CAR T細胞におけるCRISPR-Cas9スクリーニングの改良:ライブラリー調製のための洗練された方法

サマリー

原発CAR T細胞に対して最適化されたCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニングプロトコルを開発しました。酵素による消化やsgRNAカセットプルダウンによるgDNAのキャリーオーバーを減らすことで、このアプローチはPCRアーティファクトを最小限に抑え、正確なsgRNA検出と機能的遺伝子標的の堅牢な同定を実現します。

要約

キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、いくつかの血液悪性腫瘍で顕著な有効性を示してきましたが、その成功は固形腫瘍では完全に再現されていません。さらに、血液がんにおいても、CAR T細胞注入後の再発は長期的な転帰を妨げ続けています。これらの課題は、CAR T細胞の有効性、持続性、腫瘍および微小環境介在性耐性の克服を強化する戦略の開発の緊急性を強調しています。クラスター状の規則的間隔短回文リピート(CRISPR)-Cas9ベースのスクリーニングプラットフォームは、CAR T細胞機能を調節する遺伝子を体系的に同定する強力なアプローチを提供します。遺伝的撹乱と表現型の結果を結びつけることで、これらのアッセイは活性化、増殖、記憶形成、細胞毒性を制御する経路の発見を可能にします。標準的なワークフローには、単一のガイドRNA(sgRNA)ライブラリーによる多数の細胞のトランスダクション、Cas9媒介による編集、編集細胞の選定、そしてシーケンス前のゲノムDNA(gDNA)からのsgRNAカセットのPCR増幅が含まれます。しかし、大量のgDNAを用いたPCR増幅は大きな課題を伴い、しばしばsgRNAを選択的に増幅・回収できないことがあります。ここでは、一次ヒトCAR T細胞で検証した最適化されたCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニングプロトコルについて説明します。この手法では、sgRNAライブラリーの調製中に、酵素による消化とsgRNAカセットの選択的プルダウンを通じてgDNAのキャリーオーバーを減らす中間工程が組み込まれており、これにより最初のPCR増幅の効率が向上します。この改良により、従来の1段階および2段階のPCR増幅プロトコルでは得られなかったCAR T細胞スクリーニングを通じてsgRNA情報を取得できるようになりました。結論として、この最適化されたワークフローは、難しいサンプルにおけるCRISPRスクリーニングライブラリの準備を促進し、治療効果向上のために標的化できる主要な遺伝的決定因子の特定を可能にします。

概要

免疫療法はがん治療に革命をもたらし、免疫システムを活用し調節する新しい戦略を提供しています。その中でも、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、最も革新的なアプローチの一つとして浮上しています。この治療は、患者のT細胞を 生体外 で遺伝子工学的に合成受容体で特定腫瘍抗原を認識し、抗腫瘍活性を高めることを含みます^。CAR T細胞は血液悪性腫瘍において顕著な成功を示しており、CD19またはBCMA標的治療を受けた患者では、短期間の寛解から無病症生存期間の長期化まで幅広く、毒性は最小限に抑えられています^2。これまでにFDAは血液がんに対して7種類のCAR T細胞製品を承認^{しています。}これらの進歩にもかかわらず、依然として大きな制約が残っています。課題はCAR T細胞製品自体に生じており、製造過程や患者のT細胞の適応度、疾患の進行、既回治療、加齢によって影響を受けることが多いです。抗原のダウンレギュレーションなどの腫瘍内因性耐性機構も有効性を損なう^{可能性があります。}さらに、免疫抑制性腫瘍微小環境は、特に固形腫瘍患者においてCAR T細胞の持続性と機能を著しく制限する追加の障壁^{となります。}したがって、CAR T細胞療法の初期および長期的な有効性を高めることが緊急に求められています。

CRISPR-Cas9遺伝子編集の登場により、大規模なスクリーニング手法を通じて遺伝子機能を解析する強力なツールが提供されました。これらのアッセイでは、細胞に単一ガイドRNA(sgRNA)ライブラリーが導入され、通常はレンチウイルスベクターによって送達され、1細胞あたり1つのsgRNAと安定したゲノム統合が保証されます。Cas9を媒介した編集と遺伝子質質細胞の選定後、ゲノムDNA(gDNA)が抽出され、sgRNAカセットはPCRで増幅されてライブラリー調製されます。ハイスループットシーケンシングにより、異なる表現型にわたるsgRNA分布の定量化が可能となり、研究⁶の過程を正または負の遺伝子で制御する遺伝子を特定します。

CRISPRスクリーニングはT細胞生物学の探究に広く応用されており、近年ではCAR T細胞の性能向上にも応用されています。ゲノムワイドスクリーニングにより、活性化、増殖、分化を含む基本的なT細胞プロセスの調節因子が特定されました。例えば、FAM49BはT細胞受容体^シグナル伝達7の調節因子として同定され、SOCS1、TCEB2、RASA2、CBLBは刺激8後の増殖に必須であることが示^{されました。}これらの主要経路に加え、CRISPRスクリーニングはT細胞の記憶や枯渇に関与する遺伝子も解明しました。 in vivo 研究では、Fli1が記憶や疲労前駆体を妨げずにエフェクター応答を強化する候補として特定されました。⁹、クロマチンリモデラーArid1aはT細胞の消耗を減少させる調節因子として認められました^。Tヘルパータイプ2(Th2)分化の調節因子もこのアプローチで特徴付けられています¹¹。25種類のキナーゼを標的としたカスタムsgRNAライブラリーを用いると、p38は拡張、記憶形成、酸化ストレスおよびゲノムストレスからの保護を促進することが明らかになりました¹²。同様に、CD8⁺ T細胞におけるREGNASE-1ノックアウトは、メラノーマおよび白血病モデルにおける腫瘍制御を改善する長寿命のエフェクター表現型を付与しました¹³。さらにゲノムワイドスクリーニングにより、Dhx37がT細胞活性化および細胞傷害の調節因子として特定されました¹⁴、LTBRや他の遺伝子はCAR Tおよびγδ T細胞におけるT細胞機能の増強因子として検証されました¹⁵。近年では、CRISPRスクリーニングが直接CAR T細胞に適用され、プロリン代謝に関与しCAR T抗^{腫瘍活性を高める}酵素PRODH2や、不活化によって膠芽腫モデルでCAR Tの有効性が向上したTLE4およびIKZF2などの新規標的が明らかになりました¹⁷。

CRISPRスクリーニングにおける重要なステップは、非常に大量のgDNAからsgRNAカセットを選択的に増幅することです。これはCRISPRスクリーニングで使用される細胞数が非常に多いため回避が困難な課題です。大量のDNAキャリーオーバーによるPCR増幅には、DNAおよびポリメラーゼ分子の物理的拡散を制限する分子の混み込み、プライマーやポリメラーゼがDNA背景に一時的に非特異的結合すること、プライマーの除去によるオフターゲット増幅、DNAリン酸骨格によるMg²⁺隔離など、^{いくつかの技術的課題}があります^{。19、20、21}。これらはしばしばPCR不全やバイアスを引き起こします。これらの問題を軽減するために、アダプター付加からsgRNA増幅を2つのPCR^{ステップに}分離する、ビオチン化オリゴと磁気ビーズキャプチャ^23,24による標的濃縮、またはsgRNAカセットの両側に制限部位を配置して断片濃縮を行うプラズミド設計など、さまざまな戦略が提案^{されています。}

本研究では、一次ヒトCAR T細胞に対する最適化されたCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニングプロトコルを提示します。使用されているCRISPRライブラリーはBrunello Kinome 1で、3052個のユニークな20nt長sgRNAを含み、763個のヒトキナーゼ遺伝子(ターゲットあたり4個のsgRNA)を標的としています。T細胞は、健康なドナーの末梢血単核球(PBMC)が豊富に含まれた血液サンプルからCD4⁺ およびCD8⁺ 磁気陽性選択によって単離されました。抗CD3および抗CD28で活性化された後、T細胞はCRISPRスクリーニングライブラリーでスピンフェクし、その後CARレンチウイルスでトランスデューションされました。細胞を増殖させ、その後核誘導してCas9タンパク質を導入しました。CRISPR保有細胞はプロマイシンで選択され、CAR陽性T細胞は選別されました。抽出後、ゲノムDNAは制限酵素(RE)で消化され、sgRNAを含む断片はビオチンプローブ・ストレプタビジンキャプチャによって抽出されました。次に、sgRNAを選択的に増幅し、2回連続したPCRでインデックスし、得られたライブラリをシーケンスしました。gDNAのキャリーオーバーを減らす中間ステップを取り入れることで、目的のsgRNAを選択的に回収・増幅することができ、これによりCAR T細胞におけるキナーゼの役割を研究できるようになりました。

プロトコル

このプロトコルはナバラ大学のガイドラインに従って実施されました。すべての被験者が書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. T細胞の単離と活性化

1. PBMCのアイソレーション
   1. エチレンジアミネテトラ乙酸(EDTA)チューブでドナーから血液サンプルを採取し、50mLの円錐形チューブに血液サンプルを移し、PBS(希釈1:1)で血液を希釈します。
   2. 50mLの円錐形チューブの底部に15 mLの密度勾配培地を加えます(PBMCの密度:1.07)。次に、密度勾配培地層(ピペットコントローラーの最も遅い速度)に希釈した血液25mLを慎重に加えます。ブレーキなしで800× g で30分間遠心分離機を使いました。
   3. PBMCSのリング/層をパスツールピペットで50mLの円錐形チューブに採取し、PBSを合計50mLに加えて洗浄します。遠心分離機で650 × g で8分間加熱します。上清液は捨てる。
      注意:上清液の濁度を確認し、細胞がないか確認してください。迷う場合は、懸濁液を元の50 mL円錐管の2倍に分け、PBSを50 mLまで加え、再び遠心分離します。
   4. PBSを50mLに再懸濁します。細胞計数器でアクリジンオレンジ-ヨウ化プロピジウムヨウ化物(AOPI)を用いてカウントします。遠心分離機で650× g で8分間加熱します。
2. CD4およびCD8磁気選択
   1. 蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを準備します:PBS、EDTA 2.5 μM、BSA 0.5%、そして0.2 μmのフィルターを通します。
   2. PBMCを10×^10個6 細胞ごとに無菌のFACSバッファー80 μLに再懸浮させ、10 μLのマイクロビーズCD4および10 μLのマイクロビーズCD8を10 ×^{10 6} 細胞ごとに加えます。4°Cで20分間培養します。
   3. FACSバッファー10mLを加え、遠心分離機で650 × gで8分間加熱します。上澄液を完全に捨ててください。
   4. 15 mLの円錐形チューブ内に、FACSバッファー10 ×^{8細胞あたり} 500 μLを再懸濁します。
      注意:1つの配線は200 x 10⁶ セルを収容可能です。
   5. AutoMac(高速磁気セル選別機)の隔離には Possel プログラムを使います。
   6. PBSを最大10mLに加え、蛍光セルカウンターでAOPIを数え、650 × g で遠心分離機で8分間投与します。
   7. 細胞を1×10⁶/mLを、3%のヒト血清(HS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、625 IU/mLのインターロイキン(IL)-7、85 IU/mL IL-15を含むT細胞増殖培地に再懸濁します。1 mLあたり10 μLのT細胞刺激試薬を加え、よく混ぜます。24ウェルプレート(p24w)に1ウェルあたり2mLをプレートし、37°Cで24時間培養します。

2. CAR T細胞の産生とCRISPRスクリーニング

1. ライブラリ感染とCARトランスダクション
   1. 対応するレンチウイルスのCRISPRライブラリ(例:Brunello Kinome 1ライブラリ)を加えます。補 足表1を参照)、滴定アッセイで決定し、ポリブレレン8μg/mLを測定しました。
   2. 700 x g で遠心分離し、32°Cで1時間30分感染します。
   3. 培地を3%のHS、1%のP/S、625 IU/mL IL-7、85 IU/mL IL-15(最終[細胞]=10⁶ cells/mL)を含む新鮮なT細胞増殖培地に置き換えます。
   4. 6時間後に、感染倍数(MOI)3に対応するCARレンチウイルスベクターを追加し、4日間インキュベートします。
2. Cas 9電気穿孔
   1. CAR T細胞を採取し、PBSで一度洗浄し、蛍光細胞カウンターでAOPIを数えます。
   2. 4μM Cas9を電気穿孔バッファーで準備します。
   3. CAR T細胞を50μLで5個、10個^×6細胞に再懸濁します。マルチウェルキューベットストリップの各ウェルに50μLのセル懸濁液を慎重に混ぜ、気泡を形成しないまま加えます。その後、ピペットの先端を使って気泡を取り除き、先端をウェルの縁に沿って滑らせます。
      注意:キュベット内の井戸にサンプルがない場合は、同じ量の電気穿孔バッファーを追加してください。これは重要なステップです。機械が気泡や体積の差を検出するとエラーを出します。
   4. プログラム「 EXPAND T CELL 3 」を使ってCAR T細胞を核認証してください。
   5. 細胞はキュベットの中に37°Cのインキュベーターで40分間置いてください。
   6. 核形成された細胞を、3%のHS、1%のP/S、625 IU/mL IL-7、85 IU/mL IL-15(最終[細胞]=10⁶ cells/mL)を含むT細胞培養培地に再懸浮させ、37°Cで3日間インキュベートします。
3. プロマイシン選択
   1. 蛍光細胞計数器でAOPIを使ったカウントをします。
   2. IL7およびIL15を含むT細胞培養培地を用いて、1×10⁶ 細胞/mLに調整します。
   3. 培地にプロマイシン(2.5 μg/mL)を加えます。
   4. 細胞数を2日ごとに6日間数え、細胞培養培地を3%のHS、1%のP/S、625 IU/mL IL-7、85 IU/mL IL-15、2.5 μg/mL プロマイシンを含む1×10⁶ Cells/mLに調整します。
   5. %のCAR(車率)を確認してください。
4. CAR T細胞の集団を選別し、サンプル(乾燥細胞ペレット)を-80°Cで保存します。

3. gDNAの単離

注意:プロセス全体で細胞やgDNAの損失は避けてください。これはsgRNAの表現性を損なう恐れがあります。sgRNAカバレッジは少なくとも500倍を目指してください。

1. 細胞および組織DNA抽出キットを使ってサンプルからgDNAを抽出します。gDNA回収を最大化するために2回の洗脱を行ってください。
   注意:gDNAをより効率的に回収するために、1カラムあたり4×10個の⁶ 細胞以上は使用しないでください。
2. dsDNA定量キットでgDNA濃度を測定してください。
   注意:プロトコルの後段階で濃度が低すぎる場合は、固体相可逆固定化(SPRI)ビーズベースのクリーンアップ試薬を使用してDNAを濃縮してください。

4. sgRNAカセットの濃縮(およびgDNAキャリーオーバーの除去)

1. 制限酵素の消化
   1. 最大5μgのgDNAを20 U/s酵素(例: ブルネロ・キノメ1ライブラリのlentiGuide-puro骨格ではNdeIとPspXIの組み合わせを使用)を総体積50 μLで消化します。望ましいsgRNA表現性を達成するために反応数を増やします。
      注意:カセットの両側領域で切断する制限酵素を選択してください。ただし、一部のsgRNAには制限部位が含まれている可能性があることに注意してください。これらのsgRNAはこの段階で失われ、シーケンスには現れません。このガイドがない場合、消化のコントロールが行われます。 補足表1 は、PspXIおよびNdeIによって切断されたKinome 1 sgRNAのリストを示しています。
   2. 37°Cの温度で一晩、サーモサイクラーで孵育します。
   3. SPRIを2回クリーンアップしてください。
      1. 10mLのエリュションバッファー(EB)(10 mM Tris-HCl、pH 8.0)と50mLの新鮮な70%エタノールを準備します。
      2. ビーズを旋渦に巻き込み、消化生成物に100μLを加えます。
      3. ピペッティングでよく混ぜて5分間孵化します。さらに5分間磁化してください。
      4. 磁石の上でペレットを乱さずに70%エタノールを200μL加えます。30秒待ってから、上澄液を捨てます。
      5. ステップ4.1.3.3を繰り返し、合計2回のウォッシュを行います。ビーズを2分間乾かします。
      6. 磁石から外し、40μLの洗脱バッファを加え、ピペッティングでビーズを再懸浮させます。2分間孵化します。
      7. 2分間磁化してから、上澄液を新しいチューブに移します。
         注意:このプロトコルを初めて設定する際は、(毛細血管)電気泳動による消化を確認してください。塗抹検査が行われていることを確認しましょう。
2. sgRNAカセットのプルダウン。
   1. ストレプタビジン磁性ビーズの調製。
      1. 洗浄/結合バッファーを2回準備します:10 mM Tris-HCl pH 7.5、2 M NaCl、1 mM EDTA。体積の半分を_H2Oから1xに薄めます。
      2. ビーズを1分間渦巻きます。
      3. 必要な量のビーズをチューブに移し(通常1mgで十分)、同じ量のウォッシュ/バインディングバッファーを1回、または少なくとも1 mLを加えて再懸濁します。
      4. チューブを磁石に1分間当てて、上澄液を捨てます。
      5. チューブを磁石から外し、洗浄済みビーズをバイアルから採取したビーズの初回量と同じ量の1倍のウォッシュ/バインディングバッファーに再懸浮させます。
      6. これを合計3回洗うまで繰り返します。
      7. ビーズを2倍のウォッシュ/バインディングバッファーで再懸垂します。
   2. 表1に記載された10μMプルダウンプライマー5μLを、ステップ4.1.3.6の精製消化に加えます。
   3. 96°Cのドライバスで5分間孵育し、すぐに氷に5分かけます。
   4. 洗浄されたストレプタビジン磁気ビーズを1mg加えます。
      注:ビオチン-ストレプタビジン結合は1 M NaClで最も効果的です。ビーズとビオチニル化DNAを等量混ぜるようにしてください。
   5. 20分間孵化させ、4分ごとに混合液を再懸浮させます。
   6. 5分間磁化してください。
   7. ビーズは1×ウォッシュ/バインディングバッファーで3回洗います。
   8. ビーズをEB 8.0の50μLに再懸浮させます。
      注:ここで使用されているsgRNAカセットはストレプタビジンビーズに結合されています。捨てないでください。

5. sgRNAライブラリーの調製

1. PCR1
   1. PCR1ミックスを、表1に記載した20μLのHerculase 5xバッファー、1μLのdNTP(100mM)、1μLのDNAポリメラーゼ、表 1に記載した10μMのPCR1順方向および逆方向プライマー2.5μL、およびPCRグレードの水23μLを組み合わせて準備します。ピペットで混合し、ステップ4.2.8のPCR1ミックスをビーズに加えます。
      注: 表1は Brunello Kinome Library 1向けに設計されたPCR1プライマーを示しています。
   2. チューブをサーモサイクラーに入れ、 表2に記載されたPCR1のプログラムを実行します。
      注意:熱サイクラーが100μLの反応を受け入れられることを確認してください。それ以外の場合は、50μLの反応で分割します。必要に応じてスケールを調整してください。
   3. 同じサンプルからすべてのPCR1を1本のチューブにまとめます。
   4. SPRIクリーンアップPCR1は150μL(1.5倍)のビーズを使用します(手順4.1.3.3-4.1.3.7)。各PCR反応をEB 8.0の100μLに再懸濁します。
      注意:このプロトコルを初めて設定する場合は、30サイクルPCR産物2μLをキャピラリー電気泳動システム(例:AgilentのTapeStation Systems)で走査して、PCR産物のサイズと品質を確認してください。
2. PCR2
   1. PCR1の生成物10 μL、5Xバッファー10 μL、dNTP 0.5 μL(100 mM)、DNAポリメラーゼ1 μL、表 1 に記載された10 μM PCR2プライマー1.25 μL(各サンプルごとに異なるrP7-i7-BCおよびP5-i5-BCの組み合わせを使用)、およびPCRグレードの水26 μLを組み合わせてPCR2ミックスを準備し、合計50 μLとなります。
      注:ライブラリ表現を維持するために、ライブラリ内の⁴ 構成要素ごとに1回のPCR2反応を行います。
   2. チューブを熱サイクラーに入れ、 表2に記載されたPCR2のプログラムを実行します。
   3. 75μL(1.5倍)のビーズを用いてSPRIのPCR2クリーンアップ(手順4.1.3.3-4.1.3.7に従う)。各PCR反応をEB 8.0の50μLに再懸濁します。
3. dsDNA定量キットを用いてPCR2(すな わちsgRNAライブラリー)を定量し、毛細管電気泳動(例:TapeStation Systems)でアンプリコンサイズを検証します。サンプルをまとめろ。
4. イルミナ機器のシーケンス。
   注:こちらの3052 sgRNA Brunello Kinome 1ライブラリでは、サンプルあたり1億〜2億リードのシーケンス深さで通常十分です。

6. 分析

1. bcl2fastqを使ってサンプルをデマルチプレックスします。
2. FastQCで生成されたfastqファイルの品質を確認してください。
3. sgRNAの配列をパターンとして、sgRNAの両側に並ぶカセット配列とガイドの長さ(20 nt)を抽出します。
4. Bowtie2を使って抽出した配列をライブラリの参照にアラインメントし、仮想のガイドのうちどれだけがライブラリの本物のsgRNAかを確認します。samtoolsを使って、アラインメントに関する情報を含むSAMファイルをBAM形式に変換し、要約ファイルを生成します。
5. 編集済みおよび対照サンプルの各sgRNAのリード数をMAGecKソフトウェアのカウント機能で数え、正規化します。
6. カウントをMAGecKの検査関数と比較することで、RRAスコアと候補遺伝子のリストが得られます。

結果

プロトコルセクションで説明したように、CAR T細胞は確立されたプロトコル²⁶に従って生成されました。CRISPRスクリーニングには、Wangらが開発したワークフローを適応させました。¹⁷ (図1A)。簡単に言えば、2人の独立したドナーからのT細胞を単離・活性化し、CRISPR sgRNAライブラリーとCARレンチウイルスベクターの両方で連続してトランスダクションを行い、5日目に67%および72%のCAR陽性細胞に達しました。細胞の一部はCas9タンパク質でノックアウト誘導のために核系化され、残りの細胞はsgRNA表現の基準として機能しました。抗生物質で誘導された細胞は選別され、その後、研究対象の表現型に応じて異なる集団が分類されました。CAR T細胞の増殖は、AOPIに基づく細胞数を用いてスクリーニング全体で監視し、フォールド変化として表しました(図1B)。8日目、10日目、12日目にプロマイシン補給後、CRISPRライブラリーを用いたCAR T細胞の両ドナーで成功裏に増殖が確認され、生存と増殖の継続が認められました。抗生物質選択の対照として、CRISPRライブラリのトランスダクションを欠く未転動T細胞(UTD)およびCAR T細胞を用いた。

ゲノムDNA抽出後、PCR増幅によってsgRNAライブラリーが製作されました。過剰なgDNA運搬による問題を克服するため、制限酵素消化とsgRNAカセットのビオチン-ストレプタビジンプルダウンを組み合わせたプロトコルを導入しました(図2A,B)。gDNAはsgRNAカセットの両側にある制限酵素NdeIおよびPspXI標的部位で消化されました(図2C)。PCR1プライマーのアニーリング部位の上流に結合するよう設計されたビオチニル化オリゴが、sgRNAカセット断片を捕捉するために用いられ、その後ストレプタビジンビーズで引き下ろしてキャリーオーバーgDNAを除去しました。sgRNAを含む断片は選択的に増幅され(図2D)、連続した2回のPCRでインデックス化されました。

各サンプルのライブラリは次世代シーケンシング(NGS)を用いてシーケンスされました。デマルチプレックス、品質管理、sgRNA同定の後、MAGeCKパイプラインでデータを解析しました。まず、カウントコマンドにより対照(基底)およびCas9編集サンプルのsgRNAを定量・正規化しました(図3A,B)。ピアソンおよびスピアマン相関は、実験中(ドナーgDNA)のsgRNAの表現性がプラスミドライブラリーと比較して維持されたことを示しています(図3C)。次に、テストコマンドは両方の条件を比較し、各遺伝子にロバストランク集約(RRA)スコアを割り当てました(図3D)。有意に濃縮または枯渇した遺伝子は、p < 0.05およびログフォールド変化(LFC)>0.5の閾値を用いて同定されました(図3E)。最後に、Metascapeを用いて候補遺伝子の経路豊富解析を行い、同定された調節因子に関連する主要な遺伝子オントロジー用語を明らかにしました(図3F)。

図1:CAR T細胞におけるCRISPRスクリーニング。 (A) CAR T細胞におけるCRISPRスクリーニングのスキーム。(B)プロマイシン(P)を用いた遺伝子転起細胞の選択。プラズミドライブラリーには、正の選択のためのプロマイシン耐性遺伝子が含まれています。抗生物質は、未遺伝子質(UTD)およびCAR T細胞およびCAR T細胞の非遺伝子型サンプルの8日目に培地に追加されました。増殖抑制のために、プロマイシンを含まないサンプルが使用されました。2人の独立したドナーからのデータが示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:sgRNA濃縮解析のためのライブラリー調製。 (A) ライブラリ作成のためのプロトコルのスキーム。(B) 制限酵素(はさみ)およびPCR1プライマー(矢印)およびビオチニル化プライマー(緑の点付き矢印)の切断面積の相対的な局所配置。(C) RE消化前後のgDNAの電気泳動。(D) PCR1後のsgRNAカセットの選択的濃縮。基底およびCas9サンプルから2人の独立したドナーから得た2つの表現型データが示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:MAGeCKを用いたガイド濃縮解析。 (A) MAGeCKカウント関数の出力の要約。(B) 読み取りカウントの分布。(C) ドナーgDNAとプラスミドライブラリーカウントの相関に関するピアソンおよびスピアマン係数。(D) 修正ロバストランキング集約(RRAスコア)による潜在的に濃縮・枯渇した遺伝子。(E) 有意な遺伝子(p値<0.05、LFC >0.5)を示す火山プロットが赤色で示されています。(F) 富集された有意遺伝子のMetascape経路解析後のトップ遺伝子オントロジー(GO)用語。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:プライマーの配列。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:PCR条件。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表1:Kinome 1ライブラリのsgRNAおよびNdeIおよびPspXIによる消化過程で失われたsgRNAの一覧。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

CRISPRスクリーニングは単一ガイド摂動の原理に基づいており、1細胞あたり1つのsgRNAのみを統合する必要があります。これを実現するため、sgRNAは通常レンチウイルスベクターを介して送達され、感染の多重性(MOI)を慎重に制御する必要があります。CAのMOI(情報提供委員会 )です。 0.3が一般的に推奨されており、細胞の25%から30%が単一の^{ウイルス粒子6}で伝達されます。したがって、正確な滴定は必要なウイルス粒子の体積を決定するために不可欠です。もう一つの重要なステップは、プロトコル中にsgRNAのカバレッジが失われることです。収穫時の細胞損失、gDNA抽出時の非効率(すなわちカラム過負荷やDNAの不完全な洗脱)、PCR増幅時の過剰なテンプレートなどがこの損失に寄与し、結果としてsgRNA解析の偏りが生じます。ビオチニル化オリゴについては、合成に使われる遊離ビオチンがストレプタビジンビーズに飽和しないように、HPLCで精製するのが最適です。さらに、後続PCRにおけるビオチニル化プライマーの増幅を防ぐために、3'アミノ修飾剤の使用が強く推奨されています。また、これらのオリゴを設計する際は、増幅中の競合を防ぐためにPCR1プライマーとの重複を避けるようにしてください。さらに、バイオインフォマティクス解析には注意が必要です。sgRNA抽出パターンはプラスミド骨格(例:lentiGuide-puroやlentiCRISPR v2)に依存し、アラインメントの厳密さは正確なマッチングからミスマッチの許容範囲まで幅があります。さらに、このプロトコルには消化ステップが含まれているため、制限部位を含む一部のsgRNAが失われることがあり、参照ライブラリの調整が必要となります。

本研究では、sgRNA含有断片を消化およびより重要なプルダウンステップを通じて濃縮する最適化されたCRISPRスクリーニングライブラリー製剤プロトコルを提案します。制限酵素消化は、gDNA入力を減らしsgRNAカセットを濃縮する戦略として以前から提案^{されています。}同様に、ビオチニル化プローブは分子生物学において特定の核酸やタンパク質-核酸複合体28,29,30,31を捕捉するために広く応用されています。

当プロトコルはこれらの原則を基に、一次CAR T細胞におけるCRISPRスクリーニングに適応していますが、いくつかの制限を認めておく必要があります。第一に、一次CAR T細胞は増殖能力が限られているため、スクリーニングスケールに制約を課します。十分なカバレッジとsgRNAの表現を維持するためには、多数の初期細胞が必要です。それが不可能な場合は、より小さなカスタムライブラリ¹²を使うこともありますが、これにより遺伝的調査の範囲は狭まります。生物学的変動性もまた課題です。ドナー間の差は予想されており、有意なヒットの重複はしばしば控えめ^です。第二に、濃縮戦略は制限酵素切断部位の存在と位置に依存します。まれに、これらの部位がsgRNA配列内に存在することもあり、冗長性が限られた小規模ライブラリではより問題となります。しかし、特にゲノムワイド設計の多くのライブラリは、ターゲットごとに複数のsgRNAを含み、ガイド損失の全体的な影響を最小限に抑えています。最後に、プローブキャプチャ²⁴と組み合わせた超音波処理などの代替的な断片ベースの濃縮戦略は、制限酵素消化が適さない場合に柔軟性を提供する可能性があります。

全体として、sgRNAカセットはCRISPR編集細胞内の全ゲノムDNAのごく一部に過ぎず、効率的な濃縮がライブラリの成功に不可欠です。標準プロトコルと比較して、最適化されたワークフローによりgDNAのキャリーオーバーが減り、目的のsgRNAのPCR増幅が有利です。gDNA断片化とビオチニル化プローブプルダウンをストレプタビジンビーズと組み合わせることは概念的に新しいものではありませんが、CRISPRスクリーニングへの統合により、一般的なPCRの落とし穴を回避し、CRISPRスクリーニングの再現性が高まります。さらに、各重要なステップ(選別後のT細胞純度、プロマイシン耐性細胞の割合、gDNA完全性、CARトランスダクション効率など)に標準化されたQC指標を組み込むことで、ワークフローの堅牢性と再現性がさらに高まります。結論として、一次CAR T細胞の文脈で開発され、ドナーは2人のみ(各ドナーから複数のサンプルが使用されたものの制限となる可能性があります)が、この最適化プロトコルは大きなgDNAキャリーオーバーを持つ他のCRISPRスクリーニングやNGSワークフローにも広く適用可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4200 テープステーション	アジレント	G2991A
アクリジンオレンジ	インビトロジェン	A1301
さらに、XP	ベックマン・カウルター	A63881
autoMACS NEOセパレーター	ミルテンイ	130-120-327	高速磁気セル選別機
ビオチニル化オリゴ	IDT
BSA	シグマ	A9647
セルロメーターK2蛍光細胞カウンター	リヴヴィティ	CMT-K2-MX-150	蛍光細胞カウンター
CHT4 計数室	リヴヴィティ	CHT4-SD100-002
CytoSinct CD4ナノビーズ	ジェンスクリプト	L00863-1
CytoSinct CD8ナノビーズ	ジェンスクリプト	L00864-1
dNTP	アジレント	200418-51
ダイナビーズ M-280 ストレプタヴィジン	インビトロジェン	11206D
DynaMag-2マグネット	インビトロジェン	12321D
EDTA 0.5 M pH 8.0	インビトロジェン	15575-038
エタノール	メルク	1,00,98,31,000
ExPERT ATX電気孔孔器	MaxCyte	ExPERT ATx
フィコル・パーク	シチバ	17544203
フィルトロプル S 0.2 & マイクロ;m	サーステット	83,18,26,001
GenCRISPR ウルトラNLS-Cas9-リサーチ	ジェンスクリプト	Z03621-1
ハーキュラーズバッファー5X	アジレント	600675-52	5倍バッファ
ハーキュラーズII融合酵素	アジレント	600679-51	DNAポリメラーゼ
IL-15	ミルテンイ	130-095-765
IL-7	ミルテンイ	130-095-362
マスターサイクラー X50a	エッペンドルフ	6313HG006059
MaxCyte電気穿孔バッファー	シチバ	EPB1
NdeI	ニューイングランド・バイオラボ	R0111L
ヌクレオスピン組織	マッシェレイ・ナーゲル	74,09,52,250
PBS	ギブコ	14190-094
ポリブレン	メルク	TR-1003-6
プライマー	サーモフィッシャー
プロピジウムヨウ素	シグマ	P4864
PspXI	ニューイングランド・バイオラボ	R0656S
プロマイシン	ギブコ	A11138-03
Qubit 3.0 フルオロメーター	インビトロジェン	Q33216
キュービットHS DNAアッセイ	インビトロジェン	Q32851
R-50x3無菌井戸処理アセンブリ	MaxCyte	LM243882
T細胞トランスアクトヒト	ミルテンイ	130-111-160	T細胞刺激試薬
テープステーションHSD1000	アジレント	5067-5585
テックスマックス	ミルテンイ	130-097-196	T細胞増殖培地
トリスバッファー、1.0 M、pH 8.0、分子生物学グレード	EMDミリポール	648314
分子生物学用に水、DNAase、RNAse、プロテアーゼフリー	サーモサイエンティフィック	327390010