伝統中国医学の処方による腸内組換えアデノ関連ウイルスの吸収強化

サマリー

ここでは、腸内吸収における伝統中国医学(TCM)と組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)との相互作用を評価するための内翻腸嚢モデルを確立するプロトコルを提示し、経口遺伝子送達戦略の最適化のための エクスビブ プラットフォームを提供します。

要約

経口組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)の送達は大きな治療効果を秘めていますが、非効率的な腸吸収により制限されています。経口製剤で広く用いられている中医(TCM)は、有望な吸収促進剤の供給源です。しかし、rAAVの取り込みやトランスダクションに対する潜在的な影響はまだほとんど解明されていません。反出腸嚢モデルは、これらの相互作用を定量的に 外部 で調査するプラットフォームを提供します。ここでは、反転腸嚢モデルを用いて腸上皮を越えたアデノ関連ウイルス(rAAV)転座と、制御された実験条件下での腸組織内での遺伝子伝達を定量的に評価する詳細なプロトコルを紹介します。主なステップは、実験室の齧歯類から小腸セグメントを採取し、節節を反転させて嚢を形成し、各嚢を酸素バッファーで満たすことです。反脱した嚢はrAAV粒子を含む酸素付きバッファーに浸され、37°Cで培養されて腔体露出とベクター輸送を可能にします。エンドポイント解析では、上皮を通過したrAAV粒子の内部(血清液)をサンプリングし、トランスジェーン発現のために嚢組織を解析してトランスデュクション効率を測定します。複数の腸領域を検査することで、プロトコルはセグメントごとのrAAV取り込みの違いに関する洞察を提供します。さらに、培養時に古典的なTCM処方であるGZNGの導入により、ベクターの取り込みおよびトランスダクションへの影響を評価することが可能となります。内翻腸嚢アプローチは、rAAV血清型、送達促進剤、rAAVベクターとTCM成分間の相互作用のスクリーニングに貴重なプラットフォームを提供します。このシンプルで並列化可能な設計により、前臨床試験での高スループットスクリーニングも可能となります。

概要

組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)は全身性遺伝子治療の有望なプラットフォームであり、現在3つの主要な送達経路が検討されています:静脈内注射¹、腹膜内注射²、経口投与³。静脈内および腹膜内注射の経路は広く研究されていますが、非侵襲的アプローチである経口投与は比較的十分に研究されていません。経口rAAV投与の実現可能性はXinら4によって初めて示^{され、彼らは}rAAV2経口投与後に腸粘膜の誘導と抗HIV免疫応答の誘導に成功したと報告しました。同様に、Haraら^3,5は経口rAAV/Aβが消化管粘膜を伝達し、脳アミロイド沈着を減少させることを示し、Steelら6は経口ワクチン接種が筋内注射に比べて生存率と抗腫瘍免疫が優れ^{ていることを発見しました}。同じ研究ではrAAV6がrAAV5よりも強い腸内トロピズムを示すことが報告されています。ワクチン応用以外にも、他の疾患モデルでも治療的可能性が達成されています。Maら⁷およびHaoら8は、経口rAAVが消化管伝達後にそれぞれ肝臓および胃における腫瘍抑制および抗線維化治療をもたらす^{ことを証明しました}。Huangら9は、経口投与後に茶色脂肪組織を選択的に変換する遺伝子組み換血血清型Rec2^を同定し、静脈内投与で観察された肝の傾向性とは対照的である¹⁰。これらの先駆的な発見にもかかわらず、経口rAAV投与に関する研究は限定的なままであり、これは大規模評価のためのin vitroスクリーニングシステムが不足していることが一因である。

ウィルソンとワイズマンによって1954年に開発された内翻腸嚢^{モデルは、}腸内薬物吸収機構の研究において依然として貴重なin vitro プラットフォームである。他の吸収シミュレーター装置とは異なり、このシステムは単純な受動的拡散を超えた複数の生理学的プロセスを独自に考慮^{している。この}特性はTCM^の研究に特に有利である。このシステムを使うと、TCM化合物は消化管全体でセグメント依存的な腸吸収パターンを示すことが多いことが記録されている。例えば、ある研究では五戒三産の複数のアルカロイドが異なる腸区画で選択的に吸収され、空腸と回腸が最も活発^{な取り込み}を示すことが示された。さらに、TCM成分の併投与は腸の吸収を調節する効果があります。Liaoら¹⁵ は、Radix Angelicae dahuricae抽出物との併用がプエラリンの腸内吸収を著しく促進し、TCM相互作用が節節取り込みに与える影響を強調しました。したがって、内翻腸嚢モデルはTCM製剤や他の薬剤に内在する複雑な吸収挙動と相乗相互作用を解明するのに理想的なツールとなります。

rAAV吸収研究に適したモデルを選ぶには、生理学的正確さ、技術的複雑さ、スループットとのトレードオフを細かく理解する必要があります。以下の表は、腸内吸収の研究に用いられる主要な実験モデルをまとめたものです。

本研究は、腸内翻モデルが組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターの腸内吸収を調査するために用いられることの概念実証を提供します。TCMの併用投与がrAAVベクターの腸内吸収にどのように影響するかについて貴重な洞察を提供し、生理学的に関連性の高い条件下での機序的相互作用のさらなる特性評価の必要性を強調しています。このアプローチを通じてTCM強化経口投与戦略を最適化することは、非侵襲的なrAAV治療薬の開発を促進し、患者の遵守率と治療の利用性を向上させる可能性があります。

研究者は、実験目的に合致するかを確認するために、以下の基準に基づいて腸内旋嚢モデルを評価するべきです。適切な用途には血清型の迅速なスクリーニング、アジュバント/増強剤評価、地域動態学が含まれるが、不適切な適用や制限には長期発現研究(>48時間)や全身薬理学が含まれる。

プロトコル

すべての動物処置は、海軍医科大学動物倫理委員会が承認したガイドライン(CHEC (A.E)-2025011)に厳格に従って実施されました。

1. タイロデ溶液およびウイルス溶液の調製

1. タイロードの解の前条件付け:
   1. 500 mLのタイロデ溶液(pH 7.4)を2つ調製します(材料 表参照)。
   2. 一方のアリコートを4°Cに冷やし、もう一方を37°Cに温めます。
   3. 各アリコットに95%のO₂/5%のCO₂で泡状にします。
2. ウイルス溶液の調製:
   1. 組換えAAV9-CMV-EGFPを37°Cのタイロデ溶液に加え、最終濃度1 x^{10 11} vg/mL(コントロール条件)にします。
   2. 実験状態については、AAV9-CMV-EGFP製剤にTCM製剤GZNG(表2)を車両中に溶解させ、最終濃度200 mg/mLに補足します。
   3. GZNGのみの対照群については、AAV9 CMV-EGFPを含まないタイロデ溶液にGZNG(200 mg/mL)を加えます。
      注意:感染力を保つために、使用直前にウイルス希釈を準備してください。GZNG溶液のpHはおよそ5.0〜6.0です。

2. 動物の調製および腸組織採取

1. 断食:手術前に8週間のスプラグ・ドーリーラットを24時間断食してください。この期間中は水分補給のために水を自由に提供してください。
   注:断食は腸内成分を最小限に抑え、 生体外 実験中の腸吸収の正確な測定に役立ちます。
2. 断食前に動物の健康状態を確認し、良好な状態であることを確認してください。苦痛や病気の兆候がある動物は研究から除外してください。
3. 深麻酔を誘発するためにペントバルビタールナトリウム(200 mg/kg)を腹腔内投与します。動物が完全に麻酔されているか、反射や安定した呼吸の有無を確認します。
   注意:ペントバルビタールは有害な規制薬物です。皮膚接触や吸入を避けるため、ファンムフード内で手袋と個人防護具(PPE)を着用して取り扱い、安全な処分と緊急対応のための機関ガイドラインに従ってください。
4. 深部麻酔が確認されたら、頸椎脱臼による安楽死を行います。
5. 腹部および胸部を75%エタノールで綿棒で拭き取り、皮膚を消毒し、手術中の微生物汚染を減らします。
6. 無菌手術用ハサミを使って腹部の中央に切開し、腹膜腔を露出させます。
7. 腹部と腸を優しく切り離し、露出させます。処置中は無菌のドレープを使って周囲の組織や臓器を保護してください。
8. 胃と近位十二指腸を分離するために幽門括約筋を慎重に切断してください。その後の処置のために十二指腸を無傷に保つようにしてください。
9. 直腸と肛門の接合部で遠位大腸を切り離し、周囲の組織への損傷を避けます。
10. 細かい鉗子やハサミを使って、腸間膜の付着部を小腸から優しく外します。腸間膜を伸ばしたり裂いたりしないよう注意してください。
11. 直ちに、無傷の小腸を酸素入りクレブス・リンガー緩衝液(タイロデ溶液、4°C)の氷冷溶液に移します。

3. 体外 反転腸嚢準備

1. 選択された腸区画は以下の通りです。幽門から10cm遠位に位置する8cmの区画が十二指腸区画と呼ばれました。
2. 十二指腸節の16cm先から8cmの空腸節を採取します。
3. 空腸節のさらに16cm先から8cmの回腸節を取得。
4. 結腸については盲腸盲端から近位5cmの8cmのセグメントを採取します。
   注意:組織が弾力性があり無傷であることを確認し、準備中に反転に適した状態であることを確認しましょう。
5. 2mLの氷のように冷たく酸素化されたタイロデ液を注入した注射器で腸内腔をすすぐ。
6. 無菌性を維持し汚染防止のために、機関のバイオハザード廃棄物プロトコルに従って廃棄物を処分してください。
   注意:生物廃棄物は手袋と適切な防護具を使用して取り扱い、感染性物質への曝露を避けてください。環境汚染を防ぐため、機関のバイオハザード安全ガイドラインに従ってすべての生物廃棄物および排水物を処分してください。
7. 腸の近位端を4mmの研磨ガラス棒に挿入します。粘膜の裂け目を防ぐために、ロッドの表面が滑らかであることを確認しましょう。
8. セグメントの遠位端を2-0シルク縫合糸で結び、組織をロッドに固定します。逆立時にも組織が安定していることを確認します。
9. 腸の部位を優しく内側に伸ばし、組織を棒に沿って滑らせて粘膜が完全に露出するまで続けます。組織の完全性を維持するために過度な伸縮やねじりは避けてください。
10. 漏れを確認するために、氷のように冷たいタイロデ溶液を2mL内腔に注入します。許容される漏れは1分以内に<5%であるべきです。漏れが検出された場合は縫合糸を調整し、粘膜表面の完全な反転を確認してください。
    注意:酵素分解を最小限に抑え組織の生存性を維持するために、冷たい環境で反転を行ってください。
11. 内翻した節の開口端に長さ5cmの3mmガラス毛細血管を挿入し、灌流口として使います。粘膜裂け目を防ぐためにカニューレを優しく前進させます。
12. カニューレは2-0シルク縫合糸で固定します。カニューレが崩れたり液体の流れを妨げたりしないように固定してください。
13. 腸嚢の正しい形状を維持するために、縫合線に優しく張りをかけてください。ねじれや曲がりは灌流を妨げ吸収に影響を与える可能性があるため、注意してください。
14. 過度な締め付けは組織を損傷したり、嚢を変形させたりする恐れがあるため避けてください。実験中は均一な張力を維持してください。外翻した腸嚢を定期的に漏洩や構造損傷の有無を調べてください。漏れが5%を超える場合は、進行前にセグメントを修復または交換してください。

4. AAVトランスダクションとインキュベーション

1. 各内翻した嚢を、37°Cの酸素入りタイロデ溶液4mL入った7 mL円錐形チューブに入れます。
2. ウイルス溶液を加える方法は以下の通りです:対照群:AAV9-CMV-EGFP単独;実験用:AAV9-CMV-EGFP + GZNG。
3. 37°Cで静的に2時間培養し、その間に95%の_O2/5%_CO2 の気体混合物を溶液に継続的に泡入れします。

5. サンプリング、エンドポイント処理および解析

1. 時間経過サンプリング
   1. 0、30、60、90、120分ごとに、各腸嚢から50μLの精液を、校正済みマイクロシリンジを使用して抽出します。気泡を導入せずに正確なサンプリングを行ってください。
   2. 抽出した流体を直ちに50μLの予温(37°C)タイロデ溶液に置き換え、浸透圧バランスと内部容積を維持します。抽出と交換の間の時間を最小限に抑え、一貫した実験条件を維持します。
      注意:マイクロシリンジ(例:ハミルトンシリンジ)を使用する際は、無菌を保ち、腸嚢膜の損傷を防ぐために慎重に扱ってください。
   3. 各時点で迅速にサンプリングを行い、インキュベーション環境の攪乱を最小限に抑えましょう。
2. ウイルス価決定
   1. 製造元の指示に従い、市販の動物ゲノムDNA抽出キットを用いて血清液から全DNAを抽出します。
   2. qPCRでrAAVベクターゲノムコピー数の絶対定量を行います。ITRプライマー付きのSYBRグリーンキットを使用します。標準的な96ウェルプレート上で、サーマルサイクラーを用いて以下のサイクル条件でqPCR増幅を行います:初期変性:95°Cで10分間;変性:95°Cで15秒;アニーリングおよび拡張:60°Cで1分間;合計40サイクル
   3. ゲノムコピー数を定量化するには、プラスミドrAAV-CMVp-gfp(1 ng、0.1 ng、0.01 ng)の連続希釈を用いて標準曲線を生成します。これらの希釈値を用いて、対応するサイクル閾値(Ct)値に基づいてウイルスゲノムコピー数を計算します。
   4. 標準曲線を用いて採取した精液中のベクターゲノムコピー数を決定します。結果は抽出されたDNA100 ngあたりのゲノムコピー数として報告されました。
      注意:DNA抽出およびqPCR分析中に汚染を防ぐため、すべての試薬および機器が無菌であることを確認しましょう。qPCRの精度を検証するために、ノーテンプレートコントロール(NTC)やプラスミド標準を含む適切なコントロールを用いてください。
   5. 各サンプルに対してqPCRを三倍ずつ行い、結果の再現性と信頼性を確保します。
3. 末端組織処理
   1. 滅菌ピペットで各腸嚢から残留する腔内液をすべて吸引してください。組織が破裂しないように慎重に扱ってください。
   2. 残留培地、細菌、不純物を除去するために、各嚢を1%のペニシリン・ストレプトマイシン(P/S)を含むリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗い流します。下流の施布のために無菌性を維持するために徹底的に洗浄してください。
   3. 腸組織を^{2 mm 3} (2 mm * 2 mm * 0.5 mm)の断片に切断し、無菌の外科用ハサミまたは刃物を使用します。一定の培養のために断片は均一な大きさに保ちます。
   4. 組織断片を10mLのDMEMに10%のFBSおよび1%(v/v)P/Sを補足し、37°Cで加湿インキュベーター(5% CO₂)で48時間培養します。培養培地は12時間ごとに更新してください。
      注意:この工程は組織の生存性を維持し、実験後の細胞回復を可能にします。切断および洗浄時には粘膜が無傷であることを確認しましょう。残骸や微生物汚染物質を除去するために、3回の完全なPBS洗浄を行います。代謝活動と組織の健康をサポートするために、一定の温度(37°C)と高湿度を維持してください。
      注意:組織断片は無菌器具で取り扱い、上皮の完全性を保つために機械的応力を避けてください。
4. 孵化後の解析
   1. アリコットA(組織学的分析):
      1. 細胞構造を保存するために、4%パラホルマルデヒド(PFA)に24時間固定します。
      2. 固定後、組織をOCT化合物に埋め込み、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、組織の完全性と形態を評価します。
         注意:パラホルマルデヒドは有害な固定剤です。適切な個人用防護具を用いて、排気フード内で取り扱ってください
   2. Aliquot B(蛍光解析およびゲノム定量):
      1. 残りの組織を液体窒素でスナップ冷凍し、-80°Cで保存し、さらなる処理を待つ。
      2. 凍結サンプルを蛍光顕微鏡で用いてEGFP発現を検出し、トランスフェクション効率やウイルスの取り込みを評価します。
      3. DNA抽出を行い、その後qPCRを行ってウイルスゲノムコピー数やトランス遺伝子発現を決定します。

結果

このプロトコルは、AAV9を媒介した遺伝子送達の小腸の異なるセグメント間での効率性と、GZNG治療が遺伝子移動および発現の促進に与える影響を評価するために用いられました。いくつかの重要なアウトカムが観察され、プロトコルの成功した適用と特定の条件下で生じうる変動性の両方を示しました。

小腸(十二指腸、空腸、回腸、結腸)における組織学的(H&E染色)および蛍光(EGFP)解析によるAAV9媒介EGFP発現の評価により、すべての組織で成功したトランスダクションが認められました(図1)。ブライトフィールド画像(図1A–D)はこれらの組織の構造的完全性を示唆し、正常な組織学的構造を示しました。対応する蛍光画像(図1E–H)では全領域で明確なEGFP発現が示され、緑色蛍光は効果的なウ...

ディスカッション

本研究では、古典的な上翻腸嚢モデルを適応させて腸内rAAV吸収を評価する新しい in vitro アプローチを確立しました。この手法により、制御条件下で小腸内のAAVトランスダクション効率のセグメント特異的解析と、TCMとrAAVの相乗効果の評価が可能となります。ここでは、重要なステップ、トラブルシューティングおよび修正、制限事項、遺伝子治療および薬物送達におけるそれらの広範な応用について議論します。

重要な技術的ステップ
rAAVトランスダクション研究に内翻腸嚢モデルを実装するには、プロトコルの成功に不可欠ないくつかの技術的ステップへの注意が必要です。組織の選択と準備が極めて重要です。腸のセグメントは一貫して採取し(例:解剖学的ランドマークに対して定義された長さの十二指腸、空腸、回腸、または結腸など)、再現性のある結果を得るべきです²⁴。腸嚢反転プロセス自体は技術的な洗練が求められる重要な工程です。潤滑剤を塗...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	WISENT	319-005-CL	液体、4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウム
EGFP CDS 地域qPCRプライマー			女性:5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3';R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
胎児用牛血清	WISENT	086-550	高品質、一次細胞培養グレード
ペニシリン・ストレプトマイシン(P/S)	WISENT	450-201-EL	この溶液には10,000単位/mLのペニシリンと10,000単位のマイクロペニシリンが含まれています。g/mLのストレプトマイシン。
PrimeScript RTマスターミックス(パーフェクトリアルタイム)	タカラ	RR036A
TaKaRa MiniBEST ユニバーサルRNA抽出キット	タカラ	9767
チンケ TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCRミックス		TSE401	この製品はSYBRグリーン染料法を用いた蛍光定量実験に適しており、さまざまなリアルタイム蛍光定量PCR機器と互換性があります。
ツィンケ TSP202-200 Trelief ハイピュア動物ゲノムDNAキット		TSP202-200
タイロデの解決策	ユアン・イェ	R20268-500ml	主に塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸塩、塩化カルシウム、グルコース、HEPESで構成されています。