内在コントラストを用いたDNA分子の分光超分解能イメージング

サマリー

このプロトコルは、DNA内在蛍光スペクトルのサンプル準備、データ収集、解析に関する詳細な操作を提供します。

要約

超分解能イメージングは、ナノスケールでの構造的詳細を明らかにすることで生物学研究に革命をもたらしました。ほとんどの光学超分解能手法は生体分子の蛍光標識に依存しており、これにより分子種の特異的タグ付けは可能ですが、細胞機能を妨げたり、リンカー分子からの不正確さを生じさせたり、個々のDNA分子スケールでのクロマチンイメージングに必要な一貫した高標識密度を提供できなくなります。ナノメートル解像度でラベルフリーの 現場 ゲノムイメージングを可能にする技術は、生物学に深い影響を与えるでしょう。ここでは、DNAの内在蛍光を利用して分光単一分子局在顕微鏡(sSMLM)を行うプロトコルを紹介します。プロトコルはサンプルの準備、データ収集、スペクトル解析を詳細に説明しています。簡単に言えば、ポリヌクレオチド溶液をガラスに沈着させて数時間乾燥させることで薄いDNAゲルが作られます。ゲル形成後、sSMLMを用いてイメージングバッファーの存在下で試料を画像化します。記録されたデータセットは、空間的な局在性を提供するゼロ次画像と、各局在化の放射スペクトルを符号化する一次画像で構成されています。零次データから空間再構成が生成され、その後一階信号から対応するスペクトルが抽出されます。最後に、複数の励起波長と長さ、配列、組成の異なるDNA分子を用いてこの手法の実現可能性を実証します。

概要

超分解能蛍光顕微鏡技術――構造化照明顕微鏡(SIM)、刺激放出空虚化顕微鏡(STED)、および光活性化局在顕微鏡(PALM)や確率的光学再構成顕微鏡(STORM)などの単分子局在顕微鏡(SMLM)アプローチ――は、回折限界1,2,3,4をはるかに超えて光学顕微鏡の解像度を押し上げています^。5,6,7は、クロマチン^8,9,10,11,12のナノスケール組織への前例のないアクセスを可能にしました。しかし、現在の染色法はDNA自体ではなくDNA関連タンパク質の標識に依存しているか、微分子染料を使用しており、これによりネイティブクロマチンの配置を乱し細胞の生存能力を損なう可能性があります^13,14。これらの制約から、ネイティブで摂動のない条件下でのラベルフリー光学超分解能イメージング法の開発は非常に望ましいものです。ここで提示されるプロトコルは、合成精製の単鎖または二本鎖DNAヌクレオチドを対象としており、内在蛍光が確実に検出できる場合に適用されます。固定細胞や生細胞での核DNA分子のイメージングには最適化されていません。

核酸は、極めて低い量子収率(UV励起下で約10^⁻⁻⁴)と室温¹⁵での超高速蛍光崩壊のため、長らく非蛍光性と見なされていたため、DNAの本質蛍光(主に蛍光寿命)の研究はフェムト秒分光法が開発されるまでは稀でした。ヌクレオチドは紫外線照射下で蛍光を弱く発光する一方、可視光域での吸収はかなり弱いことはよく知られています。それにもかかわらず、最近、生理学的に重要な濃度で未修飾核酸の可視光励起蛍光が存在することが観察^{されました。}この現象は、ヌクレオチドの光化学的研究の多くが希薄溶液(10-100 μM^)で行われていたため、見落とされていた可能性があります。一方、核や染色体ではDNA濃度が0.1-1 M 21,22,23に達することがあるからです。さらに重要なのは、可視光下での確率的蛍光スイッチングが観察^され、未修飾核酸を局所化ベースの超分解能顕微鏡の内因性造影剤として利用する基盤が築かれたことです。

可視光励起下で生理学的濃度の単一配列を持つヌクレオチドモノマーおよび単鎖DNA分子の光化学的特性が探究^{されています。}また、これらのDNA分子が確率的な蛍光スイッチング特性を持つことも示されており、これは異なる劣化条件下でのヌクレオチドの蛍光回復を調べることで基底状態空虚(^GSD)6,7の理論とよく整合しています。さらに、ヌクレオチドは比較的高い量子収率と低い系間交差確率を示すため、単一分子放出イベントの光子数や点滅持続時間はSTORMの一般的な外因性染料(例:Alexa Fluor 647)と同等であり、異なるスペ^{クトルを示し、DNA}は高解像度イメージングに理想的な内在造影剤となっています。さらに、前節で説明したスペクトル回帰アルゴリズムの実装により、ポリヌクレオチドおよび線状単鎖DNA繊維の10ナノメートル未満の超分解能イメージング^{が可能になります。}

DNA固有の蛍光の全スペクトルを捉えるために、スペクトル検出にはデュアルウェッジプリズム(DWP)を使用し、これにより透過損失と波面誤差28,29,30を最小限に抑えた高スループットの単一分子分光分析とイメージングを同時に行い、自動^{データ処理用の}オープンソース分光SMLM解析ソフトウェア(RainbowSTORM)を用いています。.この能力を基に、分光検出と専用スペクトル解析パイプラインを統合したマルチレーザーSMLMプラットフォームを開発しました。ここで紹介するプロトコルは、サンプルの準備、データ取得、解析を含み、単一分子局在顕微鏡におけるDNA固有の蛍光を活用するための再現可能なワークフローを提供します。単鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖DNA分子の内在コントラストによるイメージングの概念実証研究を可能にするだけでなく、このアプローチはDNAの固有蛍光に基づく配列予測と計算手法を組み合わせた、自然でラベルのない条件下でのDNAイメージングにおけるより広範な応用の基盤を築きました。

プロトコル

1. DNAゲルサンプルの調製(図1A)

1. DNAサンプル(オリゴヌクレオチドまたは二本鎖DNAのいずれか)粉末をヌクレアーゼフリー脱イオン水に溶解し、最終濃度100 mMで保存し、ストック溶液を-4°Cで保存します。
2. 繰り返しの凍結融解サイクルを最小限に抑えるために5μLのアリコートを準備します。冷凍アリコートを使う場合は、室温で5〜15分間解凍してください(容量によります)。
3. ガラススライドを実験室用ワイプで優しく拭き取ります。100 mMのDNA分子溶液を5 μLピペットで洗浄したばかりのガラススライドに移し、1〜3時間蒸発させてDNAゲルを形成します。
4. 安全のために、この工程はフムフード内で操作してください。 材料表に従ってイメージングバッファを準備してください。βメルカプトエタノールバッファーおよびDABCOバッファーは、DNA分子の確率的光スイッチングを支持する効果が検証されました。
5. 安全のために、この工程はフムフード内で操作してください。イメージングバッファー5μLをDNAゲルに加え、画像診断直前にカバースリップをその上に置きます。覆われたサンプルの中に気泡がある可能性があります。ピンセットを使って覆われたサンプルの中の気泡を取り除きます。

2. sSMLM システムの較正およびデータ取得(図1B)

1. 分光SMLM システム³³の次の較正のために、穴径100 nm、間隔4μmの8行×5列に並べた製作済みナノホールアレイを準備します。
   注:または、アメリカ空軍(USAF)の1951年解像度チャート(R3L1S4N)もスペクトルキャリブレーション³³に使用できます。
   1. 連続金属スパッタリングと集光イオンビーム(FIB)ミリングによってナノホールアレイを生成します。まず、150nm厚のアルミニウムフィルムを22×22mmのホウケイ酸ガラスカバースリップに、直流スパッタリング(75W)で、20立方センチメートル毎分(SCCM)アルゴン流量、3 mTorrで配置します。
   2. FIBミリングを用いてアルミニウム層に5×8ナノホールアレイをパターン化し、加速電圧30 kVで動作させます。
2. 分光SMLMシステム(図2)を起動し、カメラの正面に直接狭帯域フィルター(532 nm、580 nm、633 nm、680 nm、750 nm)を挿入し、白色光源(例:顕微鏡ランプ)で校正試料を照らします。
3. 各フィルターで10フレームを集めましょう。ランプの低輝度と近赤外領域でのカメラ効率の低下により、532 nm、580 nm、633 nm、680 nmの露出時間を200 ms、750 nmで2000 msに設定します(図3)。
4. DNAゲルサンプルを顕微鏡に載せ、カバースリップ側が対物レンズに向いていることを確認してください。そしてカメラソフトを開いてデータ取得を行います。
5. 自動フォーカストラッキングシステムの助けを借りて適切なZ位置を特定し、明確な確率的な点滅を確実に確認してください。このステップは非常に重要で、DNAゲルサンプルには細胞構造などの明確な形態的手がかりがなく、適切な信号を探すのが難しいため、忍耐が必要です。
6. 対物レンズがカバースリップの縁に触れないように注意してください。これがバッファーの浸漬油への漏れを引き起こし、トラッキングに干渉する恐れがあります。
7. 典型的な照明出力5kW/cm²、露光時間30msで10,000〜30,000枚のフレームを取得します。必要に応じてフレーム数、照明出力、露光時間を調整してください。取得後、ソフトウェアはデフォルトでデータをnd2形式で保存します。
8. 実験終了後、ガラススライドを認可された鋭器廃棄物容器(例:割れたガラスや鋭器処分容器)に処分し、残りのバッファーはすべて機関の安全ガイドラインに従い指定された化学液廃棄容器に捨ててください。

3. 校正および分光データの解析(図1C)

1. Bio-Formatsプラグインを使って、取得したDNAサンプルの生画像スタックをFIJI(Windows 64ビット)に読み込みます。
2. スタックから最小射影を差し引いて背景を差し引いたデータセットを得て、スペクトル解析用に保存します。ロードされたRAW画像スタックについては、 Zプロジェクト>画像>スタック を選び、投影タイプで 最小強度 を選択してください。次に「 Process > Image計算機 」を選択して、RAW画像スタックから最小投影を差し引いてTIFFとして保存します。
3. ThunderSTORMプラグイン(バージョン1.3)を使ってゼロ次RAW画像スタックのローカライゼーション識別を行います。適切なパラメータ(例:しきい値=1.2×標準(Wave.F1)、シグマ=1.5、フィット半径=3)を用いてゼロ次画像を再構成し、放出イベント座標(単位:nm)を抽出します。トリミングされたゼロ次RAW画像スタックについては、 ThunderSTORM>Pluginを選択し> Run analysisを選びます。
4. FIJIとオープンソースソフトウェアRainbowSTORM(GitHubリンク³²、MATLABバージョンは2020bより新しいもの)を使って、水平・垂直シフトおよび波長^31,32の関係を解析します。
   1. ThunderSTORMプラグインを使って5つの波長のキャリブレーション画像の局在識別を行います。適切なパラメータ(例:しきい値=5×標準(Wave.F1)、シグマ=1.5、フィット半径=3)を用いて、ナノホールの局在をゼロ次で再構築し、そのスペクトル局在を一次で再現します。
   2. 閾値(例:5〜10倍の標準(Wave.F1)の範囲)を調整し、各キャリブレーション画像に80のローカライゼーションができるまで調整します。
   3. RainbowSTORMを実行し、「 スペクトルキャリブレーション」をクリックし>ブラウズ し、前のステップで各キャリブレーション波長(532 nm、580 nm、633 nm、680 nm、750 nm)のCSVファイルを読み込みます。「 キャリブレーションファイルを保存」をクリックします。
5. ナノメートル座標をピクセル座標に変換し、較正(図4)で決定されたゼロ次から一次への水平および垂直シフトに基づいて対応するスペクトルウィンドウにマッピングすることで、DNA固有の蛍光の全スペクトルを測定します。
   1. カスタマイズされたPython^{scripts 34} (バージョン3.11.7)を使って、以下の手順で全スペクトルデータを抽出してください。
   2. ステップ3.2の背景引き算画像スタック(.tiff)、ステップ3.3で生成されたローカリゼーションCSVファイル(.csv)、およびステップ3.4のキャリブレーションファイル(.mat)の正しいファイルパスを設定してください。
   3. 3D DWPで取得する488 nmデータの水平シフトとして900〜950ピクセルを使用し、484〜588 nmのスペクトルウィンドウに対応し、500〜550 nmフィルターの範囲よりやや広い範囲でカバーを確保します。
   4. 3D DWPで取得する532 nmデータの水平シフトとして925〜984ピクセルを使用し、525〜750 nmのスペクトルウィンドウに対応し、これも590〜650 nmフィルターの範囲よりも広いものが選ばれます。
   5. 3D DWPでは488 nmと532 nmのデータの両方で、垂直シフトとして23ピクセルを使いましょう。
      上記の値はRainbowSTORMを用いて得られたスペクトルキャリブレーションカーブから導出されました。全スペクトル測定用のPythonスクリプトは³⁴で入手可能です。
6. 非線形スペクトルを線形化し、3^階 多項式フィッティングを用いて後続解析(比較、分類など)を行います(図3)。

結果

DNAゲル形成に1時間かかると仮定すると、サンプル準備からデータ取得、解析までの全過程は約120分かかります(図1)。解凍、ゲル形成、スペクトル校正の合計時間は約90分に固定されており、実験内の画像やサンプルの数に関わらずです。効率を最大化するために、1つのセッションで複数のサンプルにまたがる複数の画像スタックを収集することを推奨します。

DWP後に得られた代表的なリアルタイム画像は 図1B および 図3Aに示されており、蛍光信号は0次(左、空間情報を含む)と1次(右、スペクトル情報を含む)に分割されています。 図1Bでは、画像は2D DWP構成で取得されており、ゼロ次画像と一次画像の間隔は比較的小さいです。対照的に 、図3A は3D DWPで収集されたデータを示しており、複面3Dイメージングに必要な工学的光経路差のため、2つの回折次数はより広く分離されています。 図1C、 図3、 図4 に示されたすべてのデータは3D DWP構成で収集されました。2Dと3Dイメージングの選択は実験目的によります。合成DNAサンプルの内在蛍光スペクトル測定では、関連する三次元構造特徴が欠けているため2D DWPが一般的に好まれますが、軸方向情報を求める場合には3D DWP構成も利用可能です。

これらの代表的な結果は、DWPベースのイメージングプラットフォームが個々のDNA分子から空間的局在および放射スペクトルをリアルタイムで同時に解消する中核的な能力を示しています。適切なシステム性能は、ゼロ次空間像と一階スペクトル分散像の明確かつ安定した分離によって示されており、零次における各単一分子の局在は一階の異なるスペクトルトレースに対応します。定量的スペクトル解析は、ゼロ次画像中の孤立した単一分子イベントを特定し、関連する一次信号の相対ピクセルシフトを測定し、校正されたマッピング関数を用いてこのシフトを波長に変換することで行われます。ピクセル変位と発光波長の関係は非線形であるため、^{生データから}線形発光スペクトルを正確に再構成するために3階多項式フィッティングが適用されます。得られた単一分子スペクトルは、機械学習や深層学習モデルを含む計算解析パイプラインにさらに統合され、異なる照明条件や光物理状態下での固有の蛍光シグネチャーに基づくDNA配列や分子構造のスペクトル分類や推論が可能になります。

このプロトコルで示されたすべてのデータは、βメルカプトエタノールベースのイメージングバッファ³⁵を用いて収集されました。原理的には、蛍光素の光スイッチング挙動を強化するイメージングバッファはこのアプローチと互換性があるべきであり、例としてDABCOベースのイメージングバッファ³⁶が挙げられます。試験対象のDNA分子には、20塩基の単一鎖A、G、C、T、が含まれます。40基底の単一鎖ACチェーン(A₁C₁、A₅C₅、A₁₀C₁₀、A₂₀C₂₀);単鎖の5、8、12、16塩基のグアニン;20塩基対二本鎖GCおよびAT(詳細は 材料表 を参照)。20塩基および40塩基のDNA構成要素の選択は、40塩基DNA鎖が40 x 3.4 = 13.6 nm未満のコンパクトな立体構造を採用し、再構成されたSMLM画像の解像度限界を下回るという観察に基づいています。励起波長(488 nmおよび532 nm)は特定の配列に特有に最適化されたわけではなく、どちらの波長でも異なる塩基組成や立体構造状態で固有DNA蛍光を強健に検出できることを示すために選ばれました。 補足図1 に示されたようにイメージングバッファーを試験し、ほとんど確率的なブリンク信号は検出されず、バッファー成分やガラス表面処理は除外されました。DNAゲル+イメージングバッファーだけがかなりの数のまばたきを示しました。ガラススライドとカバースリップは清潔で丁寧に取り扱われ、サンプルジェルは密閉された環境で形成されました。したがって、検出される信号は不純物や基質の自己蛍光から来る可能性は低いです。乾燥ゲルとDNA溶液の信号も測定しましたが、有意な違いはなく、乾燥中の光化学的なアーティファクトが主な信号源ではありません。光分解生成物は通常、広いスペクトルを示し、点滅特性を持たず、本研究ではそのような現象は観察されていません。検出の定量的限界は、局在化の最小光子数によって反映され、30〜50[光子数]です。この値は、固定細胞内のAF647標識H3K9me3のようなDNAサンプルや標識系でも同じです。DNA固有の蛍光の平均局在精度は約15〜25 nmであり、AF647は約10〜15 nmです。

2Dシナリオでは、再構成されたSMLM画像のピクセルサイズは22nmです。確率的放出の局在精度の平均は~20 nmであり、これは単一分子が局在する信頼区間を表します。しかし、内在蛍光を検査したサンプルには生物学的構造がないため、構造の分解能は解釈できません。コヒーレント・ラマン散乱顕微鏡の分解能は250〜300 nm³⁷と報告されており、紫外線二光子の分解能は300 nm³⁸です。コヒーレント・ラマン散乱イメージングの信号対雑音比は10 - 100³⁹ですが、UV 2光子顕微鏡^40,41では2 - 20(しばしば信号対標準偏差、SSDR)です。sSMLM(sSMLM)を用いたDNA固有蛍光のSNRは、光子数の少さとカメラ検出ノイズによる制約により約5です。

図1:推定時間付きのワークフロー。 (A) サンプル準備はストックの解凍、DNAゲルの準備、イメージングバッファーの追加を含みます。総時間はサンプルや環境によって1〜3時間の範囲で変動します。(B) 各取得には、特別に設計されたナノホールアレイサンプルを用いた校正プロセスが必要です。キャリブレーションの総時間は約20分、1つの画像スタックのデータ取得時間はサンプル探索を含めて約10分(10,000フレーム、露光時間50ms)となります。(C) 解析パイプラインには、PythonによるFIJI前処理とスペクトル解析が含まれます。FIJIの前処理は約10分で終わり、確立されたコードではスペクトル解析が速いです。提示されたスペクトルは16塩基グアニンから採取されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:光学回路図。 4本のレーザーライン(405 nm、488 nm、532 nm、647 nm)はレーザーアライメントによって倒立顕微鏡に導かれ、システムは安定し操作が容易です。DWPはsCMOSカメラの直前に設置され、分光単一分子検出を可能にします。DWPのキャリブレーション時には、カメラとDWPの間にフィルターホイールが挿入されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:スペクトル校正。 使用される校正波長は532 nm、580 nm、633 nm、680 nm、750 nmです。DWPの後、カメラの前にこれらの中心波長を持つ狭帯域フィルターを順次配置することで、異なる波長の水平および垂直方向のシフトを測定し、ピクセル位置と波長間のキャリブレーション曲線をマッピングすることが可能になります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:532 nmおよび488 nm励起下で選ばれた二本鎖および単鎖DNA分子のスペクトル。 (A - B) GC_alterの非線形および線形スペクトル。これは二本鎖DNA分子の一種であり、両鎖は20塩基5'-GCGCGCGGCGGCGC-3'です。強調された緑色のスペクトルは平均曲線を示しています。(C - D)A₁₀C₁₀の非線形および線形スペクトルは、40塩基長と重複10アデニンと10シトシン(5'- AAAAAAAAACCCCCCCCCCAAAAAAAAACCCCCCCCC-3')を持つ単鎖DNA分子の一種を指します。強調された青いスペクトルは平均曲線を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:内在性DNA蛍光の対照実験。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、単鎖および二本鎖DNA分子の両方からDNA固有の蛍光の全スペクトルをキャプチャするプロトコルを初めて提示し、サンプル準備からデータ取得、計算解析までのワークフローを網羅します。このプロトコルにより、外因性プローブではなく内在蛍光を活用することで、ラベルフリーのDNA分子の超分解能イメージングが可能になります。原則として、このアプローチは化学的標識や抗体ベースの増幅を回避できるため、固定細胞や潜在的に生細胞イメージングにも拡張可能です。核内のクロマチンはDNA、RNA、さまざまなタンパク質を含み、DNAゲルよりもはるかに複雑なシステムです。現在、DNA分子からの光子数が少ないため、固定・生細胞の核内からの確率放出は困難です。しかし、単離染色体、すなわち核については、DNA固有の蛍光シグナルが^16、24、27と報告されていました。しかし、現行の形態では、合成DNAサンプルを用いたin vitro環境に限定されています。比較すると、免疫染色による核DNAやクロマチンの標識は通常、クエンチング、ブロッキング、一次抗体および二次抗体のインキュベーションを含む長時間の多段階手順を伴い、数時間(標的ごとに約5時間)かかることもあります^12,42。これにより、実験の複雑さとネイティブクロマチン構造への潜在的な乱れが生じます。外因性ラベルを排除することで、内在性蛍光ベースのイメージングはサンプル準備時間を大幅に短縮するだけでなく、かさばる蛍光プローブや抗体に伴う構造的乱れや連鎖誤差を回避し、より忠実なナノスケールのDNA局在化を可能にします。

ラベルフリーで概念的にもシンプルであるにもかかわらず、このプロトコルの成功裏の実装にはいくつかの重要な実験的細部への注意が必要です。例えば、サンプル準備時にはDNAゲル形成に十分な時間がないため、検出可能な単一分子の局在数は完全に形成されたゲルに比べて減少します。通常、ジェルが形成されるまでに約1.5時間かかります。溶液が完全に乾いていなければ、もう少し待ってください。22×22mmのカバースリップの場合、イメージングバッファは5μLで十分ですが、バッファーの容量が大きいと漏れが生じ、対物レンズの油浸接界面が乱れ、イメージング性能に悪影響を及ぼすことがあります。漏れが発生した場合は、検査用ワイプで慎重に除去できます。フォーカスしながら、最も低いZ位置から徐々に目標を上げていきます。対物レンズが浸漬油に作用した後、微調整モードを用いて焦点面を頻度で確率的に単一分子放出する現象を特定します。大きなゲルクラスターが重なり合う一次スペクトルの集約信号を生成する場合は、別のイメージング領域を選択します。

利点がある一方で、このプロトコルには適用性や性能を評価する際に考慮すべき重要な制限がいくつかあります。第一に、正確なスペクトル抽出は個々の単一分子イベント間の十分な空間的分離に依存します。大きなDNAゲルクラスターや高分子集合体のような高局在密度は、一次スペクトル痕跡の重複を引き起こし、信頼性の高いスペクトル再構築を複雑または妨げることがあります。第二に、この手法は光学的アライメントや焦点安定性に敏感であり、デュアルウェッジプリズムの小さなずれや最適な焦点面からのずれが波長校正に系統的な誤差をもたらし、信号対雑音比を低下させることがあります。第三に、プロトコルは現在スペクトルデミクスティングを実装しておらず、分子密度の高いサンプルや複数のスペクトル的に重なる種での使用が制限されています。これらの要素は総合的に、この手法の実用的な運用体制を定義しており、より複雑または混雑した生物学的システムにプロトコルを拡張する際には慎重に考慮されるべきです。

このプロトコルでは、RainbowSTORMはスペクトルキャリブレーションのみに使用されますが、2D/3Dキャリブレーション、sSMLMデータ解析、画像再構築のための強力なツールも提供しています。このような解析ツールは、分光超分解能イメージングにおける空間位置情報とスペクトル読み取りをリンクさせるのに適しており、今後このプロトコルの拡張にも活用される可能性があります。最後に、このプロトコルはRNAやチューブリンなど他の生物的高分子^43、44、⁴⁵にも実現可能である可能性があります。検出されたスペクトルはさらに深層学習モデル⁴⁶などの計算モデルに入力され、分類を行うことができ、異なる照明下での内在スペクトルや光物理的特性から配列や分子構造を予測できます。この研究はまた、外部標識や天然構造の変性を回避する、ラベルフリーの分子特異的クロマチンイメージングの道を開きます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イメージング用488 nm発光フィルター	クロマ・テクノロジー社	ET525/50M
校正用の532 nmバンドパスフィルター	ソーラブ	FL532-3
イメージング用の532 nm放出フィルター	クロマ・テクノロジー社	ET620/60M
580 nmバンドパスフィルターによる校正	ソーラブ	FB580-10
キャリブレーション用の633 nmバンドパスフィルター	ソーラブ	FL632.8-3
校正用の680 nmバンドパスフィルタ	ソーラブ	FB680-10
キャリブレーション用の750 nmバンドパスフィルター	ソーラブ	FB750-10
ベータ-メルカプトエタノール	シグマ	M6250
BMEイメージングバッファ	NA	NA	7 & mu;L・グロックス、7 & mu;Lベータメルカプトエタノールおよび690 & mu;Lグルコースバッファー
牛肝臓由来のカタラーゼ	シグマ	C100
DABCO(1,4-ジアゾビシクロ-(2.2.2)-オクタン)	シグマ	D27802
DABCOイメージングバッファ	NA	NA	65 mM DABCO+30 mM 硫酸ナトリウム + 30 mM DTT 1 M DNAseではRNAseフリーの脱イオン水が使われています。亜硫酸ナトリウムはPBSに10&10倍溶けるべきです。イメージングバッファを作成する前に1 Mまで。
分光SMLMのためのDNAデプレックス	IDT	NA	20塩基対の二本鎖GC_alter、GC_conti、AT_alter、AT_conti. 例:GC_alterは両方の鎖を5'としています- GCGCGCGGGGGGCGCC - 3フィート;GC_conti 1本のストランドが5フィートです- ググググ - 3フィートもう1つは5フィート- CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3' すべての試料はHPLC規格です。
DNAオリゴヌクレオチド/二本鎖DNA	IDT	NA
分光SMLMにおけるDNAオリゴ	IDT	NA	20基座A、G、C、T;40基底単一鎖交流チェーン(A1C1、A5C5、A10C10、A20C20); 単鎖5、8、12、16塩基グアニン。 例:A10C10は 5'- AAAAAAAAACCCC CCCCCAAAAAAAAAAAA AACCCCCCCC - 3' すべてのサンプルはHPLC規格です。
DNase/RNaseフリー蒸留水	インビトロジェン	10977015
DTT(DL-ジチオスライトール)	シグマ	43816
グロックス	NA	NA	14 mgグルコースオキシダーゼ、50 & Mu;Lカタラーゼ(17 mg/ml)+200 & μ;LバッファーAは10 mMトリス(pH 8.0)、50 mM NaCl.
グルコース緩衝剤	NA	NA	50 mM Tris(pH 8.0)、50 mM NaCl、10%グルコース & nbsp;
グルコース酸化酵素	シグマ	G7141
グルコース、粉末	サーモ・フィッシャー	15023021
PBS(10X)	サーモ・フィッシャー	J62036。K3
PBS(1X)	ギブコ	10010023
塩化ナトリウム	サーモ・フィッシャー	424290010
亜硫酸ナトリウム	シグマ	S0505
トリス(1M) pH 8.0	インビトロジェン	AM9856