Eupatorium lindleyanum DC由来のセスキテルペンラクトンの抗炎症効果。ローデントモデルズにて

サマリー

本研究は、 Eupatorium lindleyanum DC由来のセスキテルペンラクトンが存在していることを示しています。(SLEL)は、キシレン誘発のマウス耳浮腫およびカラギーナン誘発のラットポー浮腫モデルにおいて、組織病理学的損傷の緩和、サイトカイン放出の減少、NF-κBシグナル活性化の抑制により有意な抗炎症効果を発揮します。

要約

急性炎症は、多くの免疫関連疾患に関与する基本的な病理学的過程です。 ユーパトリウム・リンドレヤナム 伝統的な薬用ハーブであるDC.は、薬理学的活性を示すと報告されているセスキテルペンラクトン(SLEL)を豊富に含んでいます。しかし、それらの抗炎症効果およびそれに伴う分子変化については、まだ完全には解明されていません。本研究では、キシレン誘発マウス耳浮腫モデルとカラギーナン誘発ラットポー浮腫モデルで急性炎症反応を誘発しました。組織損傷および炎症浸潤はヘマトキシリンおよびエオシン染色で評価されました。ELISAによって血清中の炎症誘発サイトカイン(TNF-α、IL-6、IL-1β)のレベルが定量され、炎症組織における転写発現は定量PCR(qPCR)で解析されました。リン酸化されたIκBαやp65を含むNF-κB経路関連タンパク質の変化はウェスタンブロッティングで評価されました。SLEL治療は耳および足の浮腫を減少させ、組織浮腫、炎症性細胞浸潤、血管うっ血などの急性炎症の組織病理学的特徴を緩和しました。同時に、SLEL投与は Tnf-α、 Il-6、 Il-1βの血清レベルおよび組織mRNA発現の低下と関連していました。ウェスタンブロット解析では、SLEL治療後の炎症組織におけるIκBαおよびp65のリン酸化が減少し、NF-κB関連シグナル伝達イベントの調節を示しました。これらの発見は、急性炎症モデルにおけるSLELの抗炎症活性を評価する実験的ワークフローを示し、その効果が炎症性サイトカイン発現の減少およびNF-κB経路関連シグナル伝達の変化と関連していることを示唆しています。

概要

炎症は病原性の侵入や組織損傷によって引き起こされる複雑な防御反応であり、感染の抑制、有害な刺激の排除、組織修復の促進に重要な役割を果たします^。制御された炎症反応は組織の恒常性維持に不可欠ですが、過剰または持続的な炎症は組織損傷、臓器機能障害、慢性疾患の進行につながる可能性があります。臨床的には、炎症は赤み、腫れ、熱感、痛みを特徴とし、重症の場合は全身的な病理反応を引き起こすことがあります。炎症調節障害ががん、心血管疾患、自己免疫疾患の発症と関連していることが増え^{ています。}

非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)は現在、炎症管理に最も広く使われている薬剤です。症状緩和に効果があるにもかかわらず、長期使用は消化器系の刺激、過敏反応、肝毒性4などの副作用を伴う^{ことが多いため、}臨床的適用性が制限されます。その結果、安全性が向上した代替抗炎症薬の特定への関心が高まっています。伝統的なハーブ医薬品を含む天然成分は、免疫調節特性を持つ生物活性化合物の潜在的な供給源として探求されています。しかし、低毒性や全身的調節機能に関する一般的な主張は慎重に解釈され、定義された^{疾患モデルにおける}実験的検証が必要です。

ユーパトリウム・リンドレヤナム DC.は伝統的な薬用植物であり、特徴的な植物化学物質には主にグアイアノリド系およびエウデスマノリド系化合物であるセスキテルペンラクトン、さらにゲルマクラノリドやキサンタノ^リデスが含まれます。 Eupatorium lindleyanum DCの抽出物。さまざまな^{実験環境において}、脂質低下、抗動脈硬化、抗腫瘍、抗炎症活性を示すことが報告されています。特に、 Eupatorium lindleyanum DCのエタノール抽出物が注目されています。リポ多糖(LPS)誘発性急性肺損傷モデルで保護効果を示している⁷。しかし、SLELの抗炎症活性および古典的急性炎症モデルにおけるその効果は、依然として十分に解明されていません。

このギャップを埋めるために、私たちは2つの補完的な急性炎症モデルを用いました。マウスのキシレン誘発耳水腫は急速な神経原性および血管性炎症反応を捉え、ラットではカラギーナン誘発性の足浮腫という、サイトカイン産生と細胞浸潤を伴う時間依存的な急性炎症を反映する確立されたモデルです。LPS誘発全身炎症のような代替モデルは、局所的な組織浮腫よりも全身免疫活性化に重点を置き、組織レベルの組織学的および分子分析のペア解析に適している可能性が限定的だったため選ばれませんでした(⁸)。

この複合モデル戦略を用いて、炎症反応は定量的な浮腫測定、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色による組織病理学的評価、血清サイトカインプロファイリング、組織レベルの転写解析、NF-κB関連タンパク質変化を通じて評価されました。このプロトコルは、浮腫の形成、サイトカイン発現、経路に関連する分子表示が関心のある急性炎症における抗炎症活性のスクリーニングに特に適しています。それでも、急性モデルの限界、例えば慢性炎症状態への外挿や組織レベルのシグナル伝達変化からの因果関係推論における解釈の限界などが認識されるべきです。

本研究は、補完的な急性炎症モデルと組織学的および分子分析を組み合わせたプロトコル主導のアプローチを強調し、ハーブ由来化合物の抗炎症効果を評価するための再現可能な枠組みを提供します。

プロトコル

この動物研究プロトコルは重慶医科大学の施設動物ケア・利用委員会(IACUC-CQMU-2025-10073)によって承認されました。

セスキテルペンラクトン濃縮画(SLEL)の製製

Eupatorium lindleyanum DCの乾燥薬用物質。粉砕され、70%(v/v)エタノールを用いた低圧で2回の逆流抽出を受けました。各抽出は溶媒と材料の比率10:1(v/w)で2時間にわたり行われました。混合抽出物はろ過され、低圧≤60°Cで濃縮され、その後真空凍結乾燥されて粗エタノール抽出粉末を得ました。

乾燥抽出物は蒸留水に完全に溶解(最終濃度:100 mg/mL)し、ポリアミド樹脂クロマトグラフィーを順次受け、その後D101高孔質吸着樹脂クロマトグラフィーでセスキテルペンラクトンを濃縮しました。吸着平衡に達すると、D101樹脂は蒸留水で洗浄され極性不純物を除去し、その後無水エタノールで溶出されました。エタノール浸出後、収集された分画は低圧下で濃縮され、凍結乾燥でSLEL分画を生成し、使用まで−20°Cで保存されました。

分離はUPLCプラットフォーム上で行われ、アセトニトリルの二元移動相系と水中0.1%(v/v)の蟻酸を用いた。勾配プログラムは、低有機含有量での初期25分間の等置式保持、70%アセトニトリルまでの短い直線的なランプ、90%アセトニトリルでの高有機段階、そして開始条件に戻る最終平衡ステップで構成されていました。システムは0.25 mL·min⁻¹ で、カラム温度35°C、注入容積0.1 μLで運用されました(補足図S1)。

動物

本研究では合計36頭のオスSprague–Dawleyラット(200 ± 20 g)と36匹のオスBALB/cマウス(20 ± 2 g)が使用されました。動物は標準化された環境(22 ± 2°C、湿度55±5%、12時間の明暗サイクル)で飼育され、食料と水は自由に提供されました。実験前に動物は7日間慣れさせ、全体的な健康状態を毎日監視しました。すべての処置は動物の苦痛を最小限に抑えるために行われ、採血と組織採取の前に麻酔が適用されました。

マウスにおけるキシレン誘発耳水腫

マウス耳の浮腫モデルは、前述の通り確立されました^。順応後、マウスは6つのグループに無作為に割り当てられました(各グループに n = 6 名):対照群(CG)、モデル群(MG)、デキサメタゾン群(DEX、10 mg/kg)、および SLEL 低用量群(75 mg/kg)、中用量群(150 mg/kg)、高用量群(300 mg/kg)。すべての治療は経口ガベージで7日間連続で1日1回投与され(最終投与量:10 mL/kg)。最終投与から1.5時間後、右耳の両面に均等に30μLのキシレンを塗布し、対照群を除き炎症を誘発しました。30分後、マウスに麻酔をかけ、血液サンプルを採取し、両耳の同じ解剖学的姿勢から8mmの円形耳パンチを採取しました。

ラットにおけるカラギーナン誘発性足球浮腫

ラットポー浮腫モデルは、^前述のカラギーナンを用いて確立されました。ラットは6つのグループにランダムに割り当てられました(n=6群あたり):CG、MG、DEX(5 mg/kg)、およびSLELの低用量(50 mg/kg)、中用量(100 mg/kg)、高用量(200 mg/kg)群。治療は経口で1日1回、7日間(10 mL/kg)投与されました。最終投与前に足の基準容量を測定しました。最後の投与から30分後、右後足の足底表面に1%(w/v)のカラギーナン溶液0.1mLを皮下注射しました。注射後1時間、2時間、3時間、4時間にプレチスモメーターを用いて足の容積を測定しました。肉足浮腫は次のように計算されました:

足の浮腫(%) = (Vt − V0) / V0 × 100%

組織学的検査

機能評価直後に耳と足の組織を採取しました。組織は10%中性緩衝ホルマリンに室温で72時間固定され、パラフィンに埋め込まれ、5μm切片後、標準プロトコル¹¹に従ってH&E染色されました。

酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)

血清サンプルは3,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離して採取されました。TNF-α、IL-6、IL-1βのレベルは、市販のELISAキットを用いて標準プロトコルに従って定量化されました。

ウェスタンブロット解析

耳および足組織から、プロテアーゼおよびリン酸酵素阻害剤を補足したRIPA溶解バッファーを用いて総タンパク質抽出物を製作しました。タンパク質濃度はBCAアッセイを用いて定量し、同量のタンパク質(サンプルあたり30μg)をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜に移しました。膜は室温で5%無脂肪乳で1時間ブロッキングし、その後4°Cで一次抗体を一晩、HRP結合二次抗体を室温で1時間培養しました。免疫反応性バンドは増強化学発光法で検出され、ImageJソフトウェアで定量化されました。

定量リアルタイムPCR(qRT-PCR)

総RNAは、材料表に記載されたRNA抽出試薬を用いて耳と足の組織から分離されました。製造元の指示に従い、市販の逆転写キットを用いて1マイクログラムの総RNAを逆転写してcDNAに変換しました。定量PCRは、遺伝子特異的プライマーを用いたSYBR Green化学(表1)を用いて、10μL反応体積の2段階増幅プロトコルのもとで実施されました。詳細な逆転写条件およびPCRサイクルパラメータはプロトコルセクションに記載されています。相対的な転写産物レベルは2^⁻ΔΔCT 法を用いて計算し、内部参照遺伝子として Gapdh を用いました。

データと統計分析

データは平均標準差±表されます。2つのグループ間の統計比較はペアなしの学生t検定を用い、2つ以上のグループを含む分析には一方向ANOVAを適用しました。統計的有意はp < 0.05と定義されました。有意性は、対照群(CG)に対して #p < 0.05 および ## p < 0.01、モデル群(MG)に対して * p < 0.05 および ** p < 0.01 と示されています。

結果

UPLC-Q/TOF/MSnまでのSLELの化学組成

SLELの化学プロファイルは、正イオンモードおよび負イオンモードでUPLC-Q/TOF-MSnを用いて調査されました。主要な構成要素として9種類のセスキテルペン・ラクトンが特定されました(補足図S1)。分子式の割り当ては、正モードでは[M+H]⁺および[M+Na]⁺、負モードでは[M−H]⁻および[M+HCOO]⁻を含む観測された加加イオンから導出されました(補足表S1)。

キシレン誘発耳水腫検査におけるSLELの影響

局所キシレン塗布後(誘導誘導後30分後、プロトコルで指定)、モデル群のマウスは対照群と比較して耳のパンチ重量が有意に増加しました(補足図S2)。7日間の毎日経口投与で耳のパンチ重量が用量...

ディスカッション

本研究では、 Eupatorium lindleyanum DC産のセスキテルペンラクトンを対象としています。(SLEL)は、マウスにおけるキシレン誘発耳浮腫とラットにおけるカラギーナン誘発性足球浮腫という、確立された2つの急性炎症モデルを用いて評価されました。組織病理学的スコアリング、血清サイトカイン測定、組織レベルのmRNA定量、タンパク質レベルのシグナル伝達表示を統合することで、このプロトコルは単一の実験ワークフロー内で局所および全身の炎症反応を多層的に特徴づけます。

指定された終末時点(キシレン投与後30分およびカラギーナン投与後4時間)において、組織学的評価により、SLEL治療動物においてモデル対照群と比較して浮腫、炎症細胞浸潤、組織破壊が減少していることが示されました。半定量的スコアリングはこれらの発見をさらに支持し、質的検査を超えた再現性を可能にしました。一貫して、血清炎症促進サイトカインおよび組織サイトカインmRNA発現の低下が観察され、IκBαおよびp65のリン酸化が減少すること...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
反GAPDH	免疫道	YN5585
反I&カッパ;Bα	細胞シグナル伝達技術	4812
反P65	アブマート	TA5006
反P-I&カッパ;Bα	細胞シグナル伝達技術	2859
アンチP-P65	アブマート	TP70621
BCA	ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社	P10010
IL-1とベータ;キット	厦門慧嘉バイオテクノロジー有限公司	EHJ-20537r
IL-6キット	厦門慧嘉バイオテクノロジー有限公司	EHJ-20746R
マイクロピペット	エッペンドルフ
マイクロプレートリーダー	ジーン社	オデッセイFC
PVDF	ミリポール	IPVH00010
逆転記キット	メドケムエクスプレス	HY-K051A
RIPAバッファ	ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社	P0013B
SYBRグリーンマスターミックス	メドケムエクスプレス	HY-K0522
TNF-およびα;キット	厦門慧嘉バイオテクノロジー有限公司	EHJ-20039r
トリゾル	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15596018CN
超低温冷凍庫	三洋