高密度核環境下のクロマチン調査のための多ラベル単分子局在顕微鏡プロトコル

Summary

私たちは、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAP IIの再現可能なマッピングを空間解析のために可能にする、三色クロマチン単分子局在顕微鏡(SMLM)染色および分析プロトコルを提示します。このプロトコルにより、クロマチン関連標的を含む高密度核環境での効率的な多色標識が可能となり、信頼性の高い同時検出を可能にします。

Abstract

超分解能顕微鏡は回折限界を超えた生物学的構造の調査能力を劇的に向上させ、クロマチンや核層、核素などの核体などの高密度核構造の研究に欠かせません。クロマチンはナノメートルサイズのヌクレオソームからミクロンスケールのドメインまで多スケールの組織を示し、高分解能と分子特異性の両方を備えたイメージング手法を必要とします。単一分子局在顕微鏡(SMLM)、特に確率的光学再構成顕微鏡(STORM)は、エピジェネティックマークの正確なマッピングを可能にし、クロマチンの構造と機能に関する重要な洞察を提供します。しかし、核環境でのマルチラベルイメージングは、抗体の利用可能性の低下、非特異的結合の増加、蛍光色素の不安定性など独特の課題を伴います。これらの課題に対処するため、高密度核環境に最適化された逐次免疫標識プロトコルを提示し、クロスストリップを最小限に抑え信号劣化を抑えた堅牢な三色SMLMを実現しています。この手法には、最適化されたバッファー製剤、蛍光色素選択、抗体検証戦略が含まれ、複数の標的に対して再現性が高く高忠実度の標識を保証します。重要なのは、このプロトコルを計算解析パイプラインと統合し、1つの分子標的からの局在を空間的アンカー(シードポイント)として活用し、標的間距離、局所密度、多ラベル共和性を定量化することです。これにより、ナノスケールでのクロマチン成分の詳細な空間解析が可能になります。このプロトコルは、密度の高い細胞内環境における多成分イメージングおよび定量解析のための再現可能な枠組みとして機能し、クロマチンのような複雑な核構造を調査する研究者にとって強力なツールを提供します。

Introduction

単一分子局在顕微鏡(SMLM)の登場により、ナノ^{メートルスケール}1,2,3,4,5の生物学的構造の前例のない探求が可能となりました。単一ターゲットイメージングを超え、多色SMLMへの拡張により、複数の分子種の同時可視化やサブ回折構造間の空間的・時間的関係(6,7,7,8,9,10,11)の可視化が可能となり、この分野はさらに進歩しました。.しかし、核DNAの密度が高く高分子的な性質と、この環境(12,13,14,15,16,17,18)における抗体のアクセスが限られているため、多重SMLMを豊富に分布するヒストン修飾に適用することは依然として困難です。

クロマチンは、ナノメートルスケールのヌクレオソームアセンブリからマイクロメートルスケールの核構造まで、数桁にわたる階層的かつ多スケールの組織を示します。最大スケールでは、染色体は明確な染色体領域を占め、その中でゲノムはさらにA/B区画とトポロジー的に関連したドメイン(TAD)に分割され、ループ押し出などのメカニズムを通じて長期的な調節相互作用を制約します ^19,20,21,22.200nm未満スケールでは、クロマチンは離散的なユークロマチンやヘテロクロマチンブロックではなく、異均一なパッキングドメイン(PD)からなる無秩序な高分子として組織されており、転写活性領域はPD境界23,24,25,26,27,28,29に優先的に局在します.最小スケール(5〜20 nm)では、クロマチンは不規則なヌクレオソーム集合体とクラッチから構成されており、均一な高次折りたたみモチーフの欠如を強調し、ゲノ^ム組織の出現的かつスケール依存的な性質を強調し^{ています。}クロマチン免疫沈降シーケンシングやハイスループットクロマチンコンフォメーションキャプチャ19,30,31,32,33などのシーケンシングベースのアプローチの急速な進歩により、クロマチンのメソスケール組織構造のさまざまな特徴^{が特定されています}.しかし、これらの技術はイメージングとは異なり、構造を分解して初めて観察される空間的幾何学を捉えることができません。クロマチン電子顕微鏡(ChromEM²⁴)やクロマチン走査透過型電子顕微鏡(ChromSTEM²⁵)などの電子顕微鏡法により、クロマチンは50〜200 nmの長さスケールでパッキングドメインに組織されていることが明らか^{になりました。}これらの技術はクロマチンパッキングドメインの識別において優れた解像度を提供しますが、SMLMが提供する分子特異的なマッピングは提供できません。ナノスケール地形図(DNA-PAINT²²)および多重蛍光現場ハイブリダイゼーション(FISH)¹⁹によるDNA点の蓄積は高頻度多重化を可能にします。しかし、DNA-PAINTはオリゴヌクレオチド豊富な核環境でのランダム結合イベントによる背景ノイズの上昇に強く影響を受けます(^12,34)一方で、従来の熱変性に基づくFISH法は、ネイティブクロマチンの折りたたみを乱す必要があります。これまでの研究では、この長さスケールのクロマチンを調査するために超分解能イメージング技術を用い、従来の相分離モデル^{12、23、34、35}に対抗する混合的なパッキングドメイン組成が特定されています。このプロトコルは、これらの発見の生物学的意義について論じた以前の論文に由来^{しています。}したがって、その高分解能と多重化能力により、免疫染色ベースのdSTORMはほぼ原生条件下での多色クロマチンイメージングにおいて最も有効な戦略であり続けています。

このプロトコルは、2つ以上の核標的の標識を示した最初のものではなく、過去の研究では個々のタンパク質複合体や遺伝子を標識^{していました。}ヌクレオソーム翻訳後ヒストン修飾の標識は成功しているものの、多色クロマチンSMLM標識、画像診断、解析には大きな課題があります。まず、高密度クロマチン環境での免疫染色は、過剰な背景を避けて十分な浸透と結合を確保するために抗体濃度、培養順序、緩衝剤組成の最適化が必要です。次に、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAポリメラーゼなどの酵素間の相互作用が単純な二項除外を超えて広がる可能性が高いため、複数のラベルの包括的な解析が必要です。これまでのところ、クロマチンdSTORMイメージングで示された最大色の数は2色の18,37,38,39のままです。

ここでは、三色クロマチンSMLMイメージングおよび解析のための堅牢なプロトコルを提示します。当社の染色ワークフローは抗体の培養時間を最適化し、複数のラベルの長時間画像診断のために改良された画像バッファ^ー40を使用しています。さらに、二色距離解析および三色結合密度解析のための計算パイプラインについても記述し、ヘテロクロマチン、ユークロマチン、転写機構間の関係を定量的に特徴づけることを可能にします。ヘテロクロマチンとユークロマチンの分離を示唆した以前の二色クロマチンSMLM研究とは異なり、三色クロマチンイメージングはゲノムがパッキングドメインに組織されており、ユークロマチンと活発な転写が構成的ヘテロクロマチンコアの周辺に局在していることが明らかになります。³⁴。

このプロトコルは、多色クロマチンSMLMの再現性のあるフレームワークを提供し、複数の機能共役核標的に適した解析戦略を確立します。方法論的なギャップを埋めることで、クロマチンドメインの組織構造を超核体レベルで体系的に探求し、シーケンシングや電子顕微鏡法を補完しつつ、固有の核構造を保持することを可能にします。この記事は、発表された論文³⁴の拡張プロトコルです。

Protocol

注:以下のプロトコルセクションは、染色プロセスと取得プロセスに分割されます。データ解析のチュートリアルについては、ラベル付きヒストン修飾のマルチラベル解析を詳述した関連出版物³⁴を参照してください。

1. 染色工程:

注:プロトコル全体で35mmアンテナや8つのよくチャンバーされたプレートについて言及があります。これらは私たちのグループが細胞培養に使用する容器ですが、より小型で効率的な方法も可能です。代替材料を使用する場合は、バッファーや抗体の推奨濃度が維持されていることを確認してください。このプロトコルは連続的に行われるため、抗体選択が成功する標識のために重要です。標準的な推論を用いて、標的に対する宿主抗体が異なることを確実にし、二次抗体が異なる宿主種を標的にできるため、オフターゲット効果を効果的に最小限に抑えます。標識順序は核内の標的位置に基づいて決定されます。私たちはクロマチンのパッキングドメイン^{25、28、34、35}を標的としており、これは拡散駆動のプロセスであることを理解しているため、常にまずヘテロクロマティック標的を標識し、その後ユークロマチン、最後にRNAPIIを標識して、密集したヘテロクロマティック領域での立体排除を最小限に抑えます。バッファの最適化はプロトコル開発中に経験的に行われました。最初の標的後にヤギ血清を投与することで、その後の段階でのオフターゲット効果の軽減に役立ちました。

1. バッファーの調製
   1. バッファーコンポーネント:
      注:構成要素の詳細や保管・準備時間については、 材料表をご参照ください。実験的な誤差を避けるため、プロトコル開始前にすべての解を用意しておくことを推奨します。焼入れ液は最後に作るべきです。
   2. ブロッキングバッファを作る
   3. 実験に必要な緩衝液の最終濃度を3%にして牛血清アルブミン(BSA)を計量し、遠心分離機チューブに加えます。チューブを45°の角度に傾けてBSA結晶がチューブ内に広がるようにし、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を加えます。これは溶けない結晶塊の形成を防ぐために行われます。
   4. チューブは室温で、すべての結晶が溶けるまで放置します。チューブやボルテックスを揺らさないでください。これにより泡ができてタンパク質が表面に引き寄せられ、BSAが完全に溶けてしまうのを防ぎます。
   5. 完全に溶解したら、トライトンX-100を加え、ステップ1.3で選んだ体積を基に最終濃度が0.2%(v/v)になるようにします。結晶が完全に溶けていない場合は、ピペットを上下に数回繰り返して、気泡ができないように溶液をゆっくり混ぜます。
      注意:修正バッファーを作る場合は、この工程に10%のヤギ血清を含みます。ただし、改造ブロッキングバッファーは使用中に新しく作成し、長時間保存せず、最終濃度は 材料表に記載されている通り3% BSA、0.2% Triton X-100であることを確認しましょう。
   6. 洗浄バッファーを作る:
      ブロッキングバッファーの手順は1.1.2で繰り返しますが、材料セクションやここに記載されている濃度(0.2% BSA、0.1% Triton X-100 1X -DPBS、修正用は1% Goat serrum)を使いましょう。
   7. 固定液を作る:
      1. 遠心分離機チューブにPBSを加えます。
      2. 適切な量のパラホルムアルデヒドを遠心分離機管に加え、最終濃度4%にします。
         注意:インキュベーターから細胞を取り出す際は、新鮮で準備が整うようにしてください。現在の固定液は通常グルターアルデヒドを使用しませんが、添加可能であり、パラホルムアルデヒドと比べてより頑固で持続時間が長いため有用かもしれません。dSTORMのセットアップにはグルターアルデヒド(GA)からの蛍光寿命シグナルの能力はありませんが、可能であれば蛍光色素標識構造から分離するのに有用と考えるかもしれません。
   8. 焼入れ液を作る:
      1. 秤用紙でホウ水素化ナトリウムを計量してください。
      2. 遠心分離機チューブを準備しろ。
      3. チューブにホウ水素化ナトリウムを加えます。
      4. PBSをチューブに追加してください。
         注意:PBSを加えた後、溶液に気泡が出るはずです。
   9. イメージングバッファを作る:
      1. 1,4-ジアザビシクロクタン(DABCO)を脱イオン化されたRNASEおよびDNASEフリー水に溶解し、13 mLのDABCO溶液(濃度1 M)を作ります。
      2. DABCOが完全に溶解しpHが8.0になるまで12 M HCl(~240 μL)を加えます。
      3. 10X PBSに溶けて1Mの硫酸ナトリウムを準備します。DTTは準備の必要がありません。
      4. 最終準備として、先行ストックを用いて脱イオン水中で30 mMナトリウム硫酸塩および30 mM DTT(1 Mストック)を用いて65 mM DABCOを作ります。
      5. HClとNaOHで滴定し、pHを8.0にするまで調整します。4°Cで覆い、パラフィルムで密封して保存してください。保存は2ヶ月以内に控えます。使用中はpHを監視してください。
2. 最初のラベル染色工程の詳細:
   1. 固執:
      1. インキュベーターから生細胞を取り出し、培養培地を皿から取り出します。細胞培養培地はバイオハザード廃棄物容器に捨ててください。
      2. 細胞を覆うのに十分なPBSを加えます(35mm皿は1mL、チャンバーガラススライドは500μL)。
      3. 皿を優しく回して細胞をPBSで洗い、その後PBSを皿から取り除きます。PBSはバイオハザード廃棄物容器に捨ててください。
      4. 細胞を覆うのに十分な固定液(35mm皿は1mL、チャンバーガラススライドは500μL)を加え、細胞を10分間固定させます。
      5. セルを固定している間に、クエンチ溶液用のホウ水素化ナトリウムを計量し、遠心分離機チューブに入れます。
      6. 固定液を皿から取り出し、適切にラベルの付いた液体化学廃棄物容器に捨てます。
   2. 焼光
      1. 表面を覆うのに十分なPBSを加えます(35mm皿なら1mL、チャンバーガラススライドなら500μL)、その後、皿をシェーカー(標準的なシェーカーでもOK)に5分間置いて細胞を洗います。
      2. シェイカーから皿を取り出し、PBSを取り出して、適切にラベルの付いた液体廃棄物容器に捨てます。
      3. 皿の表面を覆うほど十分な(250μL、8孔皿)の焼入れ液を加えます(35mm皿は1mL、チャンバーガラススライドは500μL)。その後、皿をシェーカーに7分間置いて細胞内の自己蛍光を消滅させます。
      4. セルがシェーカーに置かれている間、残ったクエンチ溶液は適切にラベル付けされた液体廃棄物容器の遠心分離機管に捨てます。
      5. シェイカーから皿を取り出し、焼き入れ液を取り出し、適切にラベルの付いた液体廃棄物容器に捨てます。
      6. 皿に表面を覆うほどの量(250μL、8ウェル皿)PBSを加えます(35mm皿は1mL、チャンバーガラススライドは500μL)、その後、皿をシェーカーに置いて5分間細胞を洗浄します。
      7. シェイカーから皿を取り出し、PBSを取り出して、適切にラベルの付いた液体廃棄物容器に捨てます。
      8. ステップ1.2.2.6と1.2.2.7をさらに2回繰り返します(合計3回のPBS洗車)。
   3. ブロッキング
      1. 表面を覆うのに十分なブロッキングバッファー(250μL、8ウェル皿、35mm皿用1mL、チャンバーガラススライド用500μL)を皿に加えます。
      2. 皿をシェーカーに少なくとも1時間置き、細胞膜を透過させて結合部位を遮断します(指定されていない部位を占拠し、目標部位に干渉しないように)。(私たちは何度かテストして、最短成功したブロッキング期間を20分と定めましたが、少なくとも1時間以上、最長で一晩中ブロッキングすることを強く推奨しています。標的と細胞株を考慮すると最適化が必要かもしれません。)
      3. 細胞をシェイカーに置いている間に、一次抗体染色液を準備します(推奨濃度はベンダーウェブサイトの推奨濃度、または材料の表を参照)。
      4. 作る染色液の総体積を決定するには、細胞を覆うために必要な体積に0.5mLを加えます(例:35mm皿1皿の場合は1.5mL溶液を準備します)。
      5. ブロッキングバッファーストックから1.2.3.1節で決定された体積を取り出し、新しい遠心分離機チューブに追加して染色溶液を準備します。
      6. 適切な量の一次抗体ストックをブロッキングバッファーに加え、適切な最終濃度を得ます。いくつかの頻繁に使われる抗体の一次抗体在庫量は材料セクションで確認できます。
      7. シェイカーから皿を外し、ブロッキングバッファーを取り出し、適切にラベルの付いた液体化学廃棄物容器に捨てます。
   4. 一次抗体染色:
      1. 表面を覆うのに十分な一次抗体染色液(35mm皿は1mL、チャンバーガラススライドは500μL)を加え、皿をシェーカーに置いて細胞標的を標識します。
      2. シェイカーから皿を取り出し、一次抗体染色液を取り除き、適切にラベルの付いた液体廃棄物容器に捨てます。
      3. 表面を覆うのに十分な洗浄バッファー(35mm皿なら1mL、チャンバーガラススライドなら500μL)を加え、皿をシェーカーに5分間置いて細胞を洗います。
      4. シェイカーから皿を外し、洗浄バッファーを取り出し、適切にラベルの付いた液体廃棄物容器に捨てます。
      5. ステップ1.2.4.3と1.2.4.4をさらに2回繰り返します(合計3回の洗浄バッファー洗浄)。
      6. 最後の洗浄時に細胞がシェーカーに置かれている間に、二次抗体染色溶液を準備してください(推奨濃度はベンダーのウェブサイトを参照するか、以前の実験を参照)。
      7. 作る染色液の総体積を決定するには、細胞を覆うために必要な体積に0.5mLを加えます(例:35mm皿1皿の場合は1.5mL溶液を準備します)。
      8. 1.2.4.7節で決定された体積をブロッキングバッファーから取り出し、新しい遠心分離機チューブに追加して染色溶液を準備します。
      9. 適切な量の二次抗体ストックをブロッキングバッファーに加え、適切な最終濃度を得ます。いくつかの頻繁に使われる抗体の二次抗体在庫量は 、材料表に記載されています。
      10. 遠心分離機チューブを二次抗体染色液でアルミホイルで包み、皿内の細胞に加える準備を整えます。
   5. 二次抗体染色:
      1. 表面を覆うのに十分な二次抗体染色液(35mm皿は1mL、チャンバーグラススライドは500μL)を加え、皿をシェーカーに置いて標識された細胞標的に蛍光色素を加えます。
      2. 蛍光色素の漂白を防ぐために、皿は必ずアルミホイルで覆ってください。
      3. シェイカーから皿を取り出し、二次抗体染色液を取り除き、適切にラベルの付いた液体廃棄物容器に捨てます。
      4. 皿の表面を覆うのに十分なPBSを加えます(35mm皿なら1mL、チャンバーグラススライドなら500μL)。その後、皿をシェーカーに5分間置いて細胞を洗います。
      5. シェイカーから皿を取り出し、PBSを取り出して、適切にラベルの付いた液体廃棄物容器に捨てます。
      6. セクション1.2.5.4と1.2.5.5をもう一度繰り返します(合計2回のPBSウォッシュ)。
      7. 細胞は今後の画像化や保存が可能です。すぐに画像検査を行う場合は、取得セクションの手順に従ってください。後で画像診断のために保管する場合は、以下の手順を引き続きお守りください。
      8. 保存前に表面を覆うほどのPBSを皿に加えます(35mm皿は1mL、チャンバーガラススライドは500μL)。
      9. パラフィルムで包み、その後アルミホイルで包んで液体の蒸発と蛍光色素の漂白を防ぎます。
      10. 包んだ皿は撮影準備が整うまで4°Cで保存してください。
          注:このプロトコルで使用されるラベルでは、アンテナは2〜3日間保存しても画質に大きな影響が出ます。しかし、抗体によって安定性は異なる場合がありますが、適切な保管によりプロトコル完了後も一定期間安定します。固定液の濃度が長期的に安定していないため、ラベル付きの皿を1週間以上保存することは推奨されません。
3. その後のラベル染色工程:
   1. ブロック:
      1. 1.2.3.1 - 1.2.3.2を参照しつつ、ヤギ血清を併用したブロッキングバッファを使いましょう。ブロッキングの潜伏期間は1時間程度で可能ですが、オフターゲット結合を減らすために、次のラベルは18〜24時間の上限付きで長期を推奨します。過去の実験を参照してください。
      2. その間に、ブロッキングバッファーの代わりに一次抗体溶液を準備し、ヤギ血清を使ったブロッキングバッファーに置いてください。
   2. 一次抗体染色:
      1. バッファーの準備セクションで詳述した通り、改良ブロッキングバッファーとヤギ血清で洗浄バッファーを準備します。
      2. 修正ブロッキングおよび洗浄バッファーを用いて、ステップ1.2.3-1.2.4(ブロッキングおよび一次抗体染色)を参照してください。
         注意:一次抗体の潜伏期間は最短1時間から一晩中(8〜24時間)まで可能です。ただし、特にマルチラベルの場合、より長い孵化期間で最良のラベル性能が達成されています。このプロトコルのデータは一晩の培養ステップで作成されています。
      3. 培養直前に、修正ブロッキングバッファー1.1.3で二次抗体溶液を準備します。
   3. 二次抗体染色:
      1. 1.2.5節(二次抗体染色)を参照してくださいが、ヤギ血清を含むブロッキングバッファーを使用してください。
         注意:孵化時間は1時間程度の場合もありますが、2〜4時間の長い時間でも同様の性能でテストしたことがあります。次のラベルについては、セクション1.3を繰り返してください。

2. 取得プロセス

注意:データ取得には、使用された顕微鏡に対応したNikon Imaging Software(NIS)の要素ソフトウェアを使用してください。フィルター、光の経路、カメラ設定を制御できるソフトウェアなら、このプロトコルには問題ありません。以下のイメージングプロトコルは、試料の全内反射蛍光(TIRF)照明用に適応されています。しかし、このラベル付けプロトコルは複数の画像処理方法と互換性があります。この表示プロトコルにより非TIRFイメージングがSTORMに可能であり、3D STORMアプリケーションに必要です。代替画像診断法については標準プロトコルを使用してください。

1. その後のラベル染色工程:
   1. 必要な光学部品を起動し、適切なソフトウェアとの接続を確立してください。NISのように、ソフトウェアは顕微鏡、カメラ、ステージコントロールと適切に通信できないと完全に初期化されません。
   2. オープンNISソフトウェア(または同等のもの)です。
   3. ライブビューの設定:ライブビューをオンに>トグル カメラ設定で 自動スケールを保持 > 露出時間を30msに設定してください。
   4. 取得のためのデータパスを設定しましょう。
   5. 上部パネルへナビゲーション 取得>高速タイムラプス>パス
   6. 最初の取得には適切なファイル名を選択し、フレーム数を10,000に設定します。
      注:これらの手順は、イメージング開始後にサンプルが光源に曝露される時間を制限するために取られています。
   7. 取得前にTIRFの臨界角とゼロ角があらかじめ設定されていることを確認してください。この方法については、オンラインのチュートリアルをご参照ください。前述の通り、TIRF照明を使用しない場合はこのステップを省略できます。
   8. カメラの適切な光の経路を選択し、NISまたは同等ソフトウェアのランプ下でエ ピ照明 オプションを切り替えて、ミラーがレーザー規格外の広域照明に対応できるように設定してください。
2. サンプルの準備:
   1. サンプルを回収し、イメージングバッファー(セクション1.1「バッファー準備」で説明された処方)をサンプルに加えます。(使用するイメージングバッファによっては、異なる予防措置が必要になる場合があります。サンプルを光から守る。)
   2. 対物レンズに油を加えた後、適切なホルダーでサンプルをステージに置き、 パーフェクトフォーカ スを切り替えてからサンプルにフォーカスします。
3. 画像診断の手順:
   1. レーザースポットを見つけて、皿や皿の細胞のない場所へ移動します。
   2. TIRF照明を切り替えてください。
   3. 赤色(またはこの特定のサンプルのデータ取得に使われたレーザー)光を通すための適切なフィルターにフィルターを変更します。
      注意:材料表に記載されているマルチノッチフィルターを使用してください。マルチノッチフィルターは必須ではなく、ユーザーは染色に使用する蛍光分子向けに設計された非区別フィルターキューブのイメージングを行うことも可能です。
   4. レーザーを最低出力~1 mWでオンにし、ミラー角度を臨界角度に設定します(これは照明源に依存しますが、誤って漂白を防ぐために行われます)。
   5. 近くにセルがなければ、レーザースポットがライブビューではっきり見えるまでレーザー出力を上げます。
   6. Region of Interest(ROI)ツールを使い、レーザースポットの位置を描画・設定・保存してください。
      注意:マルチラベルサンプルの場合、必要な光源のレーザースポットがすべて整列していることを確認してください。このプロトコルでは3本のレーザーを使用し、すべてのスポットが整列していることを確認しています。これは空間データの共登録にレーザーアライメントが必要なため不可欠です。
   7. エピ照明とブライトフィールドフィルターに戻る。
   8. ROI定義ツールを使い、適切な健康な細胞(例:適切なHCT116細胞は、細胞境界が明確で接着型、多角形または楕円形の形状である)を探します。
   9. ROIを核に集中させ、 OK をクリックしてROI位置にズームします(細胞の健康状態は核の広視野蛍光画像から直接判断できないため、明視野照明を用いて実行してください。
   10. 2.3.2で使用されたのと同じ方法でTIRF照明に戻る。
   11. 最長波長の標識ターゲット(ほとんどの場合、極赤、例:Alexa Fluor 647標識標的)に適したフィルターを選択してください。通常、最も長い波長を先に選びます。これは、標識されたターゲットが二次的にスペクトルと重なる場合に備えて、短波長の光漂白サンプルを避けるためです。
   12. レーザー出力が 低い 場合は、必要なレーザー(複数ラベルの場合は3本)ごとにレーザーをオンにし、原子核を照射して試料が正しく整列していることを確認します。
   13. TIRF制御を使って試料がTIRFで照らされることを確認しましょう。
   14. ニーズに応じて適切なZポジションを選択。ただし、これは取得直前に調整可能です。
   15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
   16. 取得>ファストタイムラプスをクリック。
   17. フレームを≥10,000に設定し、「 適用 」をクリックして指定されたディレクトリ内のファイルを作成します。
   18. レーザー出力を50%にして、光漂白サンプルを使います。
   19. 核は最初は漂白しますが、その直後(数秒後)に点滅し始めます。
   20. 保存位置を切り替えたり、ミラー角度とZ位置を手動で制御することで、望ましい臨界角とZ位置に戻り、高速タイムラプスを取得します。
   21. ステージにドリフトがないか、またはマルチチャンネル画像の共登録が正しく行われないことを確認しましょう。受託者マーカー(蛍光マイクロビーズ)を使用するか、取得開始時にZ位置を保存し、後で位置保存法を使ってドリフト補正に使うために、デバイス内の多点取得に使います。
   22. フィルターを交換(または必要な蛍光色素のパスバンド付きマルチノッチを使用する場合はそのままにしておく)し、セクション2.3.17-2.3.20を繰り返してください(以降のラベルは常に低出力から始め、パラメータを調整して取得してください)。
4. データ処理:
   1. Bio-Formatsプラグインを使って生画像スタックをFIJIに読み込みます。最小強度の投影は>画像スタック>Zプロジェクトを選択し、投影タイプとして最小強度を選択できます。この最小投影を生画像スタックからProcess > Image Calculatorを使って差し引いてください。結果として得られた画像に対して、ロールボール半径5ピクセルで背景の減算(背景を差し算>プロセス)を行います。
   2. 個々のセルごとに関心領域(ROI)を手動またはNuclei Outlineプラグイン(Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline)で定義してください。
   3. ThunderSTORMプラグイン(Plugins > ThunderSTORM > Run analysis)を使って、定義されたROI内の前処理画像スタックのローカライゼーション解析を行います。ロバストローカライゼーションのために適切なパラメータを用いてください(例:画像フィルター:Bスプライン、次数=3、スケール=2;ピーク強度閾値=1.5×標準(Wave.F1);サブピクセル局在化法:ガウス分布、シグマ=2;フィッティング半径=4;フィッティング方法:最大尤度)。得られた座標は超高解像度画像の再構成に利用できます。
   4. マルチチャネル実験では、チャネルをマージして合成クロマチンを再構築したdSTORM画像を生成する(画像>カラー>マージチャネル)。

Results

代表的な三色クロマチンdSTORM画像

提案された逐次染色プロトコルは、BJ線維芽細胞、HCT116、AC16、HeLa、MCF10Aなど多様な細胞株で有効であることが検証されています。 図1 BJ線維芽細胞、HeLa、MCF10A細胞からの代表的な画像を示しています。

シミュレーションデータセットを用いた解析パイプラインの検証

三色免疫蛍光プロトコルの開発は、多ターゲット核SMLMデータの複雑さを扱うための特殊な計算手法の創出を必要としました(図2A、2B)。複数のターゲットが近接して共存する密集したクロマチン環境を考慮し、再構築画像ではなく局在座標を直接処理する点雲解析フレームワークを実装しました。このアプローチは、ポイントクラウドデータ^40、41、42に利用可能な広範なクラスタリング分析ツールを活用しています。私たちは、制御されたシミュレーションデータセットを用いて、生物学的に意味のある空間パターンを区別する分析パイプラインの能力を体系的に評価しました。異なるクロマチン組織シナリオを表すために4つの分布タイプが生成されました:密にクラスタリングされた修飾に対する正規分布、分散パターンの均一分布、排除領域をモデリングするトロイダル分布、そして組織制御としてのランダム分布です(図2C)。これらのシミュレーションパターンは、実験的なH3K9me3データから導き出された実際のヘテロクロマチンクラスター位置に紐づけられ、現実的な核空間制約を保持しました。この解析フレームワークはDBSCANクラスタリング(イプシロン=50nm、最小点=3)を利用しており、これはSMLMデータ^40、41、42におけるクラスタ解析の多くの手法の一つです。適切なクラスタリングパラメータを確保するために、クロマチンパッキングドメインの検出に特化した最適化手法を以前に記述^{しました。}これを分析の初期段階として使用する際は、ターゲットの構造、環境、機能を通じて選択に役立つパラメータを最適化する必要があることにご注意ください。ここでは、クラスター境界は凸包計算によって決定され、ドメイン幾何学に関する仮定を排除します。検証では、異なる距離ヒストグラムプロファイルを通じて、すべてのシミュレーション分布パターンの明確な識別が示されました(図2D)。各空間組織タイプは、ヘテロクロマチン中心体に対する局所化を解析した際に特徴的なシグネチャーを生み出しました。共同占有率解析は、制御された空間的関係を持つデュアルマーカーシミュレーションを用いて検証されました(図2E)。空間的に分離されたマーカー(正規-トロイダル構成)は、期待通り最小限の結合密度を生み出し、平坦な分布プロファイルを得ました(図2E)。重なり合うマーカーパターン(正規-ランダム構成)は、参照点からの距離が遠くなるほど結合密度が低下し、理論的予測と一致しました。これらの検証結果は、複雑な多ターゲットデータセットにおける空間的結合関係を検出・定量化する本フレームワークの能力を示しています。これらのシミュレーションデータセットがどのように生成されたかの詳細については、全文出版物³⁴を参照してください。

クロマチン組織解析の代表的な結果

生物学的サンプルにおける当社の検証済み解析手法の実装により、このプロトコルを通じて達成可能な特徴的な空間的組織パターンが明らかになりました。H3K9me3、H3K27ac、RNAポリメラーゼIIの三色染色法で処理したHeLa細胞を用いて、この手法による解析能力を実証しました。H3K9me3ヘテロクロマチンは、過去の超分解能研究23,28,35で200 nmスケールでの同心クロマチン組織の確立された証拠から理想的な基準系として機能します。解析はDBSCANを用いたヘテロクロマチンドメインの同定から始まり、その後有効半径で分類されます:小さなドメイン(25-40 nm)、中ドメイン(40-80 nm)、大きなドメイン(80-253 nm)。このサイズ層化は、DNAパッキングドメインの寸法における記録された異質性を説明しており、平均ドメインは半径²⁵で約80 nmです。距離測定では、1.5倍のクラスター半径探索ウィンドウ(図2B上部)を用いて近接ユークロマチンおよびポリメラーゼ信号を捉えます(図3A,B)。

代表的な結果は、H3K27acおよびRNAポリメラーゼIIがすべてのドメインカテゴリーでヘテロクロマチン境界付近を一貫して局在していることを示しており、これは先行研究^28,44およびクロマチンドメインに対する転写位置モデル23,35,45,46と一致しています。定量的距離解析により、ドメイン周辺に非常に近い平均位置が明らかになります。大きなドメインでは境界から-1.0 nmにH3K27ac、8.4 nmにRNAポリメラーゼIIが現れ、小さなドメインではわずかな位置差を伴う類似の周辺関連を示します。これらの測定は、能動クロマチン要素が抑制ドメインと許容ドメインの界面に集中し、完全に排除されていないことを示しています。結合密度解析は、共標識ターゲット間の空間的結合を明らかにするプロトコルの能力を示しています(図3C-F)。ヘテロクロマチンドメインに対する分析では、ドメイン境界のすぐ外側に結合密度のピークが現れていることが示されており(r/r₀> 1)、周辺領域におけるH3K27ac-RNAポリメラーゼIIの共局在が優先的であることを示しています(図3G-I)。これらの結果は、この染色・解析パイプラインが高密度環境における複雑な空間関係の調査に役立つことを示しています。

図1:使用セルの3色画像。 (A) BJ 線維芽細胞、(B) HeLa、(C) MCF10A の三色画像。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:ヘテロクロマチンクラスターに対するターゲットの空間的組織化のための定量的分析フレームワーク。 (A) 本研究で使用されたマルチチャネルSMLMデータの解析パイプライン。(B) 同定されたヘテロクロマチンクラスターおよび結合親和性計数法の周辺距離計算の概略図。両方法とも、ヘテロクロマチンクラスター構造に対する2つのターゲットの配置を定量的に決定するために用いられます。(C) 特定のヘテロクロマチンクラスター周辺の散乱分布の例:標的構造の異なる生物学的組織(ドメイン内にクラスタリングされる、ドメインの周囲にクラスタリングされる、関連していない、ランダム分布)を特定するために用いられた³⁴。(D) 中心クラスタリング、ランダム分布、トロイド分布の周辺ヒストグラムまでの距離、および (E) シミュレーションケースにおける関節親和性曲線。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:ヒストンドメイン周辺の転写マーカーの定量的空間的関係。 (A) 多標識HeLa細胞の代表的な生物学的データにおける周辺ヒストグラムからの距離。RNAPIIおよび(B)H3K27acに対して、H3K9me3クラスターに対して、小ドメイン(<40nm)、中ドメイン(40-80nm)、および大ドメイン(>120nm)に対して、(C-E)例:HeLaセルの3ラベルdSTORM画像(H3K9me3、H3k27ac、RNAPII2-S2p、単一ドメインのインセット画像およびズーム画像付き)。(F) Eに示された定義域の凸包(赤)フィッティングで解析領域は灰色で示されています。(G) データセット内の中規模データにおけるすべてのドメインにおける分析における、R3K27acおよびR3K27ac (H)に対するRNAPIIの親和性プロット。(I) 解析におけるRNAPIIおよびH3K27acの結合密度、すべての中規模ドメインにおけるROI。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Discussion

この三色SMLMプロトコルは、高密度核環境下でのクロマチン組織の研究能力において重要な進歩を示しています。逐次免疫蛍光標識法と、局所推定値を点として分析の基盤とする点雲空間解析を組み合わせることで、従来の顕微鏡技術では検出できなかった異なるクロマチン修飾と能動転写機構間のナノスケール関係を検証する強力なツールが研究者に提供されます。

プロトコルの逐次染色戦略は、多ターゲット核イメージングに内在する根本的な課題に対応しています。比較的稀薄な細胞質や膜関連構造とは異なり、核クロマチン標的は非常に高密度で存在し、重なり合う空間領域を持っています。各標識ラウンド後に二次抗体宿主種からの血清を取り込む修正遮断アプローチにより、抗体対間の交差反応を効果的に防ぎつつ標的特異性を維持します。4°Cでの一晩のインキュベーションにより、核体全体に抗体が完全に浸透することがあり、定量的なSMLM解析に必要な均一な標識密度を達成するために極めて重要です。このプロトコルは複数の細胞株で15〜20 nmの解像度で信頼性の高い画像を生成し、クロマチン組織解析に広く応用可能です。

以下は画像診断のためのトラブルシューティングのヒントです。核が漂白しない場合、最も可能性の高い原因は試料でのレーザー強度不足であり、これは低出力設定や誤ったTIRF角度に起因することがあります。この場合、レーザーのアライメントを確認し、レーザー出力を上げ、TIRF角度を慎重に調整してトラブルシューティングを行います。核内の点滅が非常に少ないものの常に明るいままであれば、核が十分に漂白していないことを示しています。まばたきが非常に少なく核が全く見えない場合は、染色が失敗したことが最もありそうな原因であり、プロトコルを繰り返す前に試薬や抗体の確認が必要です。逆に、核のまばたき回数が非常に多い(望ましい結果)場合、個々の十分に分離された単一分子のまばたきが視覚的に分解されるまで、より長い漂白時間が必要です。従来のSMLM実験では、微小管などの明確な基準構造を用いて適切な標識密度を推定できることが多いです。しかし、クロマチンは非常に不均一な組織を示し、明確な地底的真実構造を欠いているため、この推定はより困難です。実証的な最適化と既存経験に基づき、効果的な標識密度が約100 μm²の局在化に達し、クロマチン充填ドメインの堅牢な再構築を可能にします。私たちのプロトコルでは、受託者認定の指標は使用せず、ユーザーが持っている場合は推奨しています。私たちの実験では、横方向のずれは0.2ピクセル(~5nm未満)以内にとどまり、無視しても問題ありません。したがって、私たちは受託者的な標識を使用しませんでした。

H3K9me3、H3K27ac、RNAポリメラーゼIIの選択は、ナノスケールレベルでのクロマチン組織に関する補完的な情報を提供します。H3K9me3は、構成的なヘテロクロマチンを表す離散的で明確に定義されたクラスターを形成し、自動クラスタリングアルゴリズムによって確実に同定できるため、理想的な空間基準となります。H3K27acは遺伝子調節に積極的に関与するエンハンサー関連クロマチンをマークし、RNAポリメラーゼIIは直接的に活発な転写部位を示します。これら3つの標的を合わせることで、転写機構や調節クロマチン修飾が核構造内のヘテロクロマティック領域に対してどのように組織化されるかを調査することが可能になります。

点雲解析フレームワークは、従来のクロマチン組織研究の重大な制約を解消し、密集した核環境下での包括的な空間解析を可能にします。従来のペアワイズ比較法では、複数のクロマチン修飾が同じ核領域内で共存する際に生じる複雑な空間的関係を捉えきれません。我々の手法は、結合密度解析を用いてH3K27acとRNAポリメラーゼIIがH3K9me3クラスターに対して共局在する位置を明らかにし、別々の二色実験では得られない定量的情報を提供します。

代表的な結果は、厳密なクロマチン区分ではなく、一貫した組織モデルを示しています。H3K27acおよびRNAポリメラーゼIIは、異なるドメインサイズのヘテロクロマチンクラスター周辺に優先的に局在し、定量的測定ではクラスター境界から10nm以内に位置していることが示されており、類似の方法と転写モデルを持つ他のグループの発見を支持しています^。.関節密度解析の結果、活性転写機構とエンハンサー関連クロマチンは、ヘテロクロマティッククラスター周辺の領域で最も頻繁に結合することが明らかになりました。これらの発見は単純な相分離モデルに異議を唱え、異なるクロマチン修飾が空間的に近接して存在し、別々の区画を形成するのではなく、統合された組織原理を支持しています。

プロトコルのモジュール設計により、標的置換を通じて多様なクロマチン生物学の課題を調査しつつ、同じ分析枠組みを維持しています。複製タイミングの研究は、増殖細胞核抗原(PCNA)やミニ染色体維持(MCM)などの細胞周期タンパク質の代替となり得る一方で、DNA損傷応答の研究はγH2AXや修復因子を標的とする可能性があります。細胞周期研究では分裂に伴うヒストン修飾を調べることができ、分化研究は系統のコミットメントに関連するエピジェネティックマークに焦点を当てるかもしれません。逐次標識法は、信頼できる抗体が存在する核タンパク質やクロマチン修飾の任意の組み合わせに対応し、主にスペクトル適合性や交差反応性の考慮に制約されます。この柔軟性により、研究者は定量的空間解析能力を維持しつつ、さまざまな細胞過程におけるクロマチン動態に関する根本的な疑問に取り組むことができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andor iXon Ultra 888 電子増殖CCD	アンドール	DU-888U3-CSO-#BV	NA
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A7030	ブロッキングや洗浄用バッファーに使用されます。BSAベースのブロッキングバッファを4°で1ヶ月以上保存しないでください。C
長春新工業オプトエレクトロニクス技術有限公司、モデルMGL-FN-532(532nm)	PSU-H-LED	https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htm	NA
コヒーレントOBISレーザーボックス(405 nm、488 nm、532 nm、552 nm、637 nm)およびnbsp;	一貫性	1228877	レーザーは3&ndashとコリミングされ、10 kW/cm³サンプル時の平均出力、波長チャネルあたり最低10,000フレームの収集、nbsp;10–30 ms 取得時間。
DABCO(1,4-ジアザビシクロ-(2.2.2)-オクタン)	シグマ	D27802	NA
DBPS(1X)	サーモ・フィッシャー	14190-136	NA
蒸留水	NA	NA	蒸留水は問題ありません。
DTT(ジチオスレイトール)、1M	シグマ	43816	NA
8つのよく設計されたカバーガラス	セルヴィス	C8-1.5H-N	どのガラス底板でも構いませんが、容器によって体積を調整する必要があります。
ヤギ対マウス AF568	サーモ・フィッシャー	A11004	ストック濃度:2 mg/mL 表示後安定性:2–3日間
ヤギ反ウサギ AF647	サーモ・フィッシャー	A21245	ストック濃度:2 mg/mL 表示後安定性:4–5日間
ヤギアンチラット A488	サーモ・フィッシャー	A11006	ストック濃度:2 mg/mL 表示後安定性:2–3日間
H3K27ac一次抗体	サーモ・フィッシャー	MA5-23516	ストック濃度:1.0 mg/mL
H3K9me3一次抗体	アブカム	AB1769156	ストック濃度:1.287 mg/mL
高透明度ポリプロピレン円錐管 15 mL	コーニング	352096	固定液および焼光液に使用;
高透明度ポリプロピレン円錐管 50 mL	コーニング	352070	ブロッキングおよび洗浄バッファーの40 mL作業用ストックに使用
塩酸(HCl)、12M	シグマ	258148	NA
ニコンEclipse Ti-E、パーフェクトフォーカスシステム付き	ニコン	TI-DH 611392	逆立顕微鏡
ニコン SR APO TIRF、100倍倍率、1.49 NA	ニコン	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series	NA
通常のヤギ血清	アブカム	AB7481-1002	最初のラベルが貼られた後に使います。ブロッキングや洗浄バッファーに存在すべきです
パラホルムアルデヒド 16%	電子顕微鏡科学	15710	固定液に使われ、製造後2週間以内に使い切るはずです。光から守るように4度と4度。C
リン酸塩緩衝塩水(PBS)10X	アンビオン	AM9625	NA
ピペットチップ 1000 uL	SureOne	02-707-404	どんなピペットの先端でも問題ありませんが、は体積に適した
RNAPII-PS2	アブカム	AB252855	ストック濃度:0.98 mg/mL
ホロヒド化ナトリウム	サーモ・フィッシャー	S678-10	毎回、清水バッファーには新鮮なバッファーを使ってください。
水酸化ナトリウム(NaOH)	サーモフィッシャー	A16037.36	NA
硫酸ナトリウム	シグマ	S0505	NA
トリトン X-100 10%	サーモフィッシャー	28314	NA