ドキソルビシン心毒性マウスモデルから心室心筋細胞を分離する

サマリー

本プロトコルは、ドキソルビシン誘発心毒性モデルから生存可能な成マウスの心室心筋細胞を分離するための再現可能かつランゲンドルフフリーの方法を記述しています。左心室前行性灌流を直接行い、その後制御された酵素消化を用いて、カルシウム耐性のある桿状筋細胞を構造的、分子的、機能的解析に適しています。

要約

ドキソルビシン(DOX)は効果的な化学療法薬であり、臨床的応用は主に心室心筋に影響を及ぼす進行性かつ用量依存的な心毒性によって制限されています。この文脈で細胞損傷メカニズムを研究するには、成人心筋細胞の信頼できる分離が必要であり、これは病気や構造的に脆弱な心臓では技術的に難しいプロセスです。ここでは、DOX誘発性心毒性を持つマウスから機能性心室心筋細胞を分離するための簡略かつ再現可能なランゲンドルフフリープロトコルを説明します。C57BL/6マウスでDOXモデルを確立した後、心臓を迅速に切除し、大動脈を 体外でクランプします。非循環性の順行灌流は、カルシウムフリーおよび酵素を含むバッファーを用いて左心室を通じて直接行われます。消化された心室組織の穏やかな機械的解離により個々の心筋細胞が生成され、その後制御されたカルシウム再導入によりカルシウム耐性を回復します。この方法は、免疫蛍光、サルコメア組織解析、アポトーシス検出、分子シグナル伝達研究などの下流アッセイに適合する高品質で生存可能な桿状心筋細胞を提供します。専門的なランゲンドルフ灌流装置の必要性を排除することで、このプロトコルはDOX誘発心電損傷のメカニズムを調査する研究室にとってアクセスしやすく高収量の解決策を提供します。

概要

ドキソルビシン(DOX)は強力なアントラサイクリン系化学療法薬ですが、その臨床的利用は蓄積性心毒性により制限されており、拡張性心筋症や心不全へと進行する可能性があります^1,2。心筋細胞アポトーシスはこの毒性における主要な病原性過程であり^、これらの細胞イベントを研究するにはDOX損傷心臓から得られる機能的な成人心筋細胞への信頼できるアクセスが必要です。しかし、DOX曝露は心筋細胞を構造的に脆弱かつ代謝的に低下させ、分離中の酵素的・機械的ストレスに対する感受性を大幅に高め、生存率を低下させます。より広範な文献において、成人心筋細胞分離の主要な方法はランゲンドルフ灌流法として依然として主流^です。しかし、損傷した心筋に適用した場合には顕著な制限があります。この方法は専門的なハードウェア、正確な大動脈カニュレーション、そしてかなりの技術的熟練度を要求します。DOX処理された心臓では、ランゲンドルフ灌流時に加わる追加の機械的負荷が細胞損傷をさらに悪化させ、不安定でしばしば最適でない結果をもたらすことがある⁸。

これらの課題を克服するため、急性DOX誘発心毒性マウスモデルからカルシウム耐性成人心室心筋細胞を単離するための簡略化かつアクセスしやすいプロトコルを^{確立しました。}従来のランゲンドルフ灌流を排除し、左心室を直接通す制御された体外前行灌流を実施することで、虚血性曝露を最小限に抑え、心筋の機械的操作を軽減します。これらの特徴は、手術の一貫性を向上させ、抑制された心臓由来の脆弱な心筋細胞の生存率向上が期待されています^7,10。

現在のアプローチは、ランゲンドルフフリー心筋細胞分離の新たな進展を基盤としており、成人心室細胞にもこれらの概念を拡張しています。成人の心室細胞には成熟した収縮構造とカルシウム処理特性の保存が必要であり、これらは主に新生児心臓向けに開発された簡略化された消化法では十分に支持されていない特徴です。^11,12.したがって、このプロトコルは専門的な灌流システムがない検査室にとって実用的かつ再現性の高い代替手段を提供します。分離された心筋細胞は構造的な完全性を保ち、サルコメア解析、免疫蛍光イメージング、アポトーシスシグナル伝達研究など多様な下流応用に適しており、DOX誘発性心損傷の生理学的関連文脈における直接的なメカニズム的調査を可能にします。このプロトコルは、DOX損傷心臓から生存可能な心筋細胞を分離するという重要な未充足のニーズに対応しています。

プロトコル

すべての動物処置は、実験動物のケアと利用に関する機関および国家のガイドラインに従って実施され、西安交通大学の施設動物ケア・利用委員会によって審査・承認されました(承認番号:XJTUAE2022-1441年)。使用された消耗品、試薬、機器は 材料表に記載されています。

1. C57BL/6マウスにおけるDOX誘発急性心毒性モデルの確立

1. 動物の調合:8〜12週齢のオスのC57BL/6マウス(24〜28g)を使用します。標準的な条件下で12時間の明暗サイクル があり、自由 に食べ物や水を得られる環境で飼いましょう。マウスをランダムにDOX処理または生理食塩水対照群に割り当てます(1グループあたりn=3匹)。
2. DOX管理
   1. 滅菌生理食塩水で1.5 mg/mLの新鮮なDOX溶液を準備します。容器をアルミホイルで包んで光から守ります。
   2. マウス1匹の体重を測定し、15 mg^/kg単回投与の注射量を計算^します。
   3. マウスを優しく拘束し、腹腔内注射 で DOX溶液を投与してください。ネズミをケージに戻し、実験スケジュールに従って進め。
      注意:DOXは細胞毒性物質です。適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を着用し、指定された化学物質安全エリアで試薬を取り扱ってください。
3. タイムラインとモニタリング:マウスの健康状態や行動を毎日モニタリングしてください。体重を一日おきに記録する。DOX注射から7日後に心筋細胞分離を実施してください。

2. 心筋細胞分離のための溶液および手術用器具の準備

1. バッファーの調製:これらの溶液の詳細調製方法は補 足表1 を参照してください。
   1. 灌流バッファーとEDTAバッファーを準備してください。すべての溶液のpHをNaOHを使って7.4に調整してください。
   2. コラーゲナーゼタイプII、コラーゲナーゼタイプIV、プロテアーゼXIVを含む酵素消化液を灌流バッファーとともに準備します。
   3. 5%胎児用牛血清(FBS)を灌流バッファー補足して停止バッファーを準備します。
   4. 0.1%の牛血清アルブミン(BSA)、インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、10 mM 2,3-ブタネジオンモノキシム(BDM)、脂質濃縮物、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)をM199培地に加え、完全な培養培地を準備します。
   5. カルシウム再導入バッファーは、最終カルシウム濃度0.34 mM、0.68 mM、1.02 mMのフルレンジーバッファーに完全な培養培地を加えて準備します。
      注意:すべての溶液は0.22μmのろ過を用いて無菌状態で準備してください。溶液は光から保護された4°Cで最大2週間保存します。マウスの心臓を1つ分離するには、50 mLのEDTAバッファー、100 mLの灌流バッファー(コラーゲナーゼ溶液用60 mL、停止バッファー用10 mL、残りは灌流および重力沈降用)、60 mLのコラーゲンナーゼ緩衝液、10 mLの停止バッファーを準備します。
2. 手術器具の準備:手術前にすべての手術器具をオートクレーブ消毒してください。手術部位には、細かいハサミ、曲がったハサミ、鉗子、曲がった止血鉗子(図1A)、注射器ポンプ(図1B)を順番に配置します。

3. DOX治療心臓からの心筋細胞の分離

注:心筋細胞分離手順の概観は 図2に示されています。すべての手術器具、機器、ソリューションが準備完了を確認したら、隔離を開始します。

1. 大動脈クランプと心臓切除
   1. マウスに3%イソフルラン麻酔をかけ、足の指^をつねっても反応がないか確認して麻酔を確認しましょう。
   2. ネズミを解剖板の上で仰向けに固定します。
   3. 心臓を露出させるために皮膚と胸壁に中央切開をし、降行大動脈を切開します。
   4. 右心室基部に制御された一定速度で7mLのEDTAバッファーを約1分間灌流し、虚血性曝露を最小限に抑え、特に脆弱なDOX損傷心臓において心室からの血液を迅速に除去します(図2A)。
   5. 昇行大動脈を素早くクランプし(図2B)、心臓を切除し、直ちに氷冷EDTAバッファーを含む100mmの皿に移します。
      注意:開胸術から心臓移植までの総時間は、虚血を最小限に抑えるために理想的には2分以内に抑えるべきです。
2. 灌流装置
   1. 周囲の組織を丁寧に切り取ってください。
   2. 心臓を氷で冷えた灌流バッファーを入れた解剖皿に入れます。
   3. 左心室の頂点に10mLのEDTAバッファーを留置針で6分間安定的に灌流し、細胞外接続を不安定化させます。
   4. 心臓を別の100mm皿に移し、同じカテーテルに3mLの灌流バッファーを2分間灌流して心臓チャンバーから残留EDTAを除去します。
      注意:灌流中に心臓の腫れを観察し、大動脈を湾曲型止血鉗子で固定して閉鎖灌流系を確立してください。灌流速度と圧力を慎重に制御し、過剰な静水圧を防ぎ、左心房破裂のリスクを最小限に抑えましょう。
3. 酵素的消化
   1. 切除した心臓を5mLの酵素消化液を含む100mmの皿に移します。
   2. インディングニードルを酵素消化液を入れた20mLの注射器に接続し、滅菌指示テープを使ってバイオセーフティキャビネットの作業面にしっかりと固定します。
   3. 注射器をマイクロインジェクションポンプに入れ、3分/mLの制御された速度で灌流を開始します(図2C)。
   4. 左心室に酵素溶液を灌流し、60〜90分間、消化が完了します。消化は組織の弾力性の完全な喪失と心室表面の淡色化を示すものです(図2D)。初回灌流後に消化不良が確認された場合は、消化を継続させるために酵素溶液を15〜20mL追加投与します。
      注意:注射器交換時の針のずれを防ぐこと;もし外れた場合は、灌流経路を保持するために元の左心室部位に再挿入してください。
4. 組織解離
   1. 消化した心臓を5mLの停止バッファーを含む60mmの皿に移します。
   2. 細かい鉗子を使って心室組織を小さな破片に引き裂きます(図2E)。
   3. 5mLピペットで心室組織懸濁液を優しく洗浄し、個々の心筋細胞を解離させます(図2F)。
   4. 細胞懸濁液を100μmの細胞ストレーナーでろ過し、大きな組織断片を除去します。
   5. ストレーナーは細胞収量を最大化するために、さらに5mLの停止バッファーですすぎます。
      注意:すべてのトライチュレーションステップを優しく行い、心筋細胞への機械的損傷を避けるため、ピペッティング回数は最大50回以内に制限してください。
5. カルシウムの再導入
   注意:心筋細胞は15 mL遠心分離機管内で3〜4回連続の15分間の重力沈降期間を受けさせます(図2G)。沈殿後は、上澄液の80%を慎重に除去し、ペレットをその後のカルシウム再導入バッファー3 mLに再懸濁します。各ステップ¹⁶で、準備した勾配溶液を用いてカルシウム濃度を段階的に増加させます。
6. セルカウントとプレート化
   1. ヘモサイトメーターを用いて細胞密度を定量し、桿状心筋細胞と丸みを帯びた心筋細胞の割合を計算^します(図2H)。
   2. 1-5×10個^の5 細胞を培地に浸し、ラミニン(10 μg/mL)でコーティングされた6ウェルプレートに37°Cで1時間、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。プレートは1日前に用意し、必要に応じて4°Cで保存してください。培地は1時間後に新鮮で予温された培地に切り替え、その後は48時間ごとに交換してください。
      注意:プロトコルはステップ3.6の後に一時停止可能です。細胞は短期培養で最大6時間維持し、即時の実験が可能です。

4. 免疫染色による心筋細胞の構造的完全性の評価

1. 4%のパラホルムアルデヒドを室温で15分間固定します。
2. PBSで細胞を3回、各5分ずつ洗います。
3. 0.1%のトリトンX-100をPBSで10分間浸して細胞を透過させ、PBSで3回、各5分洗浄します。
4. PBS中に1%のBSAで非特異的結合を1時間ブロックします。
5. サルコメリックαアクチニンに対する一次抗体を4°Cで一晩培養します。
6. PBSで優しく3回洗浄し、適切な蛍光セカンダリ抗体と室温で1時間培養します。
7. PBSで優しく3回洗い、その後DAPIで核を5分間カウンターステインします。
8. ガラススライドのマウントカバースリップはアンチフェードマウントメディウムを使っています。
9. 蛍光顕微鏡を使って染色パターンを可視化します。

5. 分離された心筋細胞におけるアポトーシス信号伝達の解析

1. タンパク質抽出と定量化
   1. RIPAベースのバッファーに溶成心筋細胞をプロテアーゼおよびリン酸酵素阻害剤で補完します。
   2. ホモジネートを12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清液を採取し、その後の分析を行います。
   3. ビシンコニン酸比色法を用いてタンパク質濃度を測定します。
2. ウェスタンブロット解析
   1. SDSポリアクリルアミドゲル上に30μgのタンパク質を分離し、分解したタンパク質をPVDF膜に移します。
   2. TBSに1%のTween-20を含む5%の無脂肪乳で膜を遮断し、その後、Bax、Bcl-2、切断カスパーゼ-3に対する一次抗体とともに4°Cで一晩培養します。これらはDOX心毒性研究で一般的に評価される主要なタンパク質マーカーです¹⁷。
   3. 適切なホースラディッシュ過酸化酵素結合二次抗体と共にインキュベートします。強化化学発光試薬を用いて信号を検出し、デジタルイメージングシステムで画像を取得することができます¹⁸。
3. データ分析
   1. 3つの独立した生物学的複製からのSEM平均±定量データを提示します。
   2. GraphPadプリズムを用いた統計解析を行い、複数のグループや時間点を比較するために双方向ANOVAを適用し、2つのグループ間の比較にはペアなしの両側t検定を適用します。 p値<0.05は統計的に有意とされました。

結果

細胞収量と生存可能性の評価

DOXを投与されたマウスは、生理食塩水処理群と比較して体重が著しく減少しました(補足図1A)。急性DOX誘発性心毒性モデルの確立は、cTnTやCK(補足図1B,C)を含む血清心損傷マーカーの著しい増加と、心臓切片の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンド標識(TUNEL)染色で示される心筋細胞アポトーシスの著しい上昇によってさらに確認されました(補足図1D)。

心筋細胞はモデル確認直後に分離されました。顕微鏡検査では、生理食塩水およびDOX処理心臓の両方から、桿状で静止状態の心筋細胞が一貫して検出されたことが示されました(図3A,B)。培養表面への短時間の付着後、高倍率画像診断により...

ディスカッション

高品質でカルシウム耐性のある成人心筋細胞の成功した単離は、心臓病態生理の細胞レベルでの研究に不可欠です。このプロトコルは、健康なマウス心臓と病的なマウスの心臓の両方から機能的な心筋細胞を確実に得ることができ、特に細胞の生存能力を維持するために重要な2つのステップがあります。まず、酵素灌流の持続時間を慎重に最適化し、監視してください。消化が不十分だと組織解離が悪く収量が低くなりますが、過剰消化は構造的な完全性を損ない、細胞が過収縮または丸みを帯びてしまいます。最適なエンドポイントは組織の弾力性の喪失と心室の淡色によって示されます。DOX処理マウスのような病理的な心臓はより脆弱であり、この最適な窓を狭めます。標準的な消化時間から始め、観察された細胞の収率や品質に応じて調整します。次に、初期のカルシウムフリー灌流によって誘発される逆カルシウム麻痺に段階的にカルシウムを再導入します。カルシウムを徐々に回復させることで、心筋細胞はカルシウムの恒常性と収縮機能を回復します。この段階をスキップしたり加速したりすると、過収縮が起こり、生存率は著しく低下します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100mmセルクルーチャーアンテナ	ジェットバイオフィルトレーション	TCD000100
100 & mu;M細胞ストレーナー	コーニング	431752
15 mL遠心分離機チューブ	ジェットバイオフィルトレーション	CFT011150
50 mL遠心分離機チューブ	ジェットバイオフィルトレーション	CFT011500
60mm細胞培養皿	ジェットバイオフィルトレーション	TCD100060
牛血清アルブミン(BSA)	シグマ・オルドリッチ	A1470
コラーゲンII	シグマ・オルドリッチ	C6885
コラーゲナーゼIV	シグマ・オルドリッチ	C5138
湾曲止血鉗子	RWDライフサイエンス	F2003-10
湾曲端はさみ	RWDライフサイエンス	S12001-09
細いハサミ	RWDライフサイエンス	S12000-09
鉗子	RWDライフサイエンス	F13014-12
留置カニューレ(26G)	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	381312
インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)	メドケムエクスプレス	HY-150287
イソフルラン	RWDライフサイエンス	R510-22-10
ラミニン(マウス)	サーモ・サイエンティフィック	23017015
脂質濃縮物(化学的に定義された)	メドケムエクスプレス	HY-K3019
M199 ミディアム	シグマ・オルドリッチ	M4530
ペニシリン・ストレプトマイシン	メドケムエクスプレス	HY-K1006
プロテアーゼXIV	シグマ・オルドリッチ	P5147
滅菌指示テープ	ミネソタ鉱業製造(3M)	CT060934701
シリンジポンプ(ISPLab01)	宝定神辰精密ポンプ	SC-49464A