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方法論記事

膵臓がんに対する酵素反応性スクアレン-キダミドナノ粒子の開発と有効性

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DOI：

10.3791/69875

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2026年3月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、葉酸修飾スクアレン-キトーサンナノ粒子の合成と特性評価、酵素応答性薬物放出および細胞のvitroでの取り込み評価、そして標的的送達を通じて膵臓がん治療の強化に応用することを目的としています。

要約

ここでは、膵管腺癌(PDAC)の高密度細胞外マトリックス(ECM)によって引き起こされる小分子薬剤の腫瘍内浸透が限られている問題に対処するためのプロトコルを提示します。プロドラッグは、薬物浸透性と腫瘍除去効果を高めることで、この課題を克服する大きな可能性を持っています。スクアレン(SQ)は、優れた生体安全性と生適合性を持つコレステロール生合成の自然前駆体であり、親水性薬剤の膜適合性を改善し、化学療法薬や生体活性の小分子と結合すると細胞の取り込みを強化できます。本研究では、新しい脂溶性SQベースのプロドラッグシステムを開発しました。親水性抗がん薬キダミド(CHI)は、膵酵素とカテプシンB(PDAC微小環境で過剰発現する主要酵素)に応答するアミド結合を介してSQに結合しました。この結合により両親性のSQ-CHIプロドラッグが生成され、さらに葉酸(FA)修飾ナノ粒子(FA-SQ-CHI NPs)に自己組み立てされました。最適化されたNPは、均一な流体力学直径173.3±1.5 nm、多分散指数(PDI)0.181±0.18、薬物負荷能力59.0%±0.77%、安定したゼータ電位±0.86 mVで-13.10を示しました。 in vitro 放出試験では、0.25%の膵腺素が存在すると、NPは72時間以内に累積薬物放出率が80.2%±4.22%に達した一方、酵素なしのpH調整バッファー(pH 4.5または7.4)では33%〜38%の放出にとどまりました。細胞取り込みアッセイでは、FA修飾が細胞内送達効率を大幅に向上させ、PDAC細胞(PSN-1およびCFPAC-1)では非標的NPと比較して1.8〜2.3倍の蛍光強度が12〜24時間で高かったことが確認されました。現在のプロトコルは、プロドラッグの合成と特性評価のための包括的な手法、酵素応答性放出速度論の in vitro 評価、治療効果と組織浸透の比較解析を提供し、標的的デリバリー、高薬物負荷、酵素誘発制御放出というナノキャリアの中核的な利点を強調しています。

概要

膵管腺癌(PDAC)は消化管の非常に悪性な腫瘍で、発症率は死亡率とほぼ同じで、5年生存率はわずか8%〜9%です。複雑な腫瘍微小環境(TME)はPDAC2の特徴です。主に異常な細胞外マトリックス(ECM)、活性化されたがん関連線維芽細胞(CAFs)、そして極めて免疫抑制的な細胞環境から構成されています。PDACのECMはタイプIコラーゲンが豊富です。その内容の変化と異常な構造は腫瘍の進行を促進し、予後不良と関連しています。CAFは最も豊富な間質細胞であり、マトリックス産生型myCAFや表現型可塑性を示す炎症性iCAFなど、機能的に異なるサブタイプで構成されています。

免疫学的には、PDAC TMEは腫瘍前性骨髄細胞が優勢です。抗腫瘍リンパ球は希少または機能不全です。成熟したBリンパ球も免疫抑制に寄与します3,4。これらの要素は総合的に複数の治療障壁を築きます。高い間質液圧を特徴とする高密度間質質は、治療薬の深部腫瘍領域への投与を著しく妨げる重要な貫通障壁を生み出し、化学療法薬の臨床効果を大幅に制限します5。したがって、この間質障壁を突破し膵臓腫瘍組織に深く浸透できる薬物送達システムの開発は極めて重要です。

近年、コレステロール生合成の自然前駆体であるスクアレン(SQ)は、その優れたバイオ安全性と生体適合性により大きな注目を集めています6。高度に疎水性であるため、SQは親水性薬物と結合して両親性プロドラッグを形成でき、これにより親水性小分子薬物の細胞膜との生体適合性が向上し、細胞の取り込み効率が向上します7。これまでの研究では、SQがシスプラチン、パクリタキセル、ジェムシタビンなどの様々な化学療法薬と共有結合し、高い薬物負荷能力を持つプロドラッグナノ粒子を形成し、固形腫瘍への薬物送達を改善することが示されています8,9。これらの特性は、SQが薬物送達システム開発における幅広い応用可能性を強調しています。

腫瘍標的化を促進するために、本研究では葉酸(FA)を標的リガンドとして用いています。FAは水溶性ビタミンで、1炭素代謝、生合成10、酸化還元恒常性11、メチル化反応12に不可欠です。FAがカルボキシル基を介してナノキャリアに結合することで、葉酸受容体(FR)への特異的な認識と結合が可能となり、その後受容体介在のエンドサイトーシスが行われます。腫瘍細胞の透過性と保持効果の向上を活用し、Zhengら14 はウエスタンブロッティングと免疫組織化学を用いて膵臓がん、正常膵臓、隣接組織、慢性膵炎における葉酸受容体α(FRα)発現を評価し、臨床病理学的特徴との相関を分析しました。FRαは膵臓がん症例の94.7%(72/76)で発現し、転移と相関していましたが、正常な膵組織では存在しませんでした。FA修飾ナノ粒子はFR陽性組織に選択的に蓄積できるため、分子標的治療を可能にします。

チダミド(CHI)は新しいヒストン脱アセチル酵素阻害剤です。前臨床研究では、膵臓がんや乳がんなどの固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示し、腫瘍細胞の薬剤耐性を逆転させることも示されています(15,16)。しかし、その強い親水性は腫瘍微小環境への浸透効率が低く、固形腫瘍組織内の分布が不十分であり、膵臓がんに対する臨床的治療の可能性を著しく制限しています5。チダミド(CHI)をモデル薬として用い、本研究はCHIとSQの結合とその後のFA修飾による自己組織化ナノ粒子の製剤を提案します。この戦略は、CHIが腫瘍微小環境への浸透力が低く、固形腫瘍組織内での最適分布が不十分であるという点を克服することで、膵臓がんに対する抗腫瘍効果を高めることを目的としています。さらに、膵臓がん細胞株におけるCHIのin vitro有効性を評価することで、このアプローチは、代表的な親水性小分子薬剤であるCHIの膵臓腫瘍微小環境への浸透性と細胞毒性効果を大幅に向上させ、膵臓がんにおけるCHI療法の指導に向けた実験的基盤を提供することが期待されています。

本研究では、膵臓がん治療のためのCHI-SQ-PEG-FA自己組織化プロドラッグナノ粒子の製造における実験手順を詳述しています。具体的には、CHI-SQ-PEG-FAナノ粒子の調製プロセスの最適化と特性評価、ならびに in vitro 薬物放出研究について述べています。このプロセスは、まず単一因子実験手法で製剤を最適化し、最適な粒子サイズと薬物負荷を決定すること、次に、UPLCおよびMTSアッセイを用いたナノ粒子の特性評価、最後に、 in vitro 共培養腫瘍球状モデルの確立。クマリン6(C6)を標的ナノ粒子の蛍光プローブとして用い、ナノ粒子の三次元腫瘍球体内での浸透と分布をさらに検証し、関連データを得ました。

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プロトコル

1. SQ-CHIおよびSQ-PEG-FAの合成

  1. SQ-CHI合成:1,1',2-トリスノルスクアレノ酸を120.4 mg(0.3 mmol)重みし、N-ジメチルホルムアミド(DMF)1 mLに溶解します。順にNHS(46 mg、0.4 mmol)とEDCI(72 mg、0.38 mmol)を加え、窒素保護のもとで90分間反応を進めます。
  2. チダミド(58.56 mg、0.15 mmol)を1 mLのDMFに溶かし、反応混合物に滴ずつ加えます。窒素気圧下で室温で72時間かき混ぜます。
  3. 完了後、5〜15 kPaの減圧下で溶媒を蒸発させて原油生成物を得る。DCM/MeOH(99:1、99:5、85:5)の勾配を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーで原油製品を精製します。
  4. SQ-CHIの構造検証:合成されたSQ-CHI産物をガラスバイアルに入れ、乾燥器で真空中24時間乾燥させます。生成物を約1 mLの重水素化クロロホルム(CDCl3)に溶解し、NMRサンプルチューブに移します。生成物の化学構造を確認する ために1HNMR分析を行うこと 17.
  5. SQ-PEG-FA合成:1,1',2-トリスノルスクアレン酸41.12 mgを35 μLのDMFに溶解。この溶液にN-ヒドロキシスクシニミド(NHS、15.71mg)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDCI、24.59 mg)を順次添加します。
  6. 窒素の大気で90分間反応を進めます。20 mgのFA-PEG-NH2 を35 μLのDMFに溶かし、反応混合物に滴ずつ加えます。
  7. できた混合物を室温で窒素下で72時間かき混ぜます。原油製品を3 kDaのMWCO超ろ過遠心分離機管で5,200 x g で30分間精製し、未反応の遊離酸を除去します。精製したSQ-PEG-FA複合水溶液をガラスバイアルに入れ、-50°Cで予備凍結します。 凍結前処理済みの溶液を凍結乾燥機で凍成乾燥させ、凍結乾燥粉末としてSQ-PEG-FA複合体を得ます。

2. SQ-PEG-FAの構造検証

  1. 凍虫化したSQ-PEG-FA複合体を2mLの遠心分離機管に入れ、さらに乾燥機で真空中24時間乾燥させます。生成物を約1 mLの重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO-d 6)に溶解し、NMRサンプルチューブに移します。複合体の化学構造を確認するために 1HNMR分析を行います。
  2. SQ-CHI-PEG-FA NPの調製および特性解析の最適化
  3. SQ-CHIを6.64 mgの重さで、絶対エタノール2 mLに溶かして3.32 mg/mL(4.3 μM)のストック溶液を準備します。
  4. SQ-CHIエタローン樹脂溶液(1、0.2、0.1、または0.05 mL)を、かき混ぜながら脱イオン水1mLに滴りずつ加えます。5分間かき混ぜた後、減圧蒸発でエタノールを除去します。得られた混合物を30分間ソニック処理してCHI-SQナノ粒子懸濁液を得る。ゼタサイザーを用いてナノ粒子の流体力学的直径および多分散指数(PDI)を測定し、最適な配合を特定します。
  5. 異なる攪拌時間(0分、5分、10分、または20分)の後に、0.1mLのSQ-CHIエタン酸ストック溶液を1mLの脱イオン水に滴りずつ加えます。攪拌期間終了後、減圧蒸発によるエタノール除去、30分間の超音波処理でCHI-SQナノ粒子懸浮液を得る。最適な攪拌時間を決定するために流体力学的直径とPDIを測定します。
  6. SQ-CHIエタノールストック溶液0.1mLを、5分間かき混ぜて1mLの脱イオン水に滴り加えます。かき混ぜた後、減圧蒸発でエタノールを除去します。生成された混合物を0分、5分、20分、30分の異なる時間でソニック処理し、CHI-SQナノ粒子懸濁液を得ます。最適な超音波測定時間を決定するために流体力学的直径とPDIを測定します。
  7. 上記の結果に基づいて最適な条件を確認してください。ここで、得られた水とストック溶液の体積比=10:1、攪拌時間=5分、音響処理時間=30分です。信頼性を確保するために、すべての実験を独立して三重に繰り返します。
  8. 他のパラメータは一定に保ちつつ、単一因子法を用いてください。以下の要因を順次変化させて、ナノ粒子の粒子サイズ分布やゼータ電位への影響を評価します:成分の質量比(SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0.05, 1:0.5, 1:0.7)、相体積比(水相:有機相 = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20)、および超音波処理時間(5, 15, 30, 45分)。
  9. 最適化されたプロトコルに従い、SQ-CHIとSQ-PEG-FAのストック溶液を決められた比率で混ぜます。この混合物を、絶え間ないかき混ぜのもとで脱イオン水に滴加えます。しっかり混ぜるために5分間続けてください。減圧蒸発でエタノールを除去し、30分間プローブソニックを行って最終的なCHI-SQ-PEG-FAナノ粒子懸浮液を得ます。
  10. レーザー粒子サイズアナライザーを用いた動的光散乱を用いて、ナノ粒子の流体力学的直径、サイズ分布(PDI)、ゼータポテンシャルを測定します。透過電子顕微鏡(TEM、150,000倍倍率)および走査型電子顕微鏡(SEM、80,000倍倍率)でナノ粒子の形態を観察してください。
  11. 超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)による薬物負荷含有量の決定
  12. クロマトグラフィー条件は以下の通りに設定されます:C18カラム(2.1 mm x 50 mm、1.7 μm);移動相:0.1%蟻酸水溶液 - アセトニトリル(75:25、V/V);検出波長:258 nm;流量:0.2 mL/min;柱温度:23°C;注入容量:5 μL;上映時間:10分。
  13. CHI-SQ-PEG-FA NP懸濁液を再構成し、7,500 x g で30分間遠心分離します。上清液を採取し、0.22μmの微分孔膜を通してろ過します。得られたろ過液を試験溶液として使用します。指定されたクロマトグラフィー条件下で試験溶液を注入し、分析します。ろ過液中のCHI濃度を測定して、ナノ粒子の薬物負荷量を計算します。

3. in vitro 薬物放出研究

  1. 新たに調製されたCHIストック溶液またはCHI-SQ-PEG-FAナノ粒子懸濁液の2 mLアリコートを、分子量カットオフ3 kDaの透析バッグに正確にピペットで移液します。
  2. 透析バッグを膵臓の濃度(0%、0.05%、0.1%、0.25%)を含む放出培地に浸します。あらかじめ決められた時間間隔(0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、72時間)で、1mLサンプルを放出培地から取り出し、すぐに同じ量の予温された新鮮培地に置き換えてシンク条件を維持します。
  3. UPLC法(セクション3で指定されたクロマトグラフィー条件)を用いてすべてのサンプルのCHI濃度を決定し、累積薬物放出量を計算します。
  4. 放出媒体として酢酸アンモニウムバッファー(pH 4.5)を使用してください。ナノ粒子懸濁液2 mLを透析バッグ(3 kDa)に正確にピペット移液します。透析バッグに直接カテプシンBの活性ユニット(0、0.7、1.4、2.8 U)を加えます。バッグを40mLの放出培地に浸し、37±0.5°C、75rpmの定温シェイカーで培養します。あらかじめ決められた時間点(0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、72時間)で、1mLのサンプルを抽出し、すぐに同じpHの新鮮で予温された培地に置き換えてシステム平衡を維持します。
  5. 採取したサンプルを0.22μmの微分孔膜でろ過します。UPLCでろ過液を分析し、薬物濃度を決定します。CHIの累積放出率を計算し、薬物放出プロファイルをプロットします。
  6. CHIストック溶液またはCHI-SQ-PEG-FA NP懸濁液のいずれかを2 mLのアリコートを透析バッグ(3 kDa MWCO)に正確にピペットで移管します。透析バッグを膵臓の濃度(0%、0.05%、0.1%、0.25%)を含む放出培地に浸します。あらかじめ決められた時間点(0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、72時間)に1 mLのサンプルを抽出し、すぐに同じ量の新鮮で予温された放出培地に置き換えてシンクの状態を維持します。
  7. UPLCでサンプル中の薬物濃度を定量化してください。累積薬物放出を計算し、放出曲線を生成します。
  8. PBSにおけるナノ粒子安定性の評価
  9. CHI-SQ-PEG-FA NPをPBS(pH 7.4)と1:20(v/v)の比率で混ぜます。混合物を37 ± 0.5°C、100 rpmの定温シェーカーで孵化します。1、3、6、12、18、24、30、36、42、48、72、96時間の試料を採取し、流体力学的直径とゼータポテンシャルを測定します。
  10. MTS法による細胞増殖アッセイ
  11. PSN-1膵臓がん細胞は完全なRPMI-1640培地で培養されました。対数成長段階の細胞は、0.25%トリプシンを37°Cで消化処理し、4-6×104 細胞/mLの密度で完全培地に再懸浮させました。懸濁液は1ウェルあたり100μLの96ウェルプレートにシードされ、37°C、5%CO2 インキュベーターで2時間前培養されて細胞の完全な接着を可能にしました。
  12. 元の培養培地を吸引してください。対照群(ブランク培養培地)とチダミド基の複数の濃度勾配(0.2、2、8、10、20、80 pM)を設定し、各グループに3つの複製井戸を設置します。各ウェルに100μLのブランクまたは薬物含有培地を加え、その後細胞プレートをインキュベーターに移して培養を継続します。実験群には、異なる濃度(0.2、2、8、10、20、80 pM)のSQ-PEG、遊離CHI、CHI-SQ-PEG、またはCHI-SQ-PEG-FA NPを含む新鮮培地100μLを投与し、対照群には等量の空白培地を投与します。さらに96時間の培養後、各ウェルから薬物含有培地を取り出します。
  13. 各ウェルに20μLのMTS作業液を加え、その後4時間のインキュベーションを行います。96ウェルプレートを15秒振って均質性を確認し、すぐにマイクロプレートリーダーを使って490 nmの波長で各ウェルの吸収(A値)を測定します。細胞増殖率は、薬剤処理群のOD値からブランクグループのOD値から差引き、結果をブランク培地群のOD値と空白グループのOD値の差で割り、さらに100倍で計算します。
  14. in vitro共培養腫瘍球体モデルの確立
  15. 対数成長段階のPSN-1細胞とHPSC細胞を2:7の比率で混合し、1ウェルあたり5,000セルの超低付着96ウェルプレートにシードします。腫瘍球状体形成後、球体を異なるナノ製剤(クマリン6標識CHI-SQ-PEG/C6 NPsおよびCHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs)またはDMSOで処理し、48時間、96時間、144時間にわたり共キュベートして薬剤の有効性を評価します。
  16. 培養後、各ウェルに等量の細胞生存性アッセイ試薬を加えます。プレートを軌道シェーカーに置き、15分間振って完全な溶解を確実にし、その後室温の暗闇で30分間インキュベーションします。
  17. 細胞溶解液を黒い96ウェルプレートに移します。多機能マイクロプレートリーダーを用いて562 nmの波長で化学発光信号を測定し、細胞の生存可能性を定量化します。
  18. ナノ粒子の細胞取り込みの研究
  19. クマリン6(C6)を蛍光プローブとして組み込んだ標的ナノ粒子(CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs)および非標的ナノ粒子(CHI-SQ-PEG/C6 NPs)を製製します。対数成長期のPSN-1細胞を24時間培養し、単一層を形成します。クマリン6をエタノールに溶けて200 μg/mLのストック溶液を製製します。溶液10μLをSQ-CHIおよびSQ-PEG-FA(またはSQ-PEG)と1:0.7の比率で混ぜ、その後、かき混ぜながら脱イオン水に滴下で注入します。5分間かき混ぜ、蒸発でエタノールを除去し、30分間ソニック処理します。最後に、超ろ過(3 kDa、12,000 rpm、20分)で精製し、アイテムを得ます。
  20. 細胞の処理は以下の通りです。実験群には遊離C6、CHI-SQ-PEG/C6 NP、またはCHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs(最終CHI濃度5 μmol/L、C6濃度2.6 μmol/L)を含む血清フリー培地を受け取り、対照群には同等のブランク培地を受け取ります。
  21. 4時間、12時間、24時間の潜伏後、薬物含有培地を吸引します。4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を用いた染色細胞核19。
  22. 蛍光顕微鏡(40倍、励起波長Ex=360 nm、放出波長Em=477 nm)での観察を行います。クマリン-6の蛍光強度を測定してナノ粒子の細胞内での取り込みを評価する。

4. 統計解析

  1. 本研究で提示されたデータを得るために、すべての実験は最低3回の重複を含んで実施してください。GraphPadのプリズムソフトウェアを使って統計を解析します。実験データを平均±標準誤差(SD)として提示し、適切な場合はStudent's t検定、一方変量分析(ワンウェイANOVA)、またはWilcoxon検定を用いてグループ間で比較します。統計的有意の閾値をP < 0.05に設定します。

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結果

本研究は、新規標的型ナノドラッグ送達システムであるチダミドスクアレンニル化プロドラッグベース自己組織化ナノ粒子(CHI-SQ-PEG-FA NPs)を設計し、体系的に評価することに成功しました。 図1)。CHI-SQ-PEG-FA NPを合成し(図2)、油と水の相比(図3A)、攪拌時間(図3B)、音響条件(図3C)など様々なパラメータが粒子サイズおよび多分散指数(PDI)に与える影響を体系的に評価しました。さらに、CHI-SQ-PEG NPおよびCHI-SQ-PEG-FA NPの形態的特徴を顕微鏡で観察しました(図4)。このシステムは、物理的特徴、薬物放出挙動(図5

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ディスカッション

本研究は、ナノ粒子自己組織化に基づくローウエストシステムの実装に関する実践的なステップバイステップガイドを提供します。本研究で得られた自己組織化ナノ粒子は、規則的な球状、良好な分散、均一な粒子サイズ、高い薬物負荷および封入効率を示し、満足のいく安定性を示しました。3次元腫瘍球体共培養モデル(PSN-1/HPSC)を用いてナノ粒子の浸透を評価し、葉酸修飾CHI-SQ-PEG-FA NPが腫瘍球体のコアにより効果的に浸透できることが明らかになりました。さらに、腫瘍球体内の保持時間は有意に延長されました。この保持力の向上は、スクアレノイル化後のCHIの脂溶性が著しく高まったことに起因します。これらのナノ粒子は腫瘍細胞のエンドサイトーシスと細胞間輸送を通じて細胞の取り込みを促進します。したがって、腫瘍微小環境への深い浸透を達成します22。同時に、葉酸を標的とする表面修飾は、葉酸受容体によるエンドサイトーシスを介して膵臓がん細胞によるナノ...

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

この研究は浙江省自然科学基金の助成金(LZ23H290001年、LY19H280001年)によって支援されました。中国国家自然科学基金助成金(82474338および82274364);浙江省三農村地区九党農業科学技術協力者プログラム(2025SNJF075);また、湖州科技大学院の公共福祉研究プロジェクト(2021GZ261)も参加しました。また、浙江省教育局の総合科学研究プロジェクト(Y202456442、2025YKJ10)にも参加しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシン-EDTAGibco(アメリカ)25200072
1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDCI)シグマ・オルドリッチ(アメリカ)E6383
2 mLのクライオジェニックバイアルコーニング(アメリカ)430488
96ウェル細胞培養プレートコーニング(アメリカ)3598
絶対エタノール中国国家製薬集団(中国薬剤)100092680
アセトン中国国家製薬集団(中国薬剤)32201-2.5L
アセトニトリルテディア(アメリカ)A998-4HPLCグレード
酢酸アンモニウム中国国家製薬集団(中国薬剤)10002861
無水硫酸ナトリウムシグマ・オルドリッチ(アメリカ)31481
生物学的セーフティキャビネットサーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ1380, 1332, 1356
細胞培養フラスココーニング(アメリカ)CLS430372
細胞培養インキュベーターサーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカHERA51901126
チダミデ(チカイ)深圳マイクロコアバイオテック有限公司(中国)純度>95%
Cytation 5マルチモードマイクロプレートリーダーバイオテック、アメリカCYT5MV
DF-101Sサーモスタティック磁気加熱攪拌器鄭州克長計器有限公司、中国
ジクロロメタン中国国家製薬集団(中国薬剤)80047318
ジメチルスルホキシド(DMSO)シグマ・オルドリッチ(アメリカ)D2650
ジオキサンアラジン(中国)D116156-5ml
DMEM媒体Gibco(アメリカ)12100046
ダルベッコリン酸塩緩衝塩水(DPBS)Gibco(アメリカ)14040141
エチルアセテート中国国家製薬集団(中国薬剤)10009460
エチルエーテル中国国家製薬集団(中国薬剤)
FA2004B電子天秤上海天美バランスインスメント有限公司、中国FA2004B
胎児用牛血清(FBS)Gibco(アメリカ)10099141C
葉酸-ポリ(エチレングリコール)-アミン(FA-PEG-NH2)上海鵬樹生物技術有限公司(中国)PS2-NFA-2000
蟻酸アラジン(中国)F112034HPLCグレード
フリーズドライヤーサーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ
ヒトカテプシンBシグマ・オルドリッチ(アメリカ)SRP0289
ヒト膵臓がん細胞株(PSN-1、CFPAC-1)アメリカタイプカルチャーコレクション(ATCC)CRL-3211、CRL-1918
ヒト膵星状細胞(HPaStec、HPSC)アメリカタイプカルチャーコレクション(ATCC)
ヒトトリプシンシグマ・オルドリッチ(アメリカ)
塩酸中国国家製薬集団(中国薬剤)CFSR-10011008
逆立顕微鏡オリンパス、日本IX83
イスコーブの修正ドゥルベッコ媒介(IMDM)Gibco(アメリカ)12440053
IX 1000 ボルテックスミキサー 杭州瑞成計器有限公司、中国第9 1000年
メタノール中国国家製薬集団(中国薬剤)M433287-10L
メタノール テディア(アメリカ)MS1922-001HPLCグレード
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5/2.0 mL)アクシジェン(アメリカ)MCT-150-C
マイクロピペット(20、100、1000 & Mu;L)サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ4642050, 4642070, 4642090
Mill-Q水質浄化システム ミリポア、アメリカZR0Q00800
 MTSアッセイキット(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)プロメガ(アメリカ)G3582
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)アラジン(中国)
N-ブロモスクシニミド(NBS)シグマ・オルドリッチ(アメリカ)B81255
N-ヒドロキシスクシニミド(NHS)シグマ・オルドリッチ(アメリカ)56480
オプティマ・マックス超遠心分離機など;ベックマン、アメリカ合衆国393490
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液Gibco(アメリカ)15140-122
周期酸シグマ・オルドリッチ(アメリカ)P7875
石油エーテル中国国家製薬集団(中国薬剤)
フェナジンメトスルフェート(PMS)シグマ・オルドリッチ(アメリカ)3180806
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Gibco(アメリカ)70011069
ポリ(エチレングリコール)-アミン(PEG-NH<サブ>2)上海鵬樹生物技術有限公司(中国)PG2-AM-20k
RPMI-1640 ミディアムGibco(アメリカ)31800022
シリカゲルパウダーシグマ・オルドリッチ(アメリカ)53698300メッシュ
炭酸水素ナトリウムシグマ・オルドリッチ(アメリカ)401676
塩化ナトリウム中国国家製薬集団(中国薬剤)10019318
二クロム酸ナトリウム二水和物シグマ・オルドリッチ(アメリカ)1.93689
スクアレンシグマ・オルドリッチ(アメリカ)Y0002131
無菌遠心分離機チューブ(15 mLおよび50 mL)コーニング(アメリカ)430791, 430828
硫酸中国国家製薬集団(中国薬剤)10021618
テトラヒドロフラン中国国家製薬集団(中国薬剤)34865-4X4L分析等級
超ろ過遠心管(分子量カットオフ:3.5 kDa)ベックマン、アメリカ合衆国344088

参考文献

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