本稿では、ラットの降行大動脈にin vivo テレメトリックインプラントを設置するためのステップバイステップのプロトコルを提示し、重度の高位胸髄損傷の前後で心血管パラメータ、体幹温度、動物活動の連続的かつ長期的なモニタリングを可能にします。
本稿では、ラットの降行大動脈にin vivo テレメトリックインプラントを設置するためのステップバイステップのプロトコルを提示し、重度の高位胸髄損傷の前後で心血管パラメータ、体幹温度、動物活動の連続的かつ長期的なモニタリングを可能にします。
胸椎レベル6(T6)を超える高位脊髄損傷(SCI)は自律神経機能を乱し、血圧、心拍数、体温の変動などの二次合併症を引き起こします。ラットでは、降行大動脈にテレメトリックインプラントを設置することで、収縮期血圧や拡張期血圧、平均動脈圧、心拍数など、さまざまな心血管パラメータを評価するための堅牢な方法論が提供されます。テレメトリックインプラントの挿入後、体温や動物の活動も記録できます。テレメトリックインプラントを装着したラットは、さまざまなパラメータを記録するためにコンピューターシステムに接続された受信板に置かれます。定められた時間間隔での長期連続記録により、心血管機能の昼夜変動を含む損傷による生理的障害を定量化することが可能です。損傷前(ベースライン)と損傷後の記録を比較することで、SCIがこれらの生理的指標に与える影響を評価できます。本方法論論文は、ラットの下行大動脈へのテレメトリックインプラント挿入(動脈の単閉塞を用いる)および重度高位胸椎(T3)SCI後の連続テレメトリー記録に関する詳細なステップバイステップ手順を概説しています。この手順を実行する際に通常直面する課題と、専用のトラブルシューティングセクションについて解説します。また、Ponemahソフトウェアを使ったデータ取得プロセスとそのさまざまな応用についても議論されています。ラットは脊髄損傷に関連する心血管、体温、活動異常を示しており、テレメトリックインプラントはこれらの損傷後の合併症を研究し、治療法を評価するための効果的な装置です。
外傷性脊髄損傷(SCI)は感覚および運動機能を障害し、心血管および体温調節を妨げます 1,2,3,4。T6レベル以上の損傷は自律神経機能の脊髄上制御を妨げ、バロレセプター反射の障害、血圧調節障害、心拍変動(徐脈または頻脈)、体温調節障害、運動活動の低下など、さまざまな心血管反応に深刻な変化をもたらします。3,5,6,7,8,9,10 .これらの異常は、損傷の急性期および慢性期の両方で観察されます 2,3。年齢に伴う人口動態の変化により、心血管機能障害はSCI 9,11患者の死亡率および長期罹患の主な原因の一つとなっています。損傷の急性期は神経原性ショックを引き起こし、交感神経障害による低血圧や徐脈が特徴的ですが、T6レベルを超える損傷の人でも高血圧を引き起こすことがあります。慢性期には、これらの患者はしばしば自律神経反射異常(AD)や起立性低血圧(OH)5を経験します。ADは、収縮期血圧(SBP)がベースライン14,15より20〜40 mmHg突然に突然上昇する生命を脅かす状態です。個人は激しい頭痛、皮膚の紅潮、発汗、鼻づまり、毛突起、不安、視界のぼやけなど、さまざまな症状を経験することがあります。治療しない場合、ADはSBPを最大300 mm Hgまで上昇させ、けいれん、脳卒中、心筋梗塞、または突然死を引き起こす可能性があります(17,18)。OHは、仰向けや座った姿勢から立っている状態に移行した際に血圧(BP)が急激に低下し、めまい、めまい、または失神を引き起こすことがあります。臨床的には、19.20の立っている状態から3分間以内に収縮期血圧が少なくとも20 mmHg、または拡張期血圧(DBP)が少なくとも10 mmHgの持続的に低下することと定義されています。したがって、慢性期は重度高位胸椎脊髄損傷の患者における高血圧および低血圧エピソードの両方によって特徴づけられます。心血管生理学、体温変動、活動に関する詳細な理解は、SCI後の急性期および慢性期における自律神経機能障害に対処するための標的的治療策を設計する上で不可欠です。
下行大動脈にテレメトリックインプラントを設置することで、SCIが収縮期および拡張期血圧、平均動脈圧(MAP)、心拍数、体幹温度、実験的なSCIモデルにおける活動への影響を効率的に記録できます。テレメトリックインプラントの設置に関する堅牢で高感度な方法を理解することは、SCI後の信頼できる生理学的データを得るために不可欠です。血圧を記録するテレメトリック技術にはいくつかの利点がありますテレメトリックではない技術(例:テールカフ技術)を用いて。利点には、継続的かつリアルタイムのモニタリング、ストレス誘発アーティファクトの低減、データの精度と再現性の向上、動物福祉の向上、そして病気モデル、妊娠中の動物、新生児などの小規模または感度モデルへの適合性が含まれます。これらの利点により、テレメトリック技術は実験的再現性を促進し、自由に動く動物における人間に似た自律神経および神経応答のモデリングを可能にすることで、SCI研究における翻訳的関連性を高めます。
本稿は、降行大動脈24への遠隔インプラント設置に関する詳細な段階的な方法論を提供し、その後重度の高位胸椎打撲SCI手術25,26を行う。Ponemahソフトウェアを使って、心血管、体幹、行動パラメータのさまざまな記録方法を示しています。また、この手技に伴う課題や解決策の可能性も示しています。さらに、生体内テレメトリーのSCI研究におけるさまざまな応用例も強調しています。
ケンタッキー大学の施設動物ケア・利用委員会から倫理的承認を得ており、手順はプロトコルガイドラインに従い厳格に遵守されました。成体の雌ウィスターラット(11〜13週、250〜300g、n = 3)は、米国ケンタッキー大学動物研究所動物研究部門の動物施設に標準的な飼育条件(12/12 明暗・暗いサイクル、湿度30%〜70%、気温22 ± 2 °C)で飼育され、食事と水は自由に与えられ ました。 試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. テレメトリックインプラント挿入のための外科的手技
注:テレメトリックインプラントの配置はRabchevskyらから改良され、合併症と死亡率を最小限に抑えるためにさらに最適化されました24。麻酔と術前ケアの所要時間は約10分です。テレメトリックインプラント手術の時間は15分から30分の範囲です。腹部および皮膚の切開閉鎖および術後のケアは15〜20分かかります。テレメトリックインプラントの挿入手術の総時間は40〜60分です。テレメトリックインプラント手術に使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。
2. 胸部(T3)打撲損傷の外科的手技
注:T3打撲の手技はSquairら26から応用されています。T3打撲損傷の全手術期間は約40〜45分です。T3打撲SCIに必要な材料は材料 表に記載されています。T3打撲は、テレメトリックインプラントの埋め込みから少なくとも2週間後に行ってください。2週間の期間は、ほとんどの動物が手術的苦痛から回復し、7〜10日以内に基準値に戻るという観察に基づいて最適化されました。ただし、動物によっては少し時間がかかる場合もあります。
3. データの記録およびエクスポート設定
注:Ponemahソフトウェア(バージョン6.51)を用いて心血管、体幹温度、動物活動パラメータ、SCI前後の記録およびエクスポート設定が記載されています。
降行大動脈にテレメトリックインプラントを設置することで、自律神経反射異常や収縮期血圧(SBP)、拡張期血圧(DBP)、平均動脈圧(MAP)、心拍数(HR)などの心血管パラメータを、SCI前後の測定が可能です。また、体温や活動量も測定します。損傷前後のデータを比較することで、SCI後の心血管転帰、体温、活動にどのような影響を与えるかが明らかになります。図1は実験設計(図1A-C)および代表的なアウトカム(自律神経反射異常(図1D)、収縮期血圧(SBP)を含む心血管パラメータ、図1E(i))、拡張期血圧(DBP;図1E(ii))、平均動脈圧(MAP;図1E(iii))、心拍数(HR;図1E(iv))、体温(図1E(v))、動物活動(図1E(vi))、脊髄損傷前後(図1E)。動物利用を最小限に抑えるため、図1のデータはメスラットを対象とした進行中の研究から取得しています。しかし、同じ手順はオスのラットにも適用可能です。
図1Dの代表的なグラフは、SCI後8週間後に大腸内側拡張(CRD)を用いたT3打撲損傷ラットにおける刺激1分前、刺激中、刺激適用後1分の収縮期血圧を示しています。CRDは、ラットの肛門にバルーンカテーテルを挿入して直腸を刺激します。基準線が安定するとバルーンは膨らみ、刺激は1分間加えられます。刺激時のSBPが基準期(刺激前)より少なくとも20 mm Hg増加した場合、慢性期(8週間)でADの発症が示されます。
図1Eのグラフは、T3打撲損傷の48時間前と損傷後最初の2日間(損傷後48時間)に記録された記録を比較しています。脊髄損傷後、グラフではSBP、DBP、MAPの上昇を示す血圧の上昇が示されています(図1E(i)、(ii)、(iii))。脊髄損傷後の検査結果では、心拍数の変動増加(図1E(iv))、体温の不規則(図1E(v))、活動量の減少(図1E(vi))が示されました。さらに、SCIはSBP、DBP、MAP、心拍数、体温、活動の昼夜リズムを乱しました。

図1:重度高位胸部(T3)打撲損傷後のテレメトリーインプラントの配置および適用の概説。 ラットの降行大動脈に in vivo テレメトリックインプラントを挿入(A)、その後2週間後にIHインパクターを用いた重度の高位胸部(T3)打撲損傷(力=400kdyn、滞留時間5秒)を2週間後に負わせた(B)。Ponemahソフトウェア(C)を用いたコンピュータ監視システムを用いたテレメトリック記録の代表的なセットアップ。脊髄損傷(SCI)から8週間後に自律神経反射異常(AD)を示す雌ラットの代表的な痕跡(ログレート2秒で取得したデータ)。緑の点線は1分間の大腸膨張(CRD)刺激(D)を示し、48時間収縮期血圧(SBP)iiの代表的な時間平均値を示しています。拡張期血圧(DBP)、iii.平均動脈圧(MAP)、iv。心拍数(HR)、体温(体温)、体温(vi)です。SCI(E)前後の活動。影のない領域と影のある領域は、それぞれ12時間の光のサイクルと12時間の暗いサイクルを表しています。「0」はライトの点灯、「12」はライトの消灯を示します。誤差バーはSEM±平均(n = 3)を表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
降行大動脈にテレメトリックインプラントを設置することで、心血管パラメータ、体温、動物活動を確実に測定する方法を提供します。テレメトリーは非テレメトリック技術に比べて明確な利点があります。これは目覚めて自由に動く動物からデータを収集でき、血圧や心拍数を変化させる麻酔の影響を排除します21,27。非テレメトリ法とは異なり、テレメトリーは熱的および動物の拘束ストレスを防ぎ、正確な心血管測定を保証します23,28。これにより、血圧、心拍数、体温、活動を数週間から数ヶ月にわたって継続的にモニタリングできますが、非テレメトリック手法では断続的に21、28、29を記録します。全体として、テレメトリック監視は非テレメトリックアプローチよりも高精度かつ高精度を提供します。
テレメトリ法は身体的・生理的ストレスを軽減し、自然な行動を維持し、動物福祉ガイドラインの遵守を保証します27。非テレメトリック技術と比較して高い精度と低い変動性により、必要な動物の数が減少し、統計的検出力が高まります 21,23。テレメトリーはまた、データが人間の生理反応に非常に似ているため、創薬や心血管研究においても強いトランスレーショナル価値を提供します。総じて、テレメトリック方式は非テレメトリック方式よりも優れており、倫理的にも望ましいです。
ラットの降行大動脈へのテレメトリックインプラント設置は、動物モデルで代替インプラント部位として機能する頸動脈や大腿動脈への挿入と比べて、SCI研究においていくつかの利点を提供します。大きな中心血管であるため、降行大動脈は血圧と心拍数の安定的かつ代表的な測定値を提供し、SCI後の心血管機能障害を評価する重要な指標となります。この部位への着床は四肢の血流の妨げを最小限に抑え、末梢動脈の位置に伴う虚血やその他の合併症のリスクを低減します(30,31)。また、基礎心血管パラメータや自律神経反射異常の継続的なモニタリングも可能であり、どちらもSCI研究において重要です。大腿動脈への移植は同側後肢への血流を妨げ、実験結果や動物福祉に影響を与える可能性があります32,33。技術的には単純であるものの、頸動脈の移植は脳循環に近いため脳卒中や神経学的合併症のリスクを伴い、末梢心血管への影響に焦点を当てた研究では望ましくありません33。したがって、下行大動脈への移植は信頼できる部位を提供し、局所的な合併症を最小限に抑え、意識的で自由に動く動物から収集されたデータの実験的厳密さと翻訳価値の両方を高めます。降行大動脈にテレメトリックインプラントを設置する際には、いくつかの一般的な課題に直面します。
応用例
テレメトリックインプラント(HD-S10)は、小動物モデルでさまざまな生理的パラメータを記録するために設計された磁気作動装置です。これらのインプラントを降行大動脈に埋め込むことは、拘束なし、麻酔なし、自由に動く動物における連続的な血行動態モニタリングのための正確かつ信頼性の高い方法です。この手法により、前臨床研究者はSCI、薬剤効果評価、自律神経機能パラメータの日周期変化など、疾患モデリングの文脈で様々な心血管パラメータ、温度、動物活動のリアルタイム評価を行うことができます。研究者は動物の単一のテレメトリックインプラントから、急性・慢性のタイムポイントをカバーする包括的な生理学的データを取得できるため、効率的な技術となっています。 図1 は、このテレメトリアプリケーションおよび現在実験室で使用されている他のアプリケーションを示しています。
SBP、DBP、MAPなどの血行動態パラメータは急性期および慢性期の両方で記録可能です。24時間体制の安静活動リズムのモニタリングは、SCI34の急性影響の信頼できる指標となり得ます。同時心拍数モニタリングにより、頻脈や徐脈を含む心拍変動の検出が可能になります。SCI前後の血圧と心拍数の変動を比較することで、研究者は損傷後の心血管生理学の変化を理解することができます。心血管パラメータ、体温、活動の健全な日々のリズムは、生理的な恒常性と全体的な健康を維持するために重要です。また、SCI34以降の体温調節障害を示す昼周期の体核温度の変化も示唆しています。脊髄損傷が全身症候群であることはよく知られています。したがって、テレメトリに基づくアウトカムを取り入れることで、通常は単独で評価されるSCI回復を超えた包括的な活動データを収集できます。
しかし、この技術には考慮すべきいくつかの限界があります。降行大動脈にテレメトリックプローブを設置するのは複雑な処置であり、顕微外科の専門知識が必要です。インプラントは、脊髄損傷ラットの膀胱発現時の取り扱いの誤り、感染症、組織の刺激、内部血栓形成など、さまざまな理由で後から外れることがあります。これらの症状が起こると心血管記録に影響が出ます。データは除外すべきです。さらに、ラットが適切に回復しなければ、ベースライン心血管データが損なわれる可能性があります。テレメトリックセットアップやインプラントは高価であり、データ取得には専門的なソフトウェアや機器が必要です。重度の脊髄損傷は死亡率の増加につながる可能性があります。したがって、研究全体の統計的力を維持するためには、動物数の慎重な計画が必要です。
全体として、急性期および慢性期にわたるSCI後のテレメトリーを用いて心血管機能障害、体幹温度、活動を評価することは、損傷が心血管健康や全体的なウェルビーイングに与える影響を理解し、潜在的な介入策を設計する上で極めて重要です。
著者たちは何も明かすことはありません。
本論文はR01 NS116068、クレイグ・H・ニールセン財団のサカロイ基金(CHNF 1341200)、およびケンタッキー大学中枢神経系統代謝(CNS-Met)COBRE(P20 GM148326)によって可能となりました。実験動物資源局(DLAR)のご支援とご協力に感謝いたします。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 斜めの鉗子 | デュモン・サージカルズ、スイス | S&T 00571 | テレメトリック手術 |
| 吸収性縫合糸(5-0)、モノフィラメント | Covidien LLC、アメリカ | UM-213 | 遠隔測定およびT3手術 |
| アクトリル冷殺菌剤 | Minntech腎システム、アメリカ | 品名/注意記 78270-000 | テレメトリック手術 |
| 人工涙液 | ヘンリー・シャイン(アメリカ) | NDC 11695-6832-1 | 遠隔測定およびT3手術 |
| ブプレノルフィン | ホスピラ社、アメリカ | 0409-2012-32 | 遠隔測定およびT3手術 |
| コットンチップアプリケーター | VWR北米、アメリカ | 89031-272 | 遠隔測定およびT3手術 |
| キュレット | ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ、アメリカ | 503753 | T3手術 |
| 電子カラー | ヘンリー」フレッシュ&ヘルシーペットフード、アメリカ | RC404 VS- ミディアム | テレメトリック手術 |
| 電気シェーバー | アメリカ・レミントン | HC-5855 | 遠隔測定およびT3手術 |
| エンロフロキサシン | ノーブルック・ラボラトリーズ・リミテッド、英国 | 555529-154-01 | 遠隔測定およびT3手術 |
| フィッシュ(マイクロアドソン)鉗子 | F.S.T、ドイツ | 11006-12 | 遠隔測定およびT3手術 |
| ゲージスポンジ | デュカル社、アメリカ合衆国 | DUK4162 | 遠隔測定およびT3手術 |
| ヘモソル洗剤 | ヘモソル・インターナショナル、アメリカ | 026-050 | テレメトリック手術 |
| ホールジー・ニードルホルダー | F.S.T、ドイツ | 12500-12 | 遠隔測定およびT3手術 |
| ヒートパッド | サンビーム、アメリカ | PN126985-L | 遠隔測定およびT3手術 |
| 過酸化水素(3%) | メドライン・インダストリーズ社、アメリカ合衆国 | MDS098001ZCT | 遠隔測定およびT3手術 |
| インフィニット・ホライゾン、IH | 精密システム・計装、アメリカ | IH-0400 | T3手術 |
| イソフルラン | アニマルヘルス・インターナショナル社、アメリカ | 78949580 | テレメトリック手術 |
| ケタミン | コヴェトルス、アメリカ合衆国 | 80524 | T3手術 |
| マグネット | データサイエンス・インターナショナル社、アメリカ合衆国 | 該当なし | テレメトリック手術 |
| メロキシカム | デクラ獣医製品、アメリカ | 17033-051-20 | 遠隔測定およびT3手術 |
| マイクロディスセクティックピンセット | ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ、スイス | 504515 | テレメトリック手術 |
| ミラー仕上げのピンセット | デュモン・サージカルズ、スイス | 11251-23 | テレメトリック手術 |
| マッスルリトラクター(大きい;1) | F.S.T、ドイツ | 17007-08 | テレメトリック手術 |
| マッスルリトラクター(小型、2件) | ウェクスラー外科、アメリカ | TL0086.1 | T3手術 |
| 針、21G(刺すために曲げる) | BD 精密グライドニードル、ベクトン・ディキンソン社、アメリカ | 5296673 | テレメトリック手術 |
| 非吸収性縫合糸(4-0) ポリプロピレン縫合 | DEMETECHコーポレーション、アメリカ | PM194013F13M | テレメトリック手術 |
| 閉塞糸(シルク) | クローバーニードルクラフト株式会社、日本 | 96 | テレメトリック手術 |
| ポネマ・ソフトウェア | データサイエンス・インターナショナル社、アメリカ合衆国 | 該当なし | テレメトリック手術 |
| ポビドン - ヨウ素(ベタジン)(5%) | アヴリオヘルス、アメリカ | 304968-08 | 遠隔測定およびT3手術 |
| 印刷と印章 | グラッド、アメリカ | CLO70441 | 遠隔測定およびT3手術 |
| レーゲルキット | データサイエンス・インターナショナル社、アメリカ合衆国 | 276-0038-001 | テレメトリック手術 |
| メスハンドル | F.S.T、ドイツ | 91003-12 | 遠隔測定およびT3手術 |
| ハサミ(小さい、細い) | F.S.T、ドイツ | 14959-11 | 遠隔測定およびT3手術 |
| 塩化ナトリウム(0.9%) | ベチベックス、アメリカ | 17033-492-50 | テレメトリック手術 |
| ソムノフロ | ケント・サイエンティフィック社、アメリカ合衆国 | SF-01 | テレメトリック手術 |
| ステイプルズ | ファインサイエンスツールズ、アメリカ | 12022-09 | T3手術 |
| 滅菌アルコール準備パッド | デュカル社、アメリカ合衆国 | 65517-0002-1 | 遠隔測定およびT3手術 |
| 滅菌手袋 | マッケッソン、アメリカ | 20-1065N | 遠隔測定およびT3手術 |
| 滅菌タオルドレープ(18インチ)X26インチ) | ダイナレックス・コーポレーション、アメリカ | DYA4410 | 遠隔測定およびT3手術 |
| パッド下の手術(17インチ)X24") | デュカル社、アメリカ合衆国 | 22-415-758 | 遠隔測定およびT3手術 |
| サージカルブレード(11号) | インテグラ・ライフサイエンス・プロダクション株式会社、日本 | 2029-03--01 | 遠隔測定およびT3手術 |
| テレメトリックHD-S10インプラント | データサイエンス・インターナショナル社(米国) | 270-0180-001X | テレメトリック手術 |
| トランジスタ | データサイエンス・インターナショナル社、アメリカ合衆国 | 該当なし | テレメトリック手術 |
| トリプル抗生物質クリーム | コゼット・ファーマシューティカルズ社、アメリカ合衆国 | 29-62231 CPLNC1 | テレメトリック手術 |
| 静脈ピック | サイ注入技術、インド | VP-10 | テレメトリック手術 |
| 退役軍人保証 | 3Mアニマルケアプロダクツ、アメリカ | 34-8720-6521-3 | テレメトリック手術 |
| 給湯ポンプ | C2Dx TP700 T | CESS-95009-00 | 遠隔測定およびT3手術 |
| キシラジン | コヴェトルス(アメリカ)およびnbsp; | 61035 | T3手術 |