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方法論記事

術後腹部癒着形成のためのトランスレーショナル外科用豚モデル

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DOI:

10.3791/70377

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2026年3月13日

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1Department of Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Material Science and Engineering, Stanford University, 5Sarafan ChEM-H, Stanford University, 6Department of Pediatrics (Endocrinology), Stanford University School of Medicine, 7Woods Institute for the Environment, Stanford University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、腸切除を伴う開腹手術を受けたユカタンミニ豚を用いて、術後腹部癒着形成の豚モデルを記述します。このアプローチは、腹腔内の癒着を確実に誘発し、癒着の発達を評価し、癒着対策の検証を行うプラットフォームを提供します。

要約

ユカタンミニピッグを用いて、術後腹部癒着形成の豚モデルを確立しました。このプロトコルは、正中開腹手術、小腸切除術と二層一次吻合、そして開腹手術の形式で片側の頭頂腹膜擦過を組み合わせています。癒着形成は術後4週間に確立された総スコアおよび組織学的スコア基準を用いて評価され、評価は盲検観察者によって実施されました。このモデルを用いたすべての動物で癒着が発達し、腸と腹壁の間に腸ループを含み、腹膜が腹部の他の臓器(例:肝臓)の上に重なり、手術部位に多焦点で発生し、重症度は様々でした。4週間後の組織学的解析では、主に細胞外マトリックス、線維芽細胞、血管から構成される癒着が認められ、再形成期の創傷治癒組織の表現型と一致しました。このモデルは腹部癒着線維症生物学の研究や候補抗癒着治療薬の翻訳評価に関連しています。臨床的に関連した腸内外科手術と定義された腹膜損傷、標準化された評価戦略を統合することで、このプロトコルは大型動物モデルにおける術後腹部癒着の誘発と評価に再現可能なアプローチを提供します。

概要

術後癒着は腹部および骨盤手術後の主要な罹患原因であり、患者の最大93%に発症します1,2、約20%が癒着関連合併症で5年以内に入院を必要とする患者です。3,4。腹膜損傷は、腹部手術や腹部の刺激(感染や化学物質曝露)、炎症性腸疾患などの慢性炎症状態によって引き起こされます。その結果生じる癒着は、再発性の腸閉塞(時には追加手術が必要)や不妊や慢性痛を引き起こすなど、幅広い臨床的影響を引き起こす可能性があります(5,6,7)。細胞縮小手術、慢性炎症、腸穿孔など、悪性腫瘍の多臓器切除術後、広範な腹膜損傷が線維化反応を増幅させる場合、癒着形成は特に深刻になることがあります。さらに、接着性疾患はその後の手術を大きく複雑にし、低侵襲治療の進行が困難になったり、腸や他の臓器に意図せず医因性損傷を引き起こすこともあります。

臨床的重要性にもかかわらず、効果的な癒着防止戦略の開発は限られており、部分的には人体で見られる解剖学的、生理学的、創傷治癒反応を再現する前臨床モデルの限界が妨げられていると考えられます。齧歯類モデルは、その入手可能性、実験的扱いやすさ、信頼性の高い接着生成9,10,11のため広く使われています。しかし、小さな腹膜腔、薄い腸間膜、そして独特の炎症性環境が、翻訳上の重要性を制限することがあります8,12。これらのモデルは、動物実験で強固な有効性を示したものの、ヒトでは限定的または状況依存的な臨床的利益を示した抗癒着アプローチの開発に貢献しました(8,13,14,15,16,17)。さらに、腸切除や吻合術などの人間に比較可能な外科的手技は、齧歯類において翻訳的に関連性のあるモデル化が困難であり、種ごとの薬物代謝の違いも臨床的外挿をさらに制限しています18。

特に豚を中心とした大型動物モデルは、解剖学的・生理学的に人間と類似しており、手術的取り扱いも同等であるため、腹部の過程の研究に広く用いられており、癒着形成の研究や治療的介入の検証を行うプラットフォームを提供しています。.既存の豚癒着モデルは重要な洞察を提供してきましたが、多くは手術特異的な癒着形成に焦点を当てており、特に開腸手術後に発生する重度の癒着に限定される標準化された手技が不足していることが多いです(23,24,25,26,27)。

これらの制限に対処するため、私たちは正中開腹術、小腸切除術、片側の頭頂腹膜擦過を統合した豚モデルを開発しました。この多焦点腹膜戦略は、腹部手術でよく見られる癒着促進損傷を再現し、4週間の時点で異なる強さや部位の癒着を生じさせます。また、指向性頭頂擦過を行う腹部側や腹部全体での偶然癒着が確実に発生します。臨床的に関連性の高い腸内手術手技と定義され再現可能な腹膜損傷を組み込むことで、このモデルは従来の豚システムの主要な制約を克服し、術後の癒着形成の研究や癒着防止介入の評価に一貫したプラットフォームを提供します。

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プロトコル

倫理声明

すべての豚の研究は、スタンフォード大学施設動物ケア・利用委員会(IACUC)プロトコル#34052で承認されたプロトコル28のもとで実施されました。

1. 畜産

  1. ユカタンミニピッグ(推奨体重9〜12kg、生後7〜9週間)を、認証された販売者から入手してください。1コホートあたりn=4頭の豚を推奨します。動物は2人で、光と温度管理の良い部屋で飼い始めます。
  2. 標準的な豚の食事を自由に提供してください。動物は脱水を防ぐために、常に水を供給できるべきです。
  3. 機関の基準に従い、定期的に体重と全体的な健康状態を監視・記録してください。

2. 麻酔および術前準備

  1. 自宅の飼育ケースで、筋肉内キシラジンとケタミンを使って鎮静させる豚。獣医師が鎮静が十分と判断したら、動物を慎重に手術室へ搬送してください。
  2. 手術室に入ったら、気管挿管で動物の気道を確保します。イソフルランによる麻酔は、認可獣医師の監督のもとで継続してください。
  3. 術中低血圧の治療のために、必要に応じて点滴、血管収縮薬、イノトロープを投与し、腸の低灌流や吻合漏れのリスクを回避します。
  4. 眼に軟膏を塗布し、角膜の擦り傷を防ぎます。傷口感染を防ぐため、切開の1時間前にセファゾリンまたは同等の抗生物質を投与してください。

3. 外科的手技

  1. 動物を温熱パッドの上に仰向けに配置し、正常な体温を維持します。酸素飽和度(SpO2)をパルスオキシメーターで測定し、心拍モニターで脈拍を測り、10分ごとに体温を測ります。
  2. 電動クリッパーで腹部の毛を除去し、その後、アルコール綿棒を一回塗り、その後ポビドンヨウ素を浸したガーゼで皮膚を準備します。消毒液を腹部から滅菌タオルで拭き取ってください。
  3. 腹部は滅菌タオルや手術用カーテンでドレープし、処置中は無菌性を維持します。計画された切開部位の腹壁に25ゲージの針を使い、リドカイン溶液を浸潤させます。
  4. 10枚のメスを使って白線に沿って皮膚、皮下組織、腹壁の筋肉を全身切開し、腹腔内に入り込ませて正中開腹手術を行います。腹壁リトラクターを設置し、腸を内臓を切り開いてください。
  5. 回腸弁の近位~10〜15cmの腸の領域を特定し、はさみで小腸の2.5cm(1インチ)の区画を切除します。関連する腸間膜を電気焼灼で切除し、腸系膜の止血を行います。2つの開いた腸端を間断した3-0シルク縫合糸で閉じ、防水性を確保します。2層の左右の一次吻合(機能的な端から端への吻合)を行います。内側の腔の内層は合成3-0吸収性縫合糸でランニングで再構築し、外層はランニング3-0非吸収性縫合糸で再構築します。処置中は排便漏れを最小限に抑えるよう努めてください。
  6. 無菌ガーゼまたは電気焼灼用の爪パッドを使い、右腹側壁に沿って頭頂腹膜の3×5cmの部分を優しく擦り、腹膜表面がほつれているか腹壁に血液下浮腫が見えるまで(中圧で10〜15回のストローク)。左腹部側壁は技術的制御として擦り傷を残さずに放置できますが、このモデルでは人間の病気に似た方法で腹部全体に偶然癒着が生じます。
  7. 腸を腹腔内に再配置し、腹壁リトラクターを取り外します。腹部に温めた無菌生理食塩水1リットルで洗浄し、すべての液体を排出し、止血(活動性出血なし)を確認してから閉鎖してください。
  8. 筋膜はランニング用の0-0吸収性縫合糸で閉じます。皮膚を2-0または3-0の吸収性非吸収縫合糸で閉じ、切開部を無菌ドレッシングで覆います。手術の平均期間は1時間でした。
  9. 自然呼吸が戻ったら動物の管挿管を行ってください。麻酔から完全に回復するまで、脈拍、酸素飽和度、体温、血圧などのバイタルサインを継続的に監視してください。

4. 術後ケア

  1. 手術後最初の3日間は24時間体制でカルプロフェン(25〜50mg経口)を投与し、必要に応じて必要に応じて投与します。術後最初の3日間は、動物を高タンパクの液体食(1.5本、1日2回)に維持してください。
  2. アモキシシリン(10 mg/kg)を1週間にわたり1日2回経口投与し、その後創傷感染の兆候(赤み、熱、腫れ、排膿の有無にかかわらず)に対してPRN(必要に応じて投与)を行います。
  3. 動物の食欲、活動、腸機能、創傷の健全性を1日2回チェックしてください。感染が心配なら、抗生物質の用量や服用期間について獣医師と相談してください。手術後最初の3日間は、創傷感染のリスクを減らすために滅菌ドレッシングをそのままにしてください。術後の体重維持のために、2〜3日間隔で体重を記録しましょう。
  4. 術後4日目(POD4)からは動物を固形の飼料に移行させます。固形の食事と、固体の液体の高タンパク質食を補足しながら、固形料理だけで十分なカロリーを摂取できるようになるまで続けてください。

5. 安楽死

  1. 動物は生後4週間で獣医の監督のもと、安楽死用溶液を用いて、施設の基準に従って安楽死させます。
  2. 癒着を大まかに評価してください。直ちに組織と血液サンプルを採取し、下流分析に用いてください。すべての生物廃棄物および医薬品廃棄物は、所属機関の環境衛生・安全ガイドラインに従って処分してください。

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結果

提案された豚術後癒着モデル(図1)は、リアルタイムで癒着を評価するための適応スコアリングシステムと組み合わせられました。接着スコアリングは、4週間の実験条件に盲検化された3名のチームメンバーが、代表的なn=4頭の豚のコホートで独立して実施しました。スコアは動物ごとの最終接着スコアの平均値(図2A)で算出されました。腹部内癒着は、腹部の擦り傷面と非擦り傷面の両方で100%の動物で形成されました28。擦り減った側の癒着は、擦り付かていない側よりも統計的に有意に高い癒着スコアを示しました(図2A)。擦り付いた側と非擦り合い側の有意性は、ペアなしのt検定(p < 0.05)を用いて決定されました。すべての動物において、癒着は小腸および大腸、グ...

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ディスカッション

提案された豚の癒着モデルは、腹部内の癒着をモデル化するための臨床的に関連性があり信頼性の高い方法を提供します。局所的または単一部位損傷モデルとは異なり、正中開腹術、小腸切除術と吻合、標準化された頭頂腹膜擦過の組み合わせが意図的に選択され、開腹手術中に遭遇した多因子の腹膜損傷を再現しました。腹部側壁に沿った頭頂腹膜の制御された擦り傷は、ヒト開腹術で一般的に起こる牽引器関連損傷を模倣し、腸切除や吻合は臨床的に関連した腸の取り扱い、虚血ストレス、縫合媒介性炎症をもたらします。

このモデルを用いると、すべての動物が異なる程度と分布を持つ癒着を発症し、一般外科で遭遇する複雑な接着性疾患を再現しました。これには、接着性腸閉塞や損傷部位から遠く離れた部位(擦り傷していない側)で起こる癒着など、術後の一般的な後遺症が含まれます。このモデルは腹部の特定の部位を意図的に擦り傷つけて癒着を生じますが、腹膜腔全体が乾燥、灌漑、腹壁の後退などの有害な状況にさらされており、これらは癒着形成を引き起こすのに十分であることに注意が必要です。この文...

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開示事項

著者側には関連する開示はありません。

謝辞

本出版物で報告された研究は、スタンフォードSPARKプログラム、アメリカ外科医協会外科癒着改善プロジェクト助成金(カーリーノ家の寛大な支援)、およびスタンフォード大学外科科の支援を受けています。スタンフォード獣医サービスセンターと比較動物館のスタッフの皆様に感謝申し上げます。すべてのアイデア、分析、参考文献、図は著者によって作成・検証されています。AIツールは軽微な言語や文法の修正にのみ使われていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>アニマルズ
メスのユカタンミニピッグ、体重9〜12kg(生後7〜9週)S&Sファームズ8
外科用品
DMI4000 B顕微鏡ライカ・マイクロシステムズ組織学
<ストロング>マテリアルズ
Euthasol ビルバック安楽死
エオシンYアルコール染色アザー・サイエンティフィック  Cat#ES709組織学
フロステッドスライドフィッシャー・サイエンティフィック Cat#12-550-400組織学
メイヤー&プライム;s ヘマトキシリン溶液 シグマ・オルドリッチ Cat#MHS80 組織学
<ストロング>薬<ストロング>
アモキシシリンコヴェトルス59629感染予防
10mg/kg 経口投与量×1回
アンセフ/セファゾリンコヴェトルス84773術前感染コントロール
25 mg/kg 静脈注射
アティパメゾールコヴェトルス82124鎮静逆転剤
0.2 mg/kg 
アトロピンコヴェトルス74760徐脈
0.04mg/kg  
ブペルノルフィン徐放型(ER)ウェッジウッド・ファラムシー鎮痛
0.18 mg/kg 静脈内投与
カルプロフェン - 術中デクラ鎮痛
25 mg/kg IV 
カルプロフェン - 術後デクラ鎮痛
25-50mg 経口投与 必要時
セレニアゾーティス術中1回、1〜2 mg/kg>吐き気止め
イソフルランデクラ鎮静 
リドカイン 2%VetOneV1 510212鎮痛
切開前に2 mg/kg SQ
ケタミンデクラアネスシアと鎮痛
12 mg/kg 筋肉痛
ドブタミンホスピラ 麻酔科医ごとの投与量と調整;
ポビドンヨウ素(ベタジン)バレー獣医12265消毒薬
キシラジン(ロンプン)デクラGW l400000鎮静/鎮痛
2.2 mg/kg 筋肉内投与
<ストロング・ストロング>サージェル・グービーズ
3-0 PDS(ポリジオキサノン)縫合エティコンCat#Z316Hアナスタモシス
量 - 2 
3-0シルク縫合(ポップオフ) エティコンCat#1679Hアナスタモシス
数量 - ポップオフ1パック
0-0 PDS(ポリジオキサノン)縫合エティコンCat#Z990Gリネア・アルバ閉鎖<建物/建物/> 数量 - 1
3-0 プロリーン縫合エティコン猫番号#8684G皮膚閉鎖
量 - 1
ボービー電気焼灼 グレイライン医療サプライカタログ#E2516恒常性と切断
陸軍・海軍製やリチャードソン原子炉のような腹壁リトラクター付きの標準的な無菌腹部手術器具セット。
3M テガダーム + パッド 3歳カテゴリー#3593外科的ドレッシング
高タンパクの液体食確実にダイエット
1.5本、1本分1本
Software
バイオレンダー合意番号SH28Z3OOKI図の生成 
Adobe Illustratorアドビv29.8.1図の生成 
フィジーNIH図の生成 
*注:AIツールは軽微な言語や文法の編集にのみ使用されました
*BID - 1日2回、nbsp;IV - 静脈内注射、筋肉内注射、経口注射 - 経口投与/経口投与、SQ - 皮下投与、必要に応じて必要時投与

参考文献

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