ポリジメチルシロキサン(PDMS)チップデバイスの膜用防水シリコーン系シールを製造するための新しいシーリングプロトコル。ラボでのチップモデルの構築や小規模なチッププラットフォーム開発を目的としています。このプロトコルはプラスチックとネイティブ組織膜を用いて実証します。この手順にはPDMS、トルエン、型、膜、真空チャンバーのみが必要です。
この記事について
サマリー
要約
オルガン・オン・チッププラットフォームは、生物医学研究の急速に成長している分野です。この分野の拡大により、さまざまな材料やその構造・応用方法が生まれました。商業提供や学術開発のデバイス数は増加し続けていますが、オルガン・オン・チップ分野に参入する新規研究者にとっては大きな一歩がまだ必要です。新規および継続的なチップ技術における中心的な課題の一つは、チップデバイスの安全かつ漏れのないシールを実現することです。本記事では、シリコーンチップと異なる材料の3つの培養膜間に信頼性の高い防水接続を実現するチップシーリングワークフローを提示し、チップ開発への新たな道筋を提供します。提示された手順は、限られた入力材料で新しいチップ開発に利用可能であり、空気液インターフェース(ALI)オルガンオンチップを提供します。これらのチップは、多孔質膜を通し、頂端が空気にさらされる細胞培養を目的としており、例えば腸、皮膚、またはここで示したような気道オンチップのケースで行われます。市販のプラスチック膜や豚の細胞外マトリックス(ECM)足場への結合を示す2種類の異なるチップ型3Dデザインを提供しています。このエアウェイ・オン・チップは社内で製造可能です。ここでは直面するさまざまなハードルを紹介し、かつてAirway-on-Chipとして使われていた例も紹介しています。この新しいシーリング手法は、トルエンで薄めたポリジメチルシロキサン(PDMS)モルタルを真空で除去し、多孔質のプラスチックまたはネイティブECM膜表面に埋め込まれた薄く強力なシリコーンコーティングを除去するものです。この手法の第二の新しさは、PDMSモルタルを室温で硬化させ、密封する材料間の熱膨張の違いによる膜の破壊を防ぐことです。これにより、試験された材料を結合する幅広い技術が生まれ、内部培養膜を備えた多チャンバーPDMSチップが生成されます。
概要
オルガン・オン・チップデバイスは生物医学研究の基盤となりつつあり、世界中の研究室でさまざまな商用およびオープンアクセスモデルが開発されています。これらのモデルが研究の重要な一部となり、従来の静的プラスチックモデルや動物モデル2,3に取って代わり続ける中で、世界中のさまざまな背景を持つ研究者が容易にアクセスし利用できることがますます重要になっています。その中心には、原材料や製造コストに依存しないカスタマイズされた小ロット開発の実現が容易であり、特に非商用または学術モデルにおいて4。
オンチップ技術における最大の課題の一つは、フロー中に漏れなくチップを安全にシールすることです。チップデバイスにおけるリークテストに関する最近のレビューでは、チャンバー間や環境への漏れが、モデルおよび実験の故障のトップモードとして、産業界および学術界の両方で明らかになりました。シールが成功しなかった理由はいくつかあります。装置の小型、加えられた流量と圧力、そして主に異なる材料が層で密封され、異なるプロセスで橋接されていること6。チッププラットフォームで培養膜として使用される材料の種類は、その用途の範囲に匹敵し、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリカーボネート(PC)、PDMS、ECM膜などが含まれます。そのため、これらの異なる材料を最終的なデバイスに結合するためのさまざまな手順や処理法があります。これらの手順には、接着剤/PDMSによる圧縮、プラズマ媒介のシラン化学、構造物の化学的官能化、電気紡績、そしてモデル7に関わる材料に応じて気化溶媒結合が含まれます。これらのプロセスには異なるスキルセットや実験環境が必要であり、オンチップ研究の学術的アクセス性に一定の制約が生じています。商用システムに関わるコストや制約が学術アクセスを制限する一方で、チップの構築や必要な機器の長期的かつ多段階のプロセスが独立した学術開発を制限することが特定されています1,8,9。この研究の最前線にある課題の一つは、モデルの再現性に関する標準化と検証です。しかし、チップ開発を始めようとする多くの研究室にとって、特定の研究課題に答え、動物実験を置き換え、より生物学的に関連性の高いモデルに取り組むための課題に到達するには、依然としてギャップがあります12。
この記事では、ほとんどの研究環境で利用可能なスキルと機器のみを必要とするチップシールのワークフローを紹介します。この手順により、3種類の異なる膜材料に対して防水性の高いPDMSチップ-膜インターフェースが生成されます。このプロセスは限られた作業時間を必要とし、非チップラボ環境でも対応可能で、小規模から中規模のチップ生産までスケール可能です。
提示されたシーリング手順は、多孔質プラスチックまたはECM膜で行うことができます。提供された例のチップは、空気曝露を伴う気道オンチップデバイスとしてこの手順で構築されています。この手順は、膜に必須の孔が含まれていれば、他の同等の装置にも使用できます。提供されたチップの主な用途はALI培養および気道上皮細胞ですが、他の用途や間葉細胞や腸内細胞との共培養モデルにも利用可能です。例えば8,13。最初に提供されたチップは、標準的な気道オンチップで、大規模な培養領域(92 mm2)と2つの培養チャンバーを備えています。その中には、空気曝露用の頂端チャンバーがあり、基底室は多孔質の膜で隔てられています。基底室には培地とオプションで別の浸没培養細胞タイプ(例:線維芽細胞、内皮細胞)が含まれています。ALI用途では、頂端にシードされた細胞が培地の上部チャネルへの漏れを防ぐために厳重なバリアを維持できることが不可欠です。2つ目のチップは1つ目と同じ設計で、膜の両側に2つの追加チャンバーがあり、ここでは豚のECMを用いて、負圧をかけて培養膜を伸ばしやすくし、自然な気道の伸縮を模倣しています。
当社のシールプロセスは、PDMSチップ開発分野のいくつかの要素と、2つの新しい条件を組み合わせています。第一に、トルエン薄めたPDMSモルタルに真空を迅速に適用することで、トルエンの膜への化学的攻撃を防ぎ、膜の孔や表面構造へのシリコーン侵入を促進し、薄く変位に強い表面を形成します。トルエンは固体PDMS表面に膨張や変形を引き起こしますが、高濃度では溶媒として作用するため、この手法で液体PDMSを薄めるために用いられます。ここで使われているPC膜やPET膜のようなプラスチックの場合、トルエンは素早く除去しないと歪みや応力割れを引き起こします。モルタルを手動で塗布する際は、あらかじめ組み立てられたチップハーフの壁の上に塗布し、培養領域内にモルタルが入らないように注意が必要です。これは培養膜の孔を塞ぎ、PDMSの領域を生じさせて細胞培養能力に混乱や変動をもたらすためです。第二に、PDMSモルタルを室温(RT)で72時間硬化させることで、材料が熱膨張後に収縮する際に起こる膜のチップ半分およびモルタルからの変位を防ぎます。
3Dプリンターやマイクロミルで作れる2種類のチップ型設計( 補足ファイル1、補足ファイル2に記載)と、PDMSとトルエン14から薄いモルタルを作る方法を提供しています。この方法により、デバイス内で商用プラスチック膜(PET、PC)の密封が可能になります。さらに、同じチップに豚由来のECM膜を組み合わせて、周期的伸縮能力を持つ生物学的チップを生成することで、このプロセスの適用範囲を検証しました。オルガン・オン・チップは生 体内 環境の生理的特性を再現することを意図しているため、呼吸中に体で感じる力、例えば流れる空気からのせん断応力や狭窄気道の機械的地形を生み出せる気道・オン・チップは、生物学的に非常に重要です16.使用される膜は基底膜、固有層、およびコラーゲン、ラミニン、その他の周囲のマトリックスタンパク質で構成されています。私たちの知る限り、これは初のネイティブベースメント膜ベースのチップであり、伸縮可能な初のものであり、これにより非シリコーンECM膜上の呼吸などの機械的応力を模倣可能にします。この新しい応用は、プラスチックとECMを用いたシール処理の機能を際立たせています。最後に、このチップと膜シールの応用をAirway-on-ChipとしてALI細胞培養8に応用することを紹介します。
プロトコル
この研究は、動物実験法に基づく倫理委員会の承認を免除され、材料は死後に調達され、科学目的で動物が犠牲にされなかったためです(Wet op de dieerproeven)。一次ヒト気道上皮細胞の分離プロトコルは、フローニンゲン大学医療センターの研究コード https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg(2025年1月14日アクセス)および人体物質使用に関する国家および倫理的専門ガイドライン(2025年1月14日アクセス https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf)に基づいて行われました。この研究は、気管管支組織が移植後に残り、オランダ民法およびウェット・オプ・デ・オルガアンドナティエ(ドナー法)に基づき完全に匿名化されていたため、倫理委員会の承認要件から除外されました。
1. チップハーフおよび膜の準備
- チップ生産
- ダウンロード。本論文の 補足ファイル1 および 補足ファイル2 に掲載されたチップの上下半分のSTL設計ファイル。上部の型は深さ5mmのチップハーフを、下部の型は3mmの深さのチップハーフを作ります。両方のチップ半分には1mmの深さの培養室があります。あるいは、適切なCADソフトウェアを使ってチップ設計を作成する方法もあります。
- 3Dプリント用のスライスファイルか、チップ型のマイクロミリング用のミルパスを準備してください。マイクロミルドの型はすぐに使える状態です。樹脂プリント型は、PDMS型として適切に準備するためにUV架橋の前に24時間99.9%エタノール洗浄を2回行う必要があります。
- PDMSチップ半分生産(図1)
- 液体PDMS塩基と硬化剤を10:1の比率で十分に混ぜ、真空チャンバーで気泡をすべて除去するまで脱ガスします。
- 幅広ノズルシリンジで型に注ぎ、真空チャンバーで10分ほど脱ガスし、すべての気泡が除去されるまで続けます。型を65°Cで乾燥するまで2時間乾燥させるまで置きます。
- メスで型から固体のチップ半分を取り出し、フラッシングの端を切り取ってください。チャンバーの両端の上半分に4つの入口を追加し、生検パンチで下部チャンバーの入口位置を示す2つの隣接するリングを追加します。
注:提示された結果では、2mm生検パンチを使用し、培養中の培地および気流のために2mmのシリコーンチューブが挿入されました。1mmおよび2mmのインレットは、それぞれ200μmおよび1000μmチップに対応するピペットによる細胞シーディングを容易にします。他のパンチサイズは、異なるチューブやポンプシステムに使われることもあります。
- 膜の準備(図2)
- ダウンロード。本論文の 補足ファイル3 の膜ステンシルのSTL設計ファイル。ステンシルは3Dプリントまたは同等の製造方法で準備し、膜形状の均一さを確保します。
- ステンシルをPETまたはPCの膜の上に重ね、メスで膜を形作る際にしっかりと固定します。
注:この時点で、膜はペトリ皿内で細胞培養のためにマトリックスタンパク質でコーティングしても膜結合を妨げることなく行えます。これにより細胞成長のために機能化されるのは膜のみで、PDMS壁は前述のように細胞を自由に保つことができます。
2. 膜結合
- PDMS迫撃砲準備
- 液体PDMS(ステップ1.2.1)とトルエンを7:5の比率で混ぜ、前述のワイドノズルシリンジで上下にシリンジでよく混ぜます。各チップにつき8ドロップだけで十分です。1バッチあたり1.4 mLのPDMSと1 mLのトルエンが推奨され、このスケールのチップ8枚分に相当します。安定したモルタルの混合は、信頼性の高い膜結合のために重要です。
注意:トルエンは揮発性が高く、非常に可燃性です。曝露は神経系や呼吸器系に損傷を与える可能性があります。発火源から離れたフームフード内でのみ使用し、吸収材と換気を用いて流出を管理してください。取り扱い時には、水しぶきを防ぐための保護ゴーグルと不透水(ニトリル)手袋を着用してください。すべての実験材料(ピペットチップ、容器など)は24時間フュームフードに入れ、その後トルエンは蒸発し、専門の廃棄物サービスを通じて承認されたラベル付き容器に処分できます。トルエンは決してシンクに捨てないでください。詳細については安全データシート(SDS)を参照してください。
注意:モルタルは使用時に、トルエンの早期蒸発やプラスチック汚染を防ぐために、ガラス製でない容器(できれば使い捨て)で準備し、使用直後に廃棄してください。PDMSはガラス表面を硬化させ、部分的に取り外せません。トルエンは実験室でよく使われるほとんどのプラスチックを溶かし、損傷します。
- 液体PDMS(ステップ1.2.1)とトルエンを7:5の比率で混ぜ、前述のワイドノズルシリンジで上下にシリンジでよく混ぜます。各チップにつき8ドロップだけで十分です。1バッチあたり1.4 mLのPDMSと1 mLのトルエンが推奨され、このスケールのチップ8枚分に相当します。安定したモルタルの混合は、信頼性の高い膜結合のために重要です。
- PET/PC膜アタッチメント(図2)
- モルタルをPDMSチップ半分の表面に素早く塗布し、ピペットチップで膜を置きます。
注意:膜の下全体がモルタルで濡れている必要があります。できるだけ薄い層を作るために、先端でしっかりと押さえつけてください。顕微鏡では層は3〜5μmの範囲であることが示されています。 - 準備済みの膜(ステップ1.3)をきれいな鉗子で片端に持ち、チップの正しい位置に先端を濡れたモルタルに置き、膜が所定の位置に落ちるのを待つ。
注意:この点以降は膜がずれないように注意してください。湿ったPDMSがチャンバーに侵入すると、膜に不規則で使えない壁が形成されます。シフトが起こると、シリコンが培養領域を覆い、膜の両側で細胞培養の可能性が妨げられ、膜を廃棄して前の工程を繰り返します。 - 鉗子で膜を優しく固定し、PDMSモルタルを膜の上部に再度塗布し、ストロークごとにチャンバーからそっと離れて気泡を取り除き、膜を元の位置から動かさずに固定します。
注意:PDMSを膜の内側培養領域に塗布しないように注意してください。これは、シリコーンが細胞の接着を防ぎ、培養膜の自然な表面を破壊するため不可欠です。 - 湿ったモルタルを取り付けた後、膜付きのチップ半分を真空チャンバーに入れ、室温で25 mBar真空下で72時間硬化させます。
注意:膜が付いたチップ半分は室温で硬化させる必要があります。PET/PCとPDMSは熱膨張の度合いが異なり、熱硬化によりシリコーンは膨張し、冷却時に収縮し、膜が膨張します(図3)。
- モルタルをPDMSチップ半分の表面に素早く塗布し、ピペットチップで膜を置きます。
- チップの完全な構成
- 膜で結合されたチップの半分は、チップの後半部分に取り付けることができます。最も安定した結果を得るためには、両半分をO2 プラズマ処理(320 mBar、30秒)にさらし、手で軽い圧力で素早く押し合わせます。
注意:酸素プラズマオーブンは酸素飽和環境、オゾンなどの危険な酸化物、強い紫外線を発生させます。オーブンは換気の良い場所や排気フードに設置すべきです。オーブンの窓はすべての紫外線を遮断するはずですが、ゴーグルの使用が推奨されます。可燃性物質や金属は、加速燃焼や有毒な煙の放出を防ぐために酸素プラズマ領域から排除すべきです。酸素プラズマSDS文書を参照することは、本プロトコルで言及されている物質以外の物質で使用する際に不可欠です。
注:プラズマオーブンがない場合は、プラズマワンドやPDMSモルタルを塗布し、室温で軽い圧縮で72時間13分硬化させることで同様の接合が可能です。フルO2 プラズマオーブンと比べると効果は劣りますが、オーブンがない場合にもこれらのオプションが使われることがあります。
- 膜で結合されたチップの半分は、チップの後半部分に取り付けることができます。最も安定した結果を得るためには、両半分をO2 プラズマ処理(320 mBar、30秒)にさらし、手で軽い圧力で素早く押し合わせます。
結果
膜シールの完全性試験
密封されたチップの完全性を検証するため、上部の培養室に青色染料のデミウォーター、下部に純粋なデミウォーターを充填します。チップは一晩放置され、膜の周りの上部チャンバーから下部チャンバーへの青い染料の漏れの可能性を評価します。
当社の方法で準備された完全構築されたシリコンチップは、膜の完全性を損なうことなく縦方向に35°まで変形でき、両面に柔軟なPDMSモルタルで覆われ、上半分に固定されます。PDMSチップの変形は使用の通常の一部であり、例えば半分やチップがペトリ皿にくっつく場合などです。
チップは双方向のシリンジポンプシステムに接続され、流量誘起圧力での性能を試験しました。PETおよびPC膜を備えたチップは、チャンバー間の漏れやチップの破裂なしで、ポンプが提供する最大圧力30 kPaまで運転可能です。以前の研究では、チップは標準的に150μL/hで動作しており、これは各デバイス8のチャンバーに0.7Paの圧力をかけています。
膜結合の可視化
RT真空封入の結果として顕微鏡下で0.4μmの膜孔に液体PDMSモルタルが侵入する様子を可視化するため、PDMSモルタルはナイルレッドで染色されました。ナイルレッドは疎水性染料であり、液体のPDMSとよく混ざるため選ばれました。この染色は液体PDMSに1%ナイルレッドを十分に混ぜて、光学顕微鏡下で赤色を出すことで調製されました。上記の通りRT硬化手順が繰り返されました。染色モルタルを用いた膜をパラフィンに埋め込み、ミクロトームで切片しました。膜のスライスはガラススライドにマウントされ、光学顕微鏡で画像化されました(図4)。トルエンを用いたPDMSをモルタルに薄めることと、PDMSを膜孔隙に侵入させるための真空作用の必要性を検証するために、これらの方法を用いた膜となしの膜の比較は補 足 図3に示されています。
細胞生存性検査
以前の研究では、装置の構造におけるトルエンの使用による化学的毒性の可能性が検証されました。チップは、トルエンの有無にかかわらずPDMSモルタルで調製され、ヒト肺腺癌の上皮Calu-3細胞を2日間にわたり培養し、チップ内で1日間培養しました。細胞死はトリパンブルー染色で評価され、装置からすべての細胞を除去し、死んだ青色細胞と染色していない生存細胞を数えました。増殖は、チップ媒体中の試薬を培養し、その後AlamarBlueアッセイを実施し、プレートリーダーで蛍光吸収を読み取り、増殖を反映した結果を測定しました(図5)8。
ECMベースメント膜の取り付け
この手法がさまざまな膜との強く柔軟な結合を生み出す一般的な適用性を示すため、完全細胞外マトリックス(ECM)膜を用いたプロトコルを繰り返しました(図6)。17以前に記載された豚の尿嚢から、基底膜を含むECM足場が準備されました。簡単に言うと、4か月から8か月の雌動物から豚の尿便を採取し、地元の屠殺場(オランダ・フローニンゲンのKroon Vlees b.v.)から採取し、採取後3時間以内に処理されました。結合組織と脂肪を膀胱から除去し、膀胱を裏返し、上皮層を鈍く剥離し、組織を室温のPBS内に置いたままにしました。膜付着手技のためにECMスキャフォールドは脱水されました。準備済みの足場は切断され、上記のプロトコルで説明されたようにPDMSチップの半分に結合されました。真空シリコン結合が水平機械的応力にも耐えられることを示すため、装置内に膜の伸縮用の追加チャンバーを備えた新しい型が作られました(補足ファイル2)。
ECM膜完全性試験
膜シールの完全性試験は前述の方法で実施されました。次に、伸縮チップを注射器ポンプに取り付け、装置の側面チャンバーに真空を引き寄せて、一晩中ECM膜に1mmの水平伸縮を生み出しました(図7)。
標準的なAirway-on-ChipおよびPET膜における上皮細胞の分化と線維芽細胞共培養
提供されたチップがALI細胞の気道オンチップとして機能するかどうかを検証するため、ヒト肺腺癌のCalu-3細胞(ATCC、米国バージニア州マナサス)を合成して装置内で空気曝露させました(以前の研究8)。頂端空気曝露を10日間続けると、Calu-3上皮細胞は粘液産生細胞に分化することが確認されており、これはAlcian blue染色(図8)で測定された粘液生成によって示されています(図8)。
長期間の漏出のない流れと共培養の手順を検証するために、以前の論文から例が挙げられます。完全な細胞培養方法については、この記事8を参照してください。ヒト気道上皮細胞はチップの頂端培養室で21日間一定の気流下で培養され、一次気道線維芽細胞は膜の反対側で逆さまに培養されました。要するに、一次気道上皮細胞はプロテアーゼ処理(HBSSで0.2 mg/mL、2時間、37°C)、細胞のスクレーピング、そして3人の健康な肺ドナーから残った気管支組織から除去された細胞の凍結保存によって分離されました。ヒト気道線維芽細胞(AF)は、単一のドナーから移植されたCOPD肺組織の気管支から同様に単離されました。
図9では、チップのグラフィックと、上記のセルがデバイスのチャンバーを通しておよび沿ったどのように見えるかが示されています。
ECM膜上の線維芽細胞と共培養による上皮細胞の培養
基底膜を含む足場は上皮細胞および間葉細胞培養を促進します。不死化ヒトケラチノサイト(HaCaT細胞)は、膜の上皮側に60 x 103 cells/cm²の密度でシードされ、24時間後の生存率は95%で、プラスチック細胞培養フラスコでは91%でした(図10A)。次に、正常なヒト肺MRC-5線維芽細胞を60 x 10 3 cells/cm²の密度で基質(外側)にシードし、HaCat細胞と共培養して14日間培養し、原生ECM膜での共培養の長期的な上皮間葉系存続可能性を評価しました(図10D)。上皮細胞は膜の内側に合流した単一層を形成し、線維芽細胞はECM膜の外表面に分布が少なく、特徴的な紡錘状形態を保持していました(図10C)。3D再構成の映像は補足ファイル417でご覧いただけます。
本研究では、手動取り扱いによる破壊に耐性があり、最大0.7 Paの圧力を用いた長期フロー培養を可能にする、強力なPDMSと膜の結合を生み出した改良された膜シーリング手法が提示されました。これらの膜はシリコンで結合されており、シリコンが培養膜の孔隙を通って侵入し、2つのチップ半分と真空されたPDMSモルタル間に共有結合シラン結合を促進していることを示しました。さらに、モルタルが正しく塗布されていれば、提示された手法は細胞毒性を誘発しません。さらに、生産されたチップは長期的な上皮単皮および上皮間葉系共培養を促進しました。この手順は多孔質膜にのみ適用されますが、信頼性が高く細胞培養に適したALIチップの製造には低入力の手順として依然として有効です。
図1。PDMSチップ半分製造および膜準備のグラフィックス。PDMSチップハーフ製造(ステップ1.2)では、チップ金型に液体PDMSを充填し、広いノズルシリンジを装填します。上部金型は4.4mL、下部は2.4mLです。PDMSの半分は65°Cで2時間硬化され、その後、上部チップ半分の4つの入口がチャンバーの端と金型のポイントにパンチングされます。膜準備(ステップ1.3)では、印刷された膜ステンシルを膜表面にしっかりと固定します。新しい刃を使い、ステンシルの周りを切り取り、周囲の材料からチップ膜を取り除きます。膜は細胞培養用にコーティングすることも、ステップ2で直接使用することも可能です。BioRenderで作成。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2。膜結合の手順。PDMSモルタルは使用直前に上記のように混合されます。モルタルは培養室の四隅に滴り落ち、ピペットの斜めの端で膜結合部位の周囲に優しく塗布します。膜の一端をモルタルの上に置き、培養室に合わせたら、そっと落ち着かせます。モルタルは滴下して再塗布し、膜の縁に塗り付けますが、培養領域内の膜表面にシリコーンが触れないように細心の注意を払って塗られます。チップ半結合膜はすぐに真空チャンバーに入れられ、マイクロバブルを除去し、シリコーンの表面や孔への侵入を防ぎ、トルエンを除去して膜への化学的攻撃を最小限に抑えます。BioRenderで作成。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3。膜の配置例。(A) 膜の成功した設置とRTでの硬化。(B) 膜結合がオーブン内で硬化した場合(RTではなく65°C)、加熱後にシリコーンが収縮するにつれて膜がチャンバー内に膨張したことが確認できます。(C) PETおよびPC膜の正しい配置を備えた完全なチップ。(D) 膜の配置が誤ると、膜の動きに合わせてチップの各側の体積が変化し、流量が変動し、チップ内のセルおよびチップに取り付けられたポンプにストレスがかかります。BioRenderで作成。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4。PETおよびPC膜のスライスおよびマウントされた光学顕微鏡画像。 真空RT硬化手順の結果として膜孔へのシリコーン侵入を示しています。 (A) PDMSを膜に施していない同じ膜の画像で、透明な孔や偏光画像のきれいな表面が確認できます。 (B) PDMSモルタルはナイルレッドで染色されており、シリコーンはマゼンタ色で孔隙に侵入し、真空下で表面を薄くコーティングしているのが確認できます。白やマゼンタの形で強調されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図5。チップデバイスの細胞生存率は、薄め剤としてトルエンを有無にかかわらず、PDMSモルタルの構造によって変化はありませんでした。 Calu-3細胞は1チップあたり6.5 ×104 細胞でシードされ、合流に達した後、上清液にAlamarBlueアッセイ、細胞にTrypanBlueを投与した後、一晩インキュベートされました。トルエン配合・不配合のグループ間(n=4)は、ペアなしのStudent's t検定で検証されました。p > 0.05 = ns(有意なし)8。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図6。地下室の膜チップ。(A) PDMS/トルエンモルタルが十分に速く吸い取られなかったため膜の完全性が失われた;これによりマトリックスタンパク質が損傷し、チップシールが妨げられています。 (B) 膜とチップのシールは成功したが、膜が緩い状態で封印されている。 (C) 膜とチップのシールが成功し、チップは流れと伸縮に機能します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図7。ECMチップが伸ばされている2枚の画像。(A) 休止中の欠片。 (B) 1.2mmの水平伸縮下の欠け。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図8。アルシアンブルー(核はマゼンタ、粘液は青)染色は、装置内で空気にさらされた後にチップ内で培養されたヒト肺のCalu-3上皮細胞に染色されています。Calu-3細胞は基底区画で150μL/hの連続流量で10日間培養され、頂端側から培地または空気にさらされました。流量はインキュベーター内の蠕動ポンプで37°C、CO25%で生成されました。培養終了時に膜を除去し染色しました。10日間浸水(A)および空気曝露(B)で培養したCalu-3細胞のアルシアンブルー染色の横断図8。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図9。装置内で拡張共培養された一次ヒト上皮細胞および線維芽細胞の可視化。気道 線維芽細胞を装置内にシードし、一晩付着させた後、装置を反転させて膜の反対側の上皮細胞にシーディングしました。細胞はコンフルエンスまで培養され、空気にさらされ、インキュベーター内の蠕動ポンプで37°C、CO25%で150μL/hの連続流量で21日間培養されました。培養後、膜は除去され、固定、埋め込み、スライドにマウントされてから染色されました。上皮細胞は粘液の成分であるMucin 5AC(MUC5AC)18および繊毛生成のシグナル伝達に関与する転写因子であるフォークヘッドボックスタンパク質J1(FOXJ1)19に染色されました。線維芽細胞は小麦胚凝集素(WGA)で染色され、細胞内のリン脂二重層を可視化しました。細胞はHBSSで5 μg/mLで15分間インキュベートされ、画像撮影前にPBSで3回洗浄されました。すべての細胞核はDAPIで可視化されました。 (A) 断面図: (B) および (C)の画像をZスタック射影で生成します。 (B) チップ膜上の上皮性MUC5AC/FOXJ1/DAPI染色。 (C) 基底腔の線維芽細胞層の完全な外部構造8. この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図10。基底膜足場における細胞の生存性と共培養。(A) 上皮側にシードされたHaCaT細胞の生死生存率、3つの独立したサンプルをテストし、各サンプルから3つのランダムフィールドを抽出しました(n=3)。Tukey補正を用いた通常の一方向ANOVA検定が実施されました。グラフは標準偏差付きの平均を示しています。( B) 上皮側のHaCaT細胞と 、(C) 基底膜を含む足場の基質側にあるMRC-5肺線維芽細胞の共培養、スケールバーは50μm。 (D) 上下の共培養3Dビュー(等角投影図)、スケールバーは100μm、アニメーションの可視化は補 足 図4に掲載されています.(E)脱細胞化前後の基底膜足場の厚さを測定し、14個の粘膜を測定し、そのうち6個(三角形で表される)を脱細胞化のために採取した。各サンプルに対して3つのランダムフィールドをスキャンし、各フィールドに少なくとも10点が17の指標として割り当てられました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
補足図1。標準的なPET/PCチップの上下半分のチップ型設計。(A) から生成可能なチップの底型の画像。 補足ファイル1のSTL。 (B) から生成可能なチップのトップモールドの画像。 補足ファイル2のSTL。 (C) チップの切断膜用ステンシル画像。これは から生成可能である。 補足ファイル3のSTL。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足図2。伸縮型ECM膜チップの上下半分のチップ型設計。 (A) から生成可能なチップの底型の画像。 補足ファイル4のSTL。(B) から生成可能なチップのトップモールドの画像。 補足ファイル5のSTL。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足図3。シール手法の検証:トルエンを使わずにPDMSが孔隙に侵入し、モルタルの粘度を下げる方法と真空なしのRT硬化の比較。すべての条件 はPET膜(0.4μmの孔)を用いており、PDMS(ナイルレッド1%)処理後、膜はパラフィンに埋め込まれてからマウントされ、光学顕微鏡イメージングが行われました。 (A) PET膜に吸い込んだ未脱薄のPDMS。膜の表面には厚いPDMS層が見えますが、孔に入ったPDMSは観察できません(白いボックスで強調されています)。 (B) 薄薄化したPDMSモルタルをPET膜に真空吸い取り。膜の表面にはPDMSの層が見られますが、孔に入ったPDMSは観察できません(白いボックスで強調されています)。 (C) 薄薄化したPDMSモルタルをPET膜に真空で吸い込んだ。膜表面には薄いPDMSの層が見え、膜の孔にも侵入している(白いボックスで強調されています)。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足図4. 3D豚のECMスキャフォールド上にある共培養HaCat(上皮細胞)およびMRC-5(ストロマル)細胞の可視化図。 上下のアイソメトリックビューからの共文化のアニメーション3D画像で、 図10Dに画像が示されています。スケールバーは100μmです。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足ファイル1. 3D。底型のSTLファイル。 この型は3Dプリントや同等の製造方法で標準チップの下半分を製造するために使用できます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足ファイル2. 3D。トップ型のSTLファイルです。この型は 3Dプリントや同等の製造方法で標準チップの上半分を製造するために使用できます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足ファイル3. 3D。膜ステンシルのSTLファイル。 ステンシルは提供されたチップに適したサイズの膜を製造するために使用でき、3Dプリントや同等の製造方法で製造可能です。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足ファイル4. 3D。ストレッチチップの底型のSTLファイル。この型は 3Dプリントや同等の製作方法でストレッチチップの下半分を製造するために使用できます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足ファイル5. 3D。ストレッチチップのトップモールドのSTLファイル。この型は 3Dプリントや同等の製造方法でストレッチチップの上半分を製造するために使用できます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
ここで提供するチップシールプロトコルは、長期培養に適した水密性のPDMS膜チップシールを製造する新しい方法を示しており、限られた機器で製造可能で、専門的な技術を必要としません。シリコンモルタルで表面に結合された膜(PET、PC、ECM)を用いたチップウェハーの製造手順を示し、真空を迅速に適用することでPDMSが孔やプラスチック膜表面に侵入することを示しました。また、得られたチップは良好なシール性を持ち、幅広い培養用途に対応できることも示しています。
PDMS-プラスチック結合にはいくつかのアプローチがあり、これはPDMSの細胞培養に有益な特性(ガス透過性やパターン性)とプラスチック膜の細胞培養生存性の特性から一般的な結合戦略です。これにはO2 プラズマによる表面活性化、コロナ処理、またはシリコーンやガラス20間の共有結合形成を促進するオゾン処理が含まれます。それ以外の方法として、APTES(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン)やMPTMS(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシランなどの有機シランを用いた化学接着技術により、反応基21を加えて表面を官能化します。あるいは、PDMSやプラスチック基板をエポキシやその他の接着剤を用いた接着剤法で接着することも可能です。表面活性化と化学接着のハイブリッドを提案し、多孔質膜と真空を用いて膜を通る物理的な結合を作り出し、O2 プラズマ表面活性化だけで結合できる。トルエンでPDMSを薄めることで、真空下で膜の孔隙を通ってPDMSが浸透し、チップ半分とモルタル埋め込み膜にまたがるPDMS-PDMS結合を通じて異なる膜が共有結合されることが可能になります。これらの孔を通じて物理的なシリコーンネットワークを作ることで、表面化学処理や高温エンボス機による熱・圧力の必要を回避できます。これらはしばしばこれらの技術を助けます23。
本研究では、さまざまな機能を備える大規模な2チャンバーチップ(補足ファイル1)が提供されています。次に、循環的な水平伸縮が可能なチップ(補足ファイル2)です。これらのデバイスはエアウェイ・オン・チップとして機能し、モデルは前述のガット・オン・チップとしても使用可能です。前述の13。主に、金型製造、膜準備、チップ構造に関する複数の選択肢を段階的に提供し、研究者の望む応用に応じて追加の新しいチッププラットフォームに適用可能です。最終的な密封にはO2 プラズマオーブンの使用が推奨されています。それでも、携帯型プラズマ装置やPDMSモルタルを用いた手動圧縮もこのステップ24で成功することが確認されています。この封印手順のプロトコルでは、各ポイントで主要な障害と仕様が強調されています。これには、膜をあらかじめコーティングするオプション、PDMS/トルエンモルタルの即時使用の重要性、モルタルが培養領域に入らないようにすること、そしてモルタルと接触した後に膜が動かないことの重要性が含まれます。
この密封手順の再現は、調査官によって書面によるプロトコルを用いて繰り返し行われています。2回目の試みで成功する封印には以下の説明のみが必要でした。ストレステストや長期培養中に漏れが発生した場合、いくつかの選択肢を検討できます。まず、研究者はモルタルが硬化が始まっていないPDMS液体から新たに作られ、トルエンと十分に混合されていることを確認すべきです。モルタルの低粘度が、空気を真空化することで膜の孔に流れ込む薄く滑らかな層を可能にしています。次に、膜の上下全体を覆うほどのモルタルを塗布し、多すぎると圧縮下で培養領域に流れ込み、少なすぎると隙間ができてチャンバー間の漏れの原因となります。第三に、膜は取り付け前および接着中は平らでなければなりません。最後に、手作業は必要ですが、チップは完全な接合のためにほぼ汚れを保つ必要があり、迅速かつクリーンな作業が不可欠です。
本論文では3種類の異なる多孔質膜の付着を示しましたが、他の膜に対するこの手法の機能は予測できません。これは、トルエンに対する化学物質の耐性や、他の密度や孔径がこのシーリングの効果に影響を与えるためです。しかし、本プロトコルの高い多様性を示す、初の伸縮可能な完全ECMベースの膜結合を示しました。しかし、伸縮性能の一貫性は信頼性が高く検証されておらず、異なる基底膜領域、臓器、発生源によって機械的な違いが生じます。さらに、ECM膜の細胞培養における生存可能性も、培養中および貯蔵中の両方で時間とともに変化しやすい19。この方法は異なる膜やチップの配置に適用されますが、効果的にするにはモルタルの手動塗装が必要で、比較的短時間で済むものの、当社が提供するような大型モデルではより頻繁に成功します。最後に、膜結合プロセスはPDMS、トルエン、膜、真空チャンバーのみで済みますが、チップの最終的な密封はO2 プラズマの適用に依存しており、これは普遍的に入手可能ではありません。
制限はあるものの、提供されるプロトコルは新規であり、専門的なスキルを必要としません。私たちの知る限り、低粘度のPDMSモルタルを真空化して膜孔を通したシリコーンネットワークの生成は、この種で初めての試みです。機能チップの基盤となる異なる材料間の他の化学的または機械的な機能的橋渡しとは異なり、この解決策はほとんどの実験室環境で可能です。
開示事項
著者たちには利益相反はありません。
謝辞
この研究は、プレシジョンメディシン・フォー・モア・アキシジェンシー(P4O2)コンソーシアムおよびStichting Proefdiervrijからの資金援助を受けました。ナイルレッド染色を使うアイデアを提案してくれたIsadora Kraguljacさんに心から感謝します。これはシリコンネットワークの可視化にPDMSと混ぜ合うことができるからです。また、膜のスライスと取り付けを巧みに行ったMarjan Reinders-Luingeさんにも感謝します。著者らは、製薬分析部門とサベス・ヴァーポールテ氏に、酸素プラズマオーブへのアクセスを提供してくれたことに心から感謝の意を表しています。このプロセスは、このオーブンなしでは成り立たなかったでしょう。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2mL ワイドノゼル注射器 | BD エメレルド | 307727 | |
| 2mm生検パンチ | KAI医療 | BP-20F | |
| カル3細胞株 | ATCC | HTB-55 | RRID: CVCL_0609 |
| HBSS(ハンクス・バランスソルト溶液) | ギブコ | 14170112 | |
| O2プラズマオーブン | ハリックプラズマ | PDC-002 | |
| PCトラックエッチング細胞培養膜 | ipCELLCULTURE | 1000M25/620N403/47 | |
| PETトラックエッチング細胞培養膜 | ipCELLCULTURE | 2000M23/610N403/47 | |
| ポリジメチルシロキサン/シルガード184シリコーンエラストマーベースおよび硬化剤 | ダウ・コーニング | DOWC25100445 | |
| ポリメチルメタクリレート(8mm) | コルテック | 該当なし | |
| 標準フォトポリマー樹脂(グレー)(1kg) | エレグー | 該当なし | |
| トルエン | メルク | 1,08,325 | |
| 真空チャンバー | フィッシャーサイエンティフィック | 12080253 |
参考文献
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