一次ヒト子宮内膜上皮細胞の単離および長期増殖のための簡略かつ堅牢なプロトコル

Summary

ヒト子宮内膜上皮細胞(HEEC)の一次培養は技術的に難しいものです。このプロトコルは、混合酵素消化とROCK阻害剤(Y-27632)を組み合わせ、上皮の同一性を維持しつつ細胞の生存と増殖を改善し、子宮内膜研究および再生応用のための堅牢なプラットフォームを提供します。

Abstract

タモキシフェン関連子宮内膜過形成を含む子宮内膜疾患の研究は、堅牢な in vitro 上皮モデルの不足により制限されています。従来のヒト子宮内膜上皮細胞(HEEC)の単離方法は、しばしば非効率的で技術的に要求が高く、拡張性も低いです。ここでは、混合酵素消化、赤血球溶解、持続的ROCK阻害剤(Y-27632)治療を統合し、一次HEECの効率的な分離と増殖を可能にする簡略化されたフィーダーフリープロトコルを説明します。Y-27632の加入は、解離誘発性アポトーシスの緩和と初期段階の細胞接着の促進に不可欠です。このアプローチは連続通行を支援しつつ、少なくとも3回の通路で上皮の同一性を維持し、10通以上は形態を保持します。ウェスタンブロットおよび免疫蛍光による特徴付けにより、サイトケラチン18およびE-カデリンの高い発現が確認され、選択培養条件下ではビメンチン陽性間質汚染物質の減少が徐々に減少しています。主要な技術的制約に対応することで、この手法はメカニシス研究、疾患モデリング、薬物スクリーニング、子宮内膜研究における再生応用のための信頼性が高くスケーラブルな上皮細胞の供給源を提供します。標準化されたワークフローは複雑な共培養システムに代わる選択肢を提供し、高品質な一次細胞モデルへのより広範なアクセスを促進します。

Introduction

信頼性の高い in vitro モデルは、特にタモキシフェン(^{TAM)に関連する}子宮内膜疾患の研究を進展させるために不可欠です。TAMは乳がんの内分泌療法として広く用いられていますが、子宮内膜における部分的なエストロゲン作動薬活性は、子宮内膜過形成、ポリープ、場合によっては悪性変形の発生率を著しく増加^{させます。}現在のタモキシフェン関連子宮内膜病理の臨床管理は主にプロゲステロン療法または外科的介入に依存しており、いずれも重大な制約があります。プロゲステロン治療は、突破出血や体重増加などの副作用を伴うことが多い一方、外科的アプローチは不可逆的な子宮内膜損傷を引き起こし、妊娠能力を損なう可能性があります^。これらの限界は、機構的研究を支援し、治療戦略の改善を支援する堅牢な上皮モデルの必要性を強調しています。しかし、この分野の進展は主に高純度で拡張可能なヒト子宮内膜上皮細胞(HEEC)の取得における技術的課題によって制約されてきました。

この分野の基礎的な研究はArnoldら(2001)によって報告されており、彼らはコラーゲン酵素消化と逐次篩過を通じて間質細胞および上皮細胞集団を単離し、免疫染色で98%以上の純度を達成^{しました。}成功にもかかわらず、この方法は単一酵素消化に依存し、長時間の処理を必要とし、間質体や赤血球の汚染物質を除去するために段階的なろ過に依存していたため、作業フローは手間集約的で^標準化が困難でした。その後、Yokomizoら(2002)は、間質^給餌細胞との三次元共培養を用いて子宮摘出標本から一次HEEC培養システムを確立しました。フィーダーベースの微小環境は上皮の成長を部分的に支えましたが、通常は5回までの通過が限られており、大規模で安定した上皮拡張を必要とする用途にはあまり適^{していませんでした。}

これらの制約を克服するために、HEECの分離と長期培養のための簡略化かつ再現性の高いプロトコルが開発されました。ROCK阻害剤Y-27632がヒトケラチノサイト、歯肉上皮細胞、乳腺上皮細胞の一次培養効率を著しく向上させることを示す先行研究に基づき、同じ原理を子宮内膜組織^6,7,8にも適用しました。このアプローチには、効率的な組織解離を促進する混合酵素消化、早期汚染を減らし上皮の付着を促進する重要な赤血球溶解ステップ、そしてアポトーシス抑制、接着支援、増殖能力向上のためのY-27632の継続的な補給の3つの主要な特徴が組み込まれています。この戦略を用いることで、HEECsは上皮形態とCK18およびE-カ^{デリンの高い}発現を維持しつつ、複数の通路に拡張^{できます。}特筆すべきは、少なくとも3世代にわたる連続パッセージでは表現型の浮移が検出されず、培養システムの安定性と拡張性を示していることです。

この方法は、組織入力量の高い要件、複雑なワークフロー、再現性の低さ、増殖の可能性の限界など、一次HEEC培養における長年の技術的課題に直接対応します。上皮の同一性と機能的特徴を排出過程で保持することで、このプロトコルは子宮内膜再生、病態生理、高スループット薬物スクリーニング、細胞と生体材料の相互作用に関する研究に信頼できるプラットフォームを提供します。組織処理と連続拡張を統合することで、この標準化されたワークフローは生殖生物学における長年のボトルネックを解消し、組織工学、再生医療、個別化療法への将来の応用を支援します。

このプロトコルでは、採取後24時間以内に処理された新しい組織標本が必要です。細胞の収量や成長特性は、子宮内膜ポリープと正常な子宮内膜など、組織の由来によって異なる場合があります。一般的な失敗原因には、組織消化の不全、過剰な赤血球汚染、またはY-27632の不足補給などがあります。システムは複数の通路にわたる拡張をサポートしますが、拡張培養中の表現型安定性を維持するためにさらなる最適化が必要となる場合があります。

Protocol

浙江中国医科大学第一附属病院で患者から外科的に切除された子宮ポリープ標本から、新鮮な子宮内膜組織サンプルが採取されました。すべての処置は、浙江中華医科大学第一附属病院の医療倫理委員会が承認した指針(プロトコル番号2025-KLS-569-01、2025年9月14日承認)に従って実施されました。一次人体サンプルの取り扱いは、実験用コート、手袋、眼を保護するための適切な個人用防護具を用いてクラスIIの生物安全キャビネット内で行われました。すべての酵素試薬は、機関の安全規則および物質安全データシート(MSDS)ガイドラインに従って取り扱われました。

1. 組織の獲得

1. 成人女性から採取した手術標本から新鮮な子宮内膜組織を採取します。組織を10mLのリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)に3%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加した滅菌チューブに移します。
   注:すべての組織は手術採取後24時間以内に処理してください。

2. 組織の前処理

1. 組織を洗浄液(表1)で攪拌し、粘液や血栓を除去するために2回連続で2回洗います。
2. 組織を5mLの75%エタノールで5秒間短く洗い流し、表面を消毒します。
3. すぐに組織を20mLの洗浄液に移し、残留エタノールを除去するために2回洗い、各5分ずつ洗います。
   注意:エタノールは可燃性であるため、この工程は開放炎から離れ、エタノール含有廃棄物は機関の化学物質安全ガイドラインに従って処分してください。

3. 組織の消化と細胞収穫

1. 組織ミンシング
   1. 子宮内膜組織を2枚の無菌刃で粉砕し、1 mLのピペットチップで吸引できるまで(約10分間)断片(~2 mm³)を抽出します。
   2. 挽いた組織を50mLの遠心分離機チューブに移します。
2. 酵素的消化
   1. 組織断片を含むチューブに消化液10mL(表1)を加えます。
   2. チューブを37°Cの水浴で30分間孵化します。消化を促すために、チューブを15分ごとに優しく振ってください。
   3. 組織断片が目に見えて離脱し、放出された細胞によって溶液が濁るまでインキュベートを続けます。
3. 消化の終結
   1. 酵素による消化を終わらせるために中和溶液10mLを加えます。
   2. P1000ピペットを800μLに設定し、約15回上下にピペットして十分に混合します。
4. ろ過と遠心分離
   1. 消化した懸濁液を100μmのメッシュフィルターでろ過します。
   2. 遠心分離機で156 × g 、25°Cで5分間加熱します。
5. 赤血球(RBC)溶解
   1. ペレットを乱さずに上清液を慎重に吸引してください。
   2. 細胞ペレットを2mLの予備冷却した赤血球溶解バッファーに再懸浮させます。
   3. 氷(約4°C)で3〜5分間、優しく攪拌しながら孵化させます。
6. 溶解の終了
   1. 溶解反応を止めるためにPBSを≥mLまたは完全な培地に加えます。
   2. 遠心分離機で156 × g 、25°Cで5分間加熱。

4. 一次文化の開始

1. 洗浄と遠心分離
   1. ペレットを乱さずに上清液を慎重に吸引してください。
   2. ペレットを20mLの中和溶液に再懸浮させます。
   3. ピペッティングで約15回混ぜます。
   4. 遠心分離機で156 × g 、25°Cで5分間加熱します。
2. 再懸濁と播種
   1. 上清液を吸引してください。
   2. 細胞ペレットを10 mLの初期培養培地(10 μM Y-27632を含む)に優しく再懸浮させ、1 mLピペットで8〜10回ピペットを上下に行います。
   3. 細胞懸濁液を100mmの培養皿に盛り込みます。
      注意:最適な初期種子密度を得るために、推定細胞収量に基づいて培養容器を選択してください。予想収率が10個^の6 セル×>1個なら100mmの皿を使い、収率が低い場合は60mm皿を使いましょう。培地の容量を適切に調整します(例:100mm皿なら10mL、60mm皿なら4mL)。
3. 培養条件
   1. この皿は、_CO2含有5%の加湿大気で37°Cで孵化します。
   2. 培地をY-27632なしの新鮮な上皮培養培地に3日ごとに交換してください。
      注意:細胞の付着および形態を監視してください。細胞が増殖し始めたら、2日ごとに培地を更新してください。

5. 細胞の通過

1. トリプシン化の準備
   1. 培養が80%〜90%の合流に達したら、100mmのディッシュをインキュベーターから取り出します。
   2. 使った中程度のものは捨ててください。
   3. 細胞を2mLのPBSで2回洗い流します。
   4. 慎重に吸引し、残っているPBSを除去してください。
2. トリプシン化
   1. 皿に0.05%トリプシンを2mL加えます。
   2. 細胞層を均一に覆うように優しく回します。
   3. 37°Cで7分間培養します。
   4. 細胞を顕微鏡(40倍の客観鏡)で観察して剥離を確認しましょう。
3. 中和と収集
   1. 中和液8mLを加えてトリプシンの消化を止めます。
   2. 細胞懸濁液を15mLの遠心分離機チューブに移します。
   3. ピペットを約15回して単一細胞懸濁液を得る。
   4. 遠心分離機で156 × g 、25°Cで5分間。
4. 再懸止と再播種
   1. ペレットを乱さずに上澄液を吸引してください。
   2. 細胞ペレットを10mLの上皮細胞培地に優しく再懸浮させ、1mLピペットで約10回上下にピペットします。
   3. 10 mLの上皮細胞培地に10個×⁶ 個の細胞を新しい100 mm皿にシードします。
   4. 翌日に孤立した広範囲に分布した単一細胞や小さなクラスターを促進するよう、播種密度を調整して過密状態を防ぎます。
5. 航海後のメンテナンス
   1. 標準培養条件(37°C、_CO2 5%)で培養します。
   2. 培養を定期的に観察し、上皮細胞培地を2日ごとに交換してください。
      注:細胞は通常、健康で接着性のある単層(≥80%の合流が得られた後)に、1回または2回目の通過後に下流の応用に備えます。
      注意:一次ヒト細胞に接触したすべての物質は潜在的なバイオハザードとして扱われました。廃棄やさらなる処理の前に、これらの材料は施設のバイオセーフティガイドラインに従い10%の漂白剤で消毒されました。

Results

一次HEEC培養システムの確立が成功したことは、形態学的、増殖的、分子的評価によって確認されており、 図1に示されています。混合酵素消化、赤血球溶解、ROCK阻害剤を組み合わせることで、このプロトコルによりヒト子宮内膜組織から上皮細胞を効率的に分離し、安定的に増殖させることが可能となりました。

形態学的観察により、Y-27632が初期培養において重要な役割を果たしていることが示されました。10 μM Y-27632で最初の48時間培養されたHEECは素早く付着し、3日目までに典型的な石畳パターンのまとまった上皮島を形成しました(図2)。これらのコロニーは5日目と7日目にかけて着実に拡大し、最終的に合流した上皮層を形成しました。対照的に、Y-27632を持たない培養は、観察期間中に付着不良、増殖が遅く、組織化された上皮クラスターの発達に失敗しました。これらの形態学的差異は、活性的増殖アッセイ(

Discussion

ヒト子宮内膜上皮細胞(HEEC)の信頼性の高いin vitroモデルの確立は、子宮内膜生物学および病理学の研究に不可欠です^。HEECの分離のためにいくつかの手法が開発されていますが、ほとんどは技術的な複雑さ、低効率、膨^張電位の制限により制限^{されています。}多くのプロトコルはフィーダーレイヤーに依存しており、これが変動性を生み、スケー^{ラビリティ}を妨げます。本研究では、一次HEECの効率的な分離と安定的な拡大を可能にする効率的で再現可能なプロトコルを提示することで、長年の課題に取り組みます。この方法の成功は、効果的な組織解離のための混合酵素消化、初期純度を改善する専用の赤血球溶解ステップ、そしてROCK阻害剤Y-27632を補足した培地での培養という3つの主要成分の連続統合にあります。

このワ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	ソーラービオ	CAS:42613-33-2	HEECの隔離について
コラーゲナーゼタイプI	メルク	SKU:SCR103	HEECの隔離について
100 & マイクロ;Mメッシュフィルター	ソーラービオ	431752	HEECのろ過
ラビット・アンチCK18	アブカム	ab133263	HEECの分化マーカーを調べるための免疫蛍光染色
ラビット・アンチCDH1	アブカム	AB40772	HEECの分化マーカーを調べるための免疫蛍光染色
ラビット・アンチVIM	アブカム	AB16700	HEECの分化マーカーを調べるための免疫蛍光染色
4% パラホルムアルデヒド	ソラルビオ	P0099	HEECの分化マーカーを調べるための免疫蛍光染色
CO2インキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	42820906	細胞インキュベーションの場合
遠心分離機	エッペンドルフ	5404HN133048	セル遠心分離機
100mm細胞培養皿	コーニング	430167	細胞培養用
50ml遠心分離機チューブ	コーニング	430829	細胞遠心分離のために
1.5 mlマイクロ遠心分離機チューブ	ネスト	081722CK01	細胞消化のために
セルストレーナー	ソーラービオ	431752	細胞ろ過
リン酸塩緩衝溶液	テコノ	20201033	洗浄液
DMEM	ギブコ	8122622	中和媒体の成分
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモ・サイエンティフィック	15140-122	抗生物質
胎児用牛血清	ギブコ	2556132P	中和媒体の成分
0.05%トリプシン	バサルメディア	K431010	For HEECs 解離
Y-27632	ソーラービオ	IY0040	ROCK阻害剤
赤血球溶解バッファー	ソーラービオ	R1010	赤血球溶解
1% トリトン X-100	サーモ・サイエンティフィック	HFH10	膜の透過化
ロバ抗ウサギIgG	サーモ・サイエンティフィック	A32790TR	二次抗体
ダピ	サーモ・サイエンティフィック	62248	DNA染色
1台のPBST	ソーラービオ	P1031	洗浄バッファー
一次HEEC専用メディア	iCell	iCell-f004-002h	HEECの文化について
逆焦点顕微鏡	ツァイス	LSM880	免疫蛍光画像の取得に使用されます。40xを装備
MRC-5細胞株	iCell	iCell-h146	ヒト子宮内膜腺癌細胞株;STRのプロファイリング。
石川細胞株	iCell	iCell-h113	ヒト子宮内膜腺癌細胞株;STRのプロファイリング。