明な標本をキシレンで2回、それぞれ10分間交換します。パラフィンで浸透し、3回の交換でそれぞれ1時間かかります。
4. 溶融したパラフィンに組織を埋め込み、-20°Cの凍結段階で冷却します。ブロックをトリミングし、4°Cで10時間保存してから区切ってください。
5. 5μm厚さの区画パラフィンブロック。45°Cの水浴で断片を浮かべ、ガラススライドに取り付けます。37°Cで1時間ドライスライドします。
6. セクションをキシレンを2回交換してそれぞれ5分間脱硫します。エタノールのグラデッドラインで再水和します:100%エタノールを5分、90%エタノールを5分、80%エタノールを5分、70%エタノールを5分間。
7. 蒸留水で1分間断片をすすぎます。ヘマトキシリンで8分間染色し、その後流れる水道水ですすいでください。
8. 1%の酸性アルコールを3秒間分化します。ブルーニングの際に流れる水道水ですすいでください。エオシンでカウンターステインを5分間塗ります。
9. 脱水断片は段階エタノール系列で:70%エタノール10秒、80%エタノール10秒、90%エタノール10秒、100%エタノール10秒。キシレンを2回交換し、それぞれ5分間クリアします。
10. 中性バルサムでカバースリップを取り付け、光学顕微鏡で観察します。
    注意:キシレンは危険です。適切なPPEを着用して排気フードで使用してください。

結果

研究に参加した12頭の4週間齢Sprague-Dawleyラットは全て、すべての手術を無事に完了し、結紮前に安定した骨統合を示し、合併症なしの回復という事前定められた納入基準を満たしました。分析から除外される動物はいません。ラットは乱数生成器を用いてNCまたはPIグループ(n=6個)にランダムに割り当てられます。マイクロCT定量化および組織病理学的評価を行う研究者は、アウトカム評価およびデータ解析の過程でグループ割り当てを無視したままです。すべてのインプラントは4週間の骨統合およびその後の2週間の結紮期で安定を維持し、インプラントの喪失は認められません。

臨床症状
NC群とPI群の比較解析では、PI群にインプラント周辺の紅斑性粘膜変化、深刻なポケット形成、そしてNC群と比較して有意に悪化した軟部組織浮腫など、明確な臨床症状が見られました(図5)。

ディスカッション

本研究は、P. gingivalisに浸した縫合糸を用いてラットモデルでPIを誘導する可能性を示し、関連する手術手順の詳細な記録を提供します。特にラットにおける齧歯類モデルは、その入手しやすさ、メンテナンスコストが低く、生殖効率が高いことから歯科研究で確立されており、既存の文献^15,25も支持しています。ラットのほとんどの手術は、手術用顕微鏡なしで直接観察下で行うことができます²⁶ですが、口腔の大きさが限られているため、手術中に口を一貫して開くことを維持するのが難しい技術的側面であり、細心の注意が必要です。

第1大歯の抜歯は、#5歯科プローブを使ったため、歯周靭帯の徹底的な緩みと骨抵抗の減少が求められ、根の骨折を防ぎます。さらに、ラット上顎洞の繊細な構造は、骨切開術の際に細心の注意が必要です。垂直圧力を最小限に抑えた穏やかな回転ドリル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#5 デンタルエクスプローラー	鄭州康徳台医療有限公司、鄭州、中華	6970327120856	歯の脱臼と抜歯
1%酸性アルコール	中硝薬化学試薬有限公司、上海、中華	10000018(エタノール)&10000118(Hcl)	ヘマトキシリン分化
10% EDTA(pH 7.4)	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢、中国	G1105	骨の脱石灰
100%エタノール溶液	マックリン生化学技術有限公司、上海、中国	E708068	完全な脱水と溶媒の調製
12cブレードと外科用メス	天大医療有限公司、淮安、中国	6951933811154	粘膜剥膜弁の創設
3-0シルクリガチャー	金環医療、上海、中国	NC9201232	合字
4% パラホルムアルデヒド	バイオシャープ、合肥、中国	BL539A	組織固定
70%エタノール	実験室での準備	-	サンプル保存
75%エタノール溶液	マックリン生化学技術有限公司、上海、中国	E885996	表面消毒と初期脱水
アモキシシリン50 & μ;g/mL	北華製薬有限公司、石家荘、中国	H13020635	飲料水中の抗生物質補給
アバターソフトウェア	アバター・インテグレーテッド・システムズ社、ミュンヘン、DE	-	骨パラメータ解析
BHI媒体	クラウンラボ・サプライズ社、ブリティッシュコロンビア州、カリフォルニア州	110052	P. gingivalis文化
CT-ボクセル	ブルーカー・コーポレーション、マサチューセッツ州ビレリカ、アメリカ合衆国	-	マイクロCT画像可視化
イオシン	北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社、北京、CN	G1100	細胞質染色
エタノールシリーズ(80%、90%、95%)	実験室での準備		組織の徐々の脱水・再水分化
GraphPad プリズム	GraphPad Software, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国	バージョン 9.0.0	統計解析とグラフ生成
ヘッドランプ	深圳サップファイア照明有限公司、深圳、CN	HL23-X	口腔内照明
ヘマトキシリン	北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社、北京、CN	H8070	核染色
インプラントキャリア	四川魏西達医療機器有限公司、四川省、中国	ユニークな製品	手動インプラントの挿入
イソフルラン	RWDライフサイエンス株式会社、深圳、CN	R510-22-10	吸入麻酔維持
手動ドライバーアダプター	帝琴装飾材料有限公司、杭州、中国	DQ-80013	骨切り術
医療用綿棒	啓康製薬有限公司、蘇州、中国	HN-02	止血
マイクロCTスキャナー	サービスバイオテクノロジー株式会社、武漢、中国	VNC-102	μCTスキャン
ニードルホルダー	上海医療機器有限公司、上海、中国	J32110	縫合結紮
中性バルサム	北京ソーラービオ科学・科学テクノロジー株式会社<> 北京、CN	G8590	組織学的切片設置
眼科鉗子	ソリンメッド・テクノロジー株式会社、深圳、中国	SS-5002	リガチャーの配置
パラフィン	アミン・ヌーリ ジェネラル・トレーディングLLC、ドバイ、AE	8012-95-1	組織埋め込み
PBS	プロセル・ライフサイエンス&テクノロジー株式会社、武漢、中国	PB180327	組織洗浄
ポルフィロモナス・ギンギバル	同等物	-	炎症誘発
ポビドネイオジン	成都永安製薬有限公司、成都、中国	H51023539	消毒
偵察ソフトウェア	リコン・テクノロジー社、ケイマン諸島、イギリス	バージョン 1.7.4.0	マイクロCT画像再構成
ラバーバンド	浙江岳義ゴム製品有限公司、台州、中国	VYR43*1.4	顎の牽引と固定
SDラッツ	西南医科大学実験動物センター(路州、中華中核州)	SCXK(Chuan)2024-0046	外科的手技
鋭い外科用はさみ	湖南科福医療技術有限公司、長沙、中国	1.0806E+13	糸切り
組織鉗子	ファインサイエンスツールズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国	11000-12	舌の牽引と固定
チタンインプラント(およびOslash;1.8×3.2mm)	四川魏西達医療機器有限公司、四川省、中国	ユニークな製品	チタンインプラント
トリブロモエタノール(アヴェルチン)	河南世侯バイオテクノロジー有限公司、鄭州、中華	-	腹腔内麻酔
キシレン	中硝薬化学試薬有限公司、上海、中華	10023418	組織のクリアリングと脱毛