膵臓がんに対する酵素反応性スクアレン-キダミドナノ粒子の開発と有効性

Summary

本プロトコルは、葉酸修飾スクアレン-キトーサンナノ粒子の合成と特性評価、酵素応答性薬物放出および細胞のvitroでの取り込み評価、そして標的的送達を通じて膵臓がん治療の強化に応用することを目的としています。

Abstract

ここでは、膵管腺癌(PDAC)の高密度細胞外マトリックス(ECM)によって引き起こされる小分子薬剤の腫瘍内浸透が限られている問題に対処するためのプロトコルを提示します。プロドラッグは、薬物浸透性と腫瘍除去効果を高めることで、この課題を克服する大きな可能性を持っています。スクアレン(SQ)は、優れた生体安全性と生適合性を持つコレステロール生合成の自然前駆体であり、親水性薬剤の膜適合性を改善し、化学療法薬や生体活性の小分子と結合すると細胞の取り込みを強化できます。本研究では、新しい脂溶性SQベースのプロドラッグシステムを開発しました。親水性抗がん薬キダミド(CHI)は、膵酵素とカテプシンB(PDAC微小環境で過剰発現する主要酵素)に応答するアミド結合を介してSQに結合しました。この結合により両親性のSQ-CHIプロドラッグが生成され、さらに葉酸(FA)修飾ナノ粒子(FA-SQ-CHI NPs)に自己組み立てされました。最適化されたNPは、均一な流体力学直径173.3±1.5 nm、多分散指数(PDI)0.181±0.18、薬物負荷能力59.0%±0.77%、安定したゼータ電位±0.86 mVで-13.10を示しました。 in vitro 放出試験では、0.25%の膵腺素が存在すると、NPは72時間以内に累積薬物放出率が80.2%±4.22%に達した一方、酵素なしのpH調整バッファー(pH 4.5または7.4)では33%〜38%の放出にとどまりました。細胞取り込みアッセイでは、FA修飾が細胞内送達効率を大幅に向上させ、PDAC細胞(PSN-1およびCFPAC-1)では非標的NPと比較して1.8〜2.3倍の蛍光強度が12〜24時間で高かったことが確認されました。現在のプロトコルは、プロドラッグの合成と特性評価のための包括的な手法、酵素応答性放出速度論の in vitro 評価、治療効果と組織浸透の比較解析を提供し、標的的デリバリー、高薬物負荷、酵素誘発制御放出というナノキャリアの中核的な利点を強調しています。

Introduction

膵管腺癌(PDAC)は消化管の非常に悪性な腫瘍で、発症率は死亡率とほぼ同じで、5年生存率はわずか8%〜^9%です。複雑な腫瘍微小環境(TME)はPDAC²の特徴です。主に異常な細胞外マトリックス(ECM)、活性化されたがん関連線維芽細胞(CAFs)、そして極めて免疫抑制的な細胞環境から構成されています。PDACのECMはタイプIコラーゲンが豊富です。その内容の変化と異常な構造は腫瘍の進行を促進し、予後不良と関連しています^。CAFは最も豊富な間質細胞であり、マトリックス産生型myCAFや表現型可塑性を示す炎症性iCAFなど、機能的に異なるサブタイプ^{で構成されています。}

免疫学的には、PDAC TMEは腫瘍前性骨髄細胞が優勢です。抗腫瘍リンパ球は希少または機能不全です。成熟したBリンパ球も免疫抑制に寄与します^3,4。これらの要素は総合的に複数の治療障壁を築きます。高い間質液圧を特徴とする高密度間質質は、治療薬の深部腫瘍領域への投与を著しく妨げる重要な貫通障壁を生み出し、化学療法薬の臨床効果を大幅に制限

Protocol

1. SQ-CHIおよびSQ-PEG-FAの合成

1. SQ-CHI合成:1,1',2-トリスノルスクアレノ酸を120.4 mg(0.3 mmol)重みし、N-ジメチルホルムアミド(DMF)1 mLに溶解します。順にNHS(46 mg、0.4 mmol)とEDCI(72 mg、0.38 mmol)を加え、窒素保護のもとで90分間反応を進めます。
2. チダミド(58.56 mg、0.15 mmol)を1 mLのDMFに溶かし、反応混合物に滴ずつ加えます。窒素気圧下で室温で72時間かき混ぜます。
3. 完了後、5〜15 kPaの減圧下で溶媒を蒸発させて原油生成物を得る。DCM/MeOH(99:1、99:5、85:5)の勾配を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーで原油製品を精製します。
4. SQ-CHIの構造検証:合成されたSQ-CHI産物をガラスバイアルに入れ、乾燥器で真空中24時間乾燥させます。生成物を約1 mLの重水素化クロロホルム(CDCl₃)に溶解し、NMRサンプルチューブに移します。生成物の化学構造を確認する ^ために1HNMR分析を行う^{こと 17}.
5. SQ-PEG-FA合成:1,1',2-トリスノルスクアレン酸41.12 mgを35 μLのDMFに溶....

Results

本研究は、新規標的型ナノドラッグ送達システムであるチダミドスクアレンニル化プロドラッグベース自己組織化ナノ粒子(CHI-SQ-PEG-FA NPs)を設計し、体系的に評価することに成功しました。 図1)。CHI-SQ-PEG-FA NPを合成し(図2)、油と水の相比(図3A)、攪拌時間(図3B)、音響条件(図3C)など様々なパラメータが粒子サイズおよび多分散指数(PDI)に与える影響を体系的に評価しました。さらに、CHI-SQ-PEG NPおよびCHI-SQ-PEG-FA NPの形態的特徴を顕微鏡で観察しました(図4)。このシステムは、物理的特徴、薬物放出挙動(図5

Discussion

本研究は、ナノ粒子自己組織化に基づくローウエストシステムの実装に関する実践的なステップバイステップガイドを提供します。本研究で得られた自己組織化ナノ粒子は、規則的な球状、良好な分散、均一な粒子サイズ、高い薬物負荷および封入効率を示し、満足のいく安定性を示しました^。3次元腫瘍球体共培養モデル(PSN-1/HPSC)を用いてナノ粒子の浸透を評価し、葉酸修飾CHI-SQ-PEG-FA NPが腫瘍球体のコアにより効果的に浸透できることが明らかになりました。さらに、腫瘍球体内の保持時間は有意に延長されました。この保持力の向上は、スクアレノイル化後のCHIの脂溶性が著しく高まったことに起因します。これらのナノ粒子は腫瘍細胞のエンドサイトーシスと細胞間輸送を通じて細胞の取り込みを促進します。したがって、腫瘍微小環境への深い浸透を達成します²²。同時に、葉酸を標的とする表面修飾は、葉酸受容体によるエンド^{サイトーシス}を介して膵臓がん細胞によるナノ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% トリプシン-EDTA	Gibco(アメリカ)	25200072
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	E6383
2 mLのクライオジェニックバイアル	コーニング(アメリカ)	430488
96ウェル細胞培養プレート	コーニング(アメリカ)	3598
絶対エタノール	中国国家製薬集団(中国薬剤)	100092680
アセトン	中国国家製薬集団(中国薬剤)	32201-2.5L
アセトニトリル	テディア(アメリカ)	A998-4	HPLCグレード
酢酸アンモニウム	中国国家製薬集団(中国薬剤)	10002861
無水硫酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	31481
生物学的セーフティキャビネット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	1380, 1332, 1356
細胞培養フラスコ	コーニング(アメリカ)	CLS430372
細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	HERA51901126
チダミデ(チカイ)	深圳マイクロコアバイオテック有限公司(中国)		純度>95%
Cytation 5マルチモードマイクロプレートリーダー	バイオテック、アメリカ	CYT5MV
DF-101Sサーモスタティック磁気加熱攪拌器	鄭州克長計器有限公司、中国
ジクロロメタン	中国国家製薬集団(中国薬剤)	80047318
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	D2650
ジオキサン	アラジン(中国)	D116156-5ml
DMEM媒体	Gibco(アメリカ)	12100046
ダルベッコリン酸塩緩衝塩水(DPBS)	Gibco(アメリカ)	14040141
エチルアセテート	中国国家製薬集団(中国薬剤)	10009460
エチルエーテル	中国国家製薬集団(中国薬剤)
FA2004B電子天秤	上海天美バランスインスメント有限公司、中国	FA2004B
胎児用牛血清(FBS)	Gibco(アメリカ)	10099141C
葉酸-ポリ(エチレングリコール)-アミン(FA-PEG-NH2)	上海鵬樹生物技術有限公司(中国)	PS2-NFA-2000
蟻酸	アラジン(中国)	F112034	HPLCグレード
フリーズドライヤー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ
ヒトカテプシンB	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	SRP0289
ヒト膵臓がん細胞株(PSN-1、CFPAC-1)	アメリカタイプカルチャーコレクション(ATCC)	CRL-3211、CRL-1918
ヒト膵星状細胞(HPaStec、HPSC)	アメリカタイプカルチャーコレクション(ATCC)
ヒトトリプシン	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)
塩酸	中国国家製薬集団(中国薬剤)	CFSR-10011008
逆立顕微鏡	オリンパス、日本	IX83
イスコーブの修正ドゥルベッコ媒介(IMDM)	Gibco(アメリカ)	12440053
IX 1000 ボルテックスミキサー	杭州瑞成計器有限公司、中国	第9 1000年
メタノール	中国国家製薬集団(中国薬剤)	M433287-10L
メタノール	テディア(アメリカ)	MS1922-001	HPLCグレード
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5/2.0 mL)	アクシジェン(アメリカ)	MCT-150-C
マイクロピペット(20、100、1000 & Mu;L)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ	4642050, 4642070, 4642090
Mill-Q水質浄化システム	ミリポア、アメリカ	ZR0Q00800
MTSアッセイキット(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)	プロメガ(アメリカ)	G3582
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)	アラジン(中国)
N-ブロモスクシニミド(NBS)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	B81255
N-ヒドロキシスクシニミド(NHS)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	56480
オプティマ・マックス超遠心分離機など;	ベックマン、アメリカ合衆国	393490
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液	Gibco(アメリカ)	15140-122
周期酸	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	P7875
石油エーテル	中国国家製薬集団(中国薬剤)
フェナジンメトスルフェート(PMS)	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	3180806
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Gibco(アメリカ)	70011069
ポリ(エチレングリコール)-アミン(PEG-NH<サブ>2)	上海鵬樹生物技術有限公司(中国)	PG2-AM-20k
RPMI-1640 ミディアム	Gibco(アメリカ)	31800022
シリカゲルパウダー	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	53698	300メッシュ
炭酸水素ナトリウム	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	401676
塩化ナトリウム	中国国家製薬集団(中国薬剤)	10019318
二クロム酸ナトリウム二水和物	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	1.93689
スクアレン	シグマ・オルドリッチ(アメリカ)	Y0002131
無菌遠心分離機チューブ(15 mLおよび50 mL)	コーニング(アメリカ)	430791, 430828
硫酸	中国国家製薬集団(中国薬剤)	10021618
テトラヒドロフラン	中国国家製薬集団(中国薬剤)	34865-4X4L	分析等級
超ろ過遠心管(分子量カットオフ:3.5 kDa)	ベックマン、アメリカ合衆国	344088