方法論記事

細胞外フラックスアッセイを用いた全再生ゼブラフィッシュ脳室の代謝活性をエクス ビブ で評価する

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DOI：

10.3791/70459

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2026年4月17日

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

この記事について

サマリー

本記事では、体 外 の成体ゼブラフィッシュ脳室の酸素消費速度および細胞外酸性化速度を定量化し、その酸化および解糖代謝能力を特徴づける詳細なプロトコルを説明します。

要約

ゼブラフィッシュが成体期を通じて心臓を再生できる能力は、部分的に代謝適応に起因しています。魚の心臓が解糖系に大きく依存していると仮説が立てられていますが、最近の研究では、酸化代謝が心筋細胞の再分化と成功した後期心臓再生の重要な要素としてより複雑な代謝プロファイルが明らかになりました。2025年には、シーホースアッセイ(細胞外フラックスアッセイ)を用いて、全ゼブラフィッシュ脳室の代謝プロファイルを体 外 で評価するための高スループット法を応用しました。この方法は、Seahorse XFe24アナライザーのXFミトストレス試験を用いて、基礎および最大酸素消費率(OCR)および細胞外酸性化率(ECAR)を迅速かつリアルタイムで評価することを可能にします。本記事では、ゼブラフィッシュ脳室全体に対して細胞外フラックス解析を行う詳細なプロトコルについて説明します。生体内全心のOCRおよびECARを生体 外 で定量化する能力は、発生、疾患進行、再生の重要なタイミングにおける心臓代謝を明らかにする機会を提供します。

概要

人間とは対照的に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は成虫の生涯を通じて失われた心臓組織を再生する能力を維持しています1。心損傷時、創傷境界帯の心筋細胞は分化を停止し細胞周期2,3に再入りし、心筋細胞数4を回復し創傷を再生します。近年、心筋細胞の再生過程における再分化の重要性が認識されています5.これら両方のプロセスは、ゼブラフィッシュの心臓における代謝変化によって厳密に調節されており、解糖によって増殖が促進され、酸化リン酸化(OXPHOS)が再分化を促進します8。代謝を操作するための薬理学的および遺伝学的手法は再生分野で広く普及しています6,7ですが、ゼブラフィッシュの心臓が小さいため、カニュレーション9,10,11や質量分析12やNMR分光8のための複数心臓のプール化のために複雑でカスタマイズされたセットアップが必要であるため、これらの摂動の代謝効果の検証は依然として困難です。13歳。

これらの制限を回避するために、最近、シーホースXFe24アナライザーを用いた全ゼブラフィッシュ脳室のエクスビブ8のハイスループット代謝プロファイリングを記述しました。細胞外フラックスアッセイは、細胞、膵島、球体の酸素消費率(OCR)および細胞外酸性化率(ECAR)を測定することを目的としています。これは、呼吸電子伝達系による酸素利用と解糖依存性乳酸産生に起因する酸素およびプロトン濃度(pH)の変化を検出する固体センサーによって実現されます(図1A)14。

細胞外フラックス解析は、96ウェルプレートセットアップ(XFe96およびXF Pro)、8ウェルミニプレート、または24ウェルプレートの各種バージョン(XFe24)で実施可能です。96ウェルプレートはスループットは向上しますが、センサーと井戸底部の間の作業距離は、ゼブラフィッシュ脳室全体を収容するには適していません。さらに、96ウェルプレート形式では、心室がメディア内に浮かび、センサーに干渉するのを防ぐためにウェル底部に固定する仕組みはありません。一方、XFe24アイレットキャプチャーマイクロプレートはもともと一次膵島の代謝特性解析のために設計されており、その結果、組織をウェルの底部に沈着させ、スクリーン(グリッド)で固定することが可能となっています。ゼブラフィッシュの心臓が小さいため、アイレットキャプチャマイクロプレートをゼブラフィッシュの心室に適用できるように適応でき、アッセイ期間中はグリッド下に固定されたままです。

ミトコンドリアの呼吸能力を評価するために、電子伝達鎖の4つの阻害剤とアデノシン三リン酸(ATP)シンターゼを用いたミトストレス試験を用いました(図1A)。まず、OCRの基準値を取得します(図1B、マゼンタ)。次に、複合体V阻害剤であるオリゴマイシンを注射します。オリゴマイシンはATP合成酵素活性を阻害し、その結果OCRの低下を引き起こします。これはATP産生に起因します(図1B、緑)。残りの酸素消費は、連結しない呼吸と非ミトコンドリア酸素消費の結果です(図1B、それぞれオレンジと灰色)15。オリゴマイシンの後、FCCPを注入し、これによりミトコンドリア膜を横断するプロトン勾配が消散します(図1A)。陽子勾配を回復しようと、ミトコンドリアは酸素消費量を最大限まで上位調整します(図1B、青)。最後に、ロテノンとアンチマイシンAの混合が用いられ、それぞれIおよびIII複合体を阻害します(図1A)。この薬剤の組み合わせにより、錯体IおよびIIIからIVへの電子の流れが欠如するため、ミトコンドリア呼吸電子輸送連鎖の活動が完全に停止します。これにより、非ミトコンドリアの酸素消費量の測定が可能になります(図1B、グレー)。

全体として、アイレットキャプチャーマイクロプレートとミトストレス試験を用いて、全ゼブラフィッシュ脳室の酸化および解糖代謝能力を迅速かつ再現性のあるアウトビボで評価することができました。以下にこの処置の詳細なプロトコルを説明します。最後に、外細胞フラックス分析装置で無損傷の野生型孤立心室の生存率を示し、凍結損傷後14日(DPCI)におけるミトストレステストを検証しました。

プロトコル

以下に述べる動物に関するすべての手技は、英国の改正された1986年の動物(科学的手続き)法および欧州の指令2010/63/EUに準拠して実施され、オックスフォード大学の動物ケア・倫理審査中央委員会によって承認されました。

注:このプロトコルは、フェノール赤および重炭酸塩を含まないSeahorse XFe24分析装置とSeahorse DMEM培地を用いて実施されました。

1. ゼブラフィッシュ心臓クライオ損傷(任意)

  1. 実験開始前に、地元の機関および国家当局から適切な倫理的承認を得てください。
  2. 先に述べた通り、ゼブラフィッシュの心臓にクリオアインを施す。

2. センサーカートリッジの水分補給

  1. 細胞外フラックスアッセイキットを開け、24ウェルのユーティリティプレート(図2A)を1ウェルあたり500μLのキャブラント溶液をピペットで充填します。
  2. センサーカートリッジとハイドロブースターを使ってユーティリティプレートを閉じます(図2A)。
  3. カートリッジとユーティリティプレートを37°Cの加湿インキュベーターで一晩(18〜72時間)孵化します。インキュベーション中はセンサーカートリッジの蓋をしっかり閉めたままにしてください。

3. 薬剤溶液および培地の準備

  1. 薬剤のストック溶液を作ってください:オリゴマイシンをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶かして10 mM濃度に、カルボニルシアン化物4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)をDMSOに5 mM濃度に、ロテノンをDMSOに10 mM濃度、アンチマイシンAをエタノール中に10 mM濃度に溶かし、すぐに使わない場合は-20°Cで保存します。
    注:2〜3ヶ月ごとに新鮮なオリゴマイシン、ロテノン、抗マイシン溶液を準備し、アッセイを実行する前にFCCP溶液を毎回調製することが推奨されます。
  2. 薬剤の作動濃度(500μMオリゴマイシン、300μMFCCP、各ロテノン/アンチマイシンA混合物各450μM)をDMEM培地で希釈して調製します。作動濃度の最終体積はオリゴマイシンが1.5 mL、FCCPが1.65 mL、ロテノン/アンチマイシンAが1.8 mLであることを確認し、30ポート(カートリッジの阻害剤1つあたり24ポート、ピペッティングエラー補正用に薬剤あたり6ポート)を装填できるようにします。
    注意:ロテノン/アンチマイシンAに多少の沈殿が現れますが、よく混ぜれば最小限に抑えられます。3.2で述べられている濃度は、井戸に注入される薬物の最終濃度の10倍であることに注意してください。
  3. DMEM培地(pH 7.4)を10 mMグルコース、1 mMピルビン酸、2 mMグルタミンを含むように準備し、使用まで-20°Cで保存します。

4. 細胞外フラックス分析装置の起動

  1. 分析の一晩前に側面のボタンからアナライザーをオンにして、温度を環境と平衡させます。
  2. パソコンの電源を入れてWaveソフトウェアを開きます。
  3. ソフトウェアで ミトストレステスト を選択してください。
  4. ソフトウェアの左下にあるヒーターを停止させ、アナライザー内の温度を37°C以下から28〜29°Cまで下げ、ゼブラフィッシュ飼育の標準温度に近づけます。
  5. グループ 定義 ページ( 注入戦略 タブの下)で、 化合物カタログから各ポートに沈着する化合物を追加して注入戦略を設定します。ミトストレステストでは、ポートAにオリゴマイシン、ポートBにFCCP、ポートCにロテノン/アンチマイシンを追加します。ポートDには、このプロトコルでは使用されていないもう1つの薬剤を追加する能力があります。
  6. 実験戦略が定義されたら、注入戦略タブに存在する他のすべての事前設計戦略を削除してください。実験群(例:野生型および変異体)をグループのページ側で指定し、彼らが受ける注射戦略(ステップ4.5で定義されたもの)を指定します。注射戦略がグループ間で一致し、設計された注射戦略にも一致していることを確認してください。
  7. プレートマップページで、各サンプルの位置を24ウェルプレート上で指定するには、各グループをクリックしてからサンプルを含むウェルをクリックしてください。
    1. なお、4つのウェルは試料堆積には適していません(図2B)、背景補正に使用されるブランクとして使われます。各グループのサンプルがプレート全体に均等に分布し、測定や環境条件における位置バイアスを均等にしなければなりません。
  8. プロトコルページで、上記の阻害剤以外に追加の阻害剤がない場合は「コントロール」タブまたは「実験タブ」を削除し、ソフトウェアポートがカートリッジ上の薬剤の位置と一致していることを確認してください。
  9. ソフトウェアは各条件ごとに3サイクルの混合、待機、計測を自動的に設定します。サイクル数を10回のベースライン(未処理)、3回のオリゴマイシン、7回のFCCP、9回のロテノン/抗マイシンA測定に修正し、3D組織に作用しやすくします。各サイクルは3分の混合、2分の待機、3分の計測で構成されるようにしてください。

5. アナライザーの校正

  1. 加湿インキュベーターからカートリッジとユーティリティプレートを取り出します(ステップ2.1–2.3参照)。
  2. ハイドロブースターと蓋(図2A)をカートリッジから外し、センサーカートリッジをキャリブラントを含むユーティリティプレートに置きます。
  3. 阻害剤をそれぞれのポートに優しくピペットし、ピペットの先端でポートの側面壁に触れて液体の滑らかな流れを確保します:ポートAにオリゴマイシン50μL、ポートBに55μLのFCCP、ポートCに60μLのロテノン/アンチマイシンAを注ぎます(図2C)。
    1. 液体はポートの穴の表面張力によってのみ保持されるため、この段階以降は急にピペッティングやテープでカートリッジを貼るのは避けてください。センサーポートに液体が入らないように注意してください(図2C)、これはアナライザーを損傷します。
  4. ソフトウェアの 「開始実行 」をクリックし、実行に名前を付けてパソコンに保存します。この時点で、分析器のトレイが開き、カートリッジとユーティリティプレートを配置します。
  5. 薬剤を装填したカートリッジと、キャリブラントを含むユーティリティプレートを、トレイのプレートマップ(左上のA1ウェル)に従ってアナライザートレイに置き、適切なフィット感を確保します。トレイに積む前に、消火栓ブースターと蓋(図2A)をプレートから外してください。これを怠るとアナライザーが損傷します。
  6. 準備ができたら、アッ セイを実行するボタンを押してアッセイ開始を指示します。この時点でアナライザーは搭載されたトレイを受け取り、キャリブレーションを開始します。
  7. 心臓隔離を開始します(ステップ6.1–6.12参照)。校正は約40分かかりますが、プレートは心臓を分離してアイレットキャプチャマイクロプレートに配置するまで分析装置内に保持可能です(図2B,D)。

6. 魚の心臓を分離し、24井戸のアイレットプレートに積み込む

  1. アイレットキャプチャーマイクロプレートを開け、室温で500μLのDMEM(10 mMグルコース、1 mMピルビン酸、2 mMグルタミン)を24ウェルのアイレットプレートに充填します。
  2. すべてのグリッドを室温のDMEMメディアを含む35mmペトリ皿に入れ、完全に浸けて大きな気泡がないことを確認してください。
  3. 室温でDMEM(10 mMグルコース、1 mMピルビン酸、2 mMグルタミン)を含む追加の35 mmペトリ皿を準備します。これは採卵時に心臓を洗浄し、心室を心房および動脈球から切り離するのに役立ちます。
  4. 5g/L MS-222で魚を1匹淘汰し、反射がないか確認します。
  5. 魚を92mmの培養皿に固定したスポンジに置き、心腔を開けて、先に説明した通りに心臓を解剖します。
  6. 心臓を室温の35mmペトリ皿(DMEM、10 mMグルコース、1 mMピルビン酸、2 mMグルタミン)で洗い流します。
  7. 35mmペトリ皿の鉗子を使って心房と乳球動脈を除去します。
  8. 心室を優しく振って圧迫し、血液が腔から抜けるようにします。心臓を洗浄する際に心室壁を傷つけないでください。
  9. 心臓をアイレット捕獲マイクロプレートの指定井戸に移し、プレートマップに従って適切な井戸の中心に沈みます。皿は常温のまま保ちます。たとえ目に見える拍動が止まっても、すべての心室をアッセイに含めてください。
  10. このプロセスをすべての魚に対して繰り返します。異なる実験群の代謝活性を比較する際は、次のグループに移る前に、1つのグループごとに1つの心臓を分離することを推奨します。分析装置では心臓は少なくとも180分間生存可能です(図3A)が、培地内の時間の均等な配分を確保するためのベストプラクティスとして、各グループにつき1つの心臓を分離することを提案します。
  11. すべての心臓が分離されたら(20個の心臓プレートで約60分)、アイレット捕獲マイクロプレートウェルの底に置き(図2B)、薄い鉗子でウェルの中央に位置付けます(図2D,E)。
  12. 鉗子を使ってグリッドで覆います(約20分)(図2D)。グリッドが正しい向き(メッシュが心臓側に向かって下向き)であること、そして大きな気泡が含まれていないことを確認してください。これは測定に干渉する恐れがあります(図2E)。
    1. グリッドが所定の位置に収まったら、鉗子で端から押して、かすかなカチッという音がするまで押します。鉗子で心臓をグリッドにぶつけないように注意してください。

7. 試料をアナライザーに読み込み、測定値を取得

  1. 心臓がアイレットキャプチャーマイクロプレートに封じ込められたら、すべての井戸が正常にキャリブレーションされているかソフトウェアで確認してください。これはコンピュータ画面の緑色のチェックマークで示されています。次に 、トレイを開けてユーティリティプレートを排出します。
    注意:この時点でカートリッジは排出されず、キャリブラントが入ったユーティリティプレートのみが表示されます。
  2. ユーティリティプレートを分析トレイ上のサンプルを含むアイレットマイクロプレートに交換してください。アイレットマイクロプレートが正しく位置(左上隅のA1)であること、そして蓋が取り外されていることを確認してください。蓋を外さないとアナライザーが損傷します。
  3. アイレットプレートが位置決めたら、 ソフトウェアにロードセルプレートを押して実験を開始するよう指示します。最初の約10分間は、センサーが平衡ステップを行い、その後測定が始まります。
  4. 実験が完了したら(約4時間)、排出 カートリッジ を押してトレイを開き、アイレットマイクロプレートとカートリッジを排出します。
  5. アイレットのマイクロプレートとカートリッジを取り外し、トレイを閉じるためにプレス ド をします。この時点で、収集されたデータを見るためにプレス ビューの結果 が表示されます。
  6. 測定値を保存し、アナライザーコンピュータからエクスポートし、分析インターフェースにアップロードしてさらなる解析と処理を行います。これにより、アナライザーからアイレットプレートとカートリッジが切り取られます。
  7. アイレットプレートとカートリッジをアナライザーから取り外し、蓋を使ってカートリッジを閉じます。
  8. アイレットプレートをドライアイスで凍結するか、心臓をウェルから取り出してください(ステップ8.2参照)、タンパク質分離(ステップ8)がすぐに行われない場合は-20°Cで保存します。
  9. データが保存されたら、ソフトウェア、アナライザー、コンピューターの電源を切ります。
  10. データを分析インターフェースにアップロードし、標準ビューオプションからOCRグラフを選択して可視化します。インターフェース上で、データをOCRおよびECARレベルまたはレートとして表示し、空井戸の背景補正を行い、プレートマップをクリックして可視化する井戸を選択し、表示または消滅させます。

8. 正規化のためのタンパク質単離と定量化

  1. プロテアーゼ阻害剤含有放射免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを10 mLのRIPAバッファーに溶かし、よく混合して準備します。
  2. まだ行っていなければ(ステップ7.8)、アイレットキャプチャスクリーンインサートツール(図2F)を使ってアイレットプレートのグリッドを外し、ハートを解放します。ハートはグリッドに引っかかっているかもしれないので、慎重に外してください。もしそうなら、鉗子を使って解放してください。スクリーンインサートツールでグリッドを取り外せない場合は、プレートをステレオスコープの下に移動させ、マイクロディセクションハサミを使って慎重にグリッドを切断して心臓を解放します。
  3. 各心室を、プロテアーゼ阻害剤で濃縮した200μLのRIPAバッファーを含む1.5mLチューブに氷上置いています。
  4. 使い捨ての乳棒を氷に乗せたホモジナイザーで心臓を均質化します。
  5. 提供された牛血清アルブミン(BSA)をRIPAバッファーで希釈して、以下の濃度で製備します:2000 μg/mL、1500 μg/mL、1000 μg/mL、750 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、25 μg/mL、0 μg/mL。
  6. ピアースBCA作動溶液(50:1、試薬A:試薬B、製造元の指示に従って)を準備します。必要な作動試薬の体積は以下の式で計算します。
    (標準剤数+サンプル数)×2×200μL
    注:この容量はサンプルと標準物質あたり200μLの作業溶液を使用可能であり、サンプルおよび標準単位での重複測定の取得を可能にします。
  7. 96ウェルプレートでは、各標準物質と各井戸ごとに25μLずつ重複を加えます。
  8. 1井戸あたり作業液を200μL加えます。
  9. プレートを37°Cで30分間孵化します。
  10. プレートを室温まで10分間冷やし、プレートシーラーで密封します。井戸内に気泡がないか確認してください。プレートリーダーを妨げる恐れがあります。気泡の数が限られている場合は、先端や細い鉗子で破裂させます。
  11. プレートリーダーを使って562nmの吸収を測定します。
  12. 標準物質の吸収度に基づいて標準曲線を作成し、サンプルのタンパク質濃度を計算します。
  13. 各ウェルの解析インターフェースの正規化タブ(図2G)にタンパク質濃度を記録します。

9. データ分析

  1. タンパク質含有量に対して正規化した後、分析インターフェースからデータをExcelまたはPrismファイルとしてエクスポートし、グラフ右上のクラウドボタンを使ってさらに分析します。
  2. 正規化されたデータを用いて、最初の3回の取得を除き、基準線のOCRとECARを基準測定の平均値として計算します。信号は最初の測定で不安定になる可能性があります。
  3. 正規化データを用いて最大OCRとECARを特定し、FCCP処理の上位3件の平均測定値を計算します。

結果

このプロトコルにより、ゼブラフィッシュ脳室全体のOCRおよびECARの定量化が可能になります。薬物治療を行わずに損傷のない野生型KCL心室を分析装置で培養することで、 生前 環境での心室の生存率を検証しました(図3A)。データは、脳室のOCRとECARが安定しており、少なくとも180分間は空井戸の基準値から有意に上昇していることを示しています(図3A)。このデータは、心室がこの 生体外 環境で正常な呼吸機能と生存率を示していることを示唆しています。

脳室に最適な用量を特定するために、さまざまな薬剤濃度や培地配合を用いた複数のOCR測定を行いました(図3B)。オリゴマイシン10 μM、FCCP 8 μM、ロテノン/アンチマイシン 25 μMの組み合わせを用いると、OCRフォールド変化(FCCP/基底)がわずかに増加し、[オリゴマイシン] 50 μM、[FCCP] 30 μM、[ロテノン/アンチマイシン] 45 μMを用いることを観察しました(図3B)。その結果、実験では後者の濃度を用いることにしました。心室は3次元構造であるため、薬剤は組織の外側細胞に強く作用し、腔室側の細胞には届かない可能性があります。これに対処するため、潜伏前30分間、心臓に0.5%のサポニンをDMEM(10 mMガラクトース、1 mMピルビン酸、4 mMグルタミン)で処理する透過化ステップを実施しました。これにより、FCCP注射後のOCRが持続的に低下し、期待されるOCRの増加が見られず(図3C)、心臓が代謝的に機能不全を起こしていることが示唆されました。その結果、実験のために心室を透過化しませんでした。

さらに、ここには元の実験8の正規化された痕跡も示します。7つの野生型ゼブラフィッシュ系統の自然な再生能力の変化を利用し、細胞質マレート脱水素酵素1Ab(mdh1ab)が心筋細胞の再分化による再生に有益な効果を持つことを特定しました。この発見を検証するため、心筋細胞特異的にmdh1abを過剰発現させるトランスジェニックゼブラフィッシュ(mdh1ab cOE)と、対照魚で緑色蛍光タンパク質過剰発現(GFP cOE)を作製しました。私たちは彼らの心室をクライオ損傷し、14 dpciで採取し、ミトストレステスト(図3D)で代謝を調べました。オリゴマイシン治療はOCRに有意な変化を与えませんでしたが、ECARは軽度に増加しました。培地へのFCCP注入により、期待されるOCRおよびECARの増加が見られ、mdh1ab cOEサンプルは最大呼吸能力を維持しました(図3D)。最後に、ロテノン/抗マイシンは両群の代謝を完全に停止させました。全体として、この方法はmdh1ab過剰発現心室および7つの異なる野生型ゼブラフィッシュ株間の代謝能力に有意な違いを特定することができました8。

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図1:ミトストレステスト中のグルコース代謝。(A) グルコース代謝の図式的表現。グルコースはGLUTトランスポーターを通じて細胞に入り、解糖によってピルビン酸に変換されます。乳酸脱水素酵素(LDH)はピルビン酸を乳酸に変換し、その結果得られたプロトンが細胞から分泌されます。ピルビン酸はアセチルCoAに変換され、ミトコンドリアおよびTCAサイクルに入り、内ミトコンドリア膜の呼吸電子伝達系を活性化させます。複合体I、III、Vの阻害因子およびアンカップラーFCCPは赤色で示されています。呼吸電子伝達系を通じて電子が移動するときは青い矢印で示され、最終的に酸素や陽子が水に変換されます。(B) ミトストレステストの結果図。基礎呼吸はマゼンタ色で観察されます。オリゴマイシン注射後、OCRは低下し、ATP連鎖呼吸(緑)とプロトン漏れ(オレンジ)を計算できるようになります。FCCPはOCRを細胞の最大呼吸能力(青)まで増加させます。ロテノンと抗マイシンA注射はミトコンドリア呼吸を停止させ、非ミトコンドリア呼吸のみを可能にします(グレー)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:センサーカートリッジとアイレットキャプチャーマイクロプレートのレイアウト。(A) 蓋センサーカートリッジ-ハイドロブースター-ユーティリティプレート複合体(上)および逆さセンサーカートリッジ(下)の画像。スケールバー:1cm。(B) ゼブラフィッシュ脳室を豊富に含んだアイレットキャプチャマイクロプレートの画像。赤い丸は心室を含まないブランクウェルを示し、解析中の背景補正として機能します。スケールバー:1cm。(C) XFe24センサーカートリッジのポートレイアウトの回路図。ポートAにはオリゴマイシン、BにはFCCP、Cにはロテノン/アンチマイシンの混合物が含まれています。ポートDは空にしておくこともあれば、追加の薬剤を加えることも可能です。Sはセンサーポートを示し、アナライザーを損傷しないよう液体を含まないようにします。(D) 井戸底部のゼブラフィッシュ脳室の代表画像で、グリッド(左)に囲まれ、グリッドなし(右)。スケールバー:5mm(E) 心室、グリッド(黄色)、センサーカートリッジ(緑)を含むアイレットキャプチャマイクロプレートの断面図。Pはポート、Sはセンサーを表します。波状の線はメディアを表しています。(F) アイレットキャプチャ画面インサートツール。スケールバー:1cm。(G) 解析インターフェースの正規化タブアイコン。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:ゼブラフィッシュ心室の代表的なOCRおよびECAR測定値。(A) アッセイで使用された阻害剤で処理されていない野生型ゼブラフィッシュ心室(KCL株)の代表的なOCRおよびECAR痕跡(n = 2、赤線)。生物材料を含まない空井戸から得られる痕跡はグレー(n = 4)で示されています。OCR、二方向反復測定のANOVAで、時間因子P = 0.0200、時間×井戸相互作用P = 0.0196、井戸因子P < 0.0001、群因子P <0.0001;ECAR二方向反復測定のANOVAでは、時間因子P = 0.1323、時間×井戸相互作用P = 0.0216、井戸因子P = 0.0009、群因子P<0.0001;データはSEM±平均として提示されます。(B) OCRフォールドは、異なる薬剤濃度や使用培地によって変化します。Tukeyの多重比較検定を用いた一元ANOVA(P = 0.0032)。[O] 5 μM、[F] 4 μM、[RA] 2 μM、n = 6;[O] 10 μM、[F] 8 μM、[RA] 25 μM、n = 8;[O] 25 μM、[F] 16 μM、[RA] 45 μM、n = 8;[O] 50 μM、[F] 30 μM、[RA] 45 μM、n = 8;[O] 100 μM、[F] 60 μM、[RA] 90 μM、n = 8。O、オリゴマイシン;F、FCCP;RA、ロテノン/アンチマイシン。(C) サポニン透過性脳室(赤、n = 4)と未治療の心室(灰色、n = 4)の痕跡;双方向反復測定のANOVA、時間因子P<0.0001、時間×サンプル相互作用P<0.0001、処理因子P<0.0001、標本因子P=0.824;データはSEM±平均として提示されました。サポニン処理された心室と未治療の心室のOCR最大値;ペアなし学生のT検定(P = 0.0850)。(D) mdh1ab cOE(赤色、n = 8)およびGFP cOE(灰色、n = 8)14dpci 心室からの代表的なOCRおよびECARトレース。OCR、二方向反復測定のANOVA、時間因子P<0.0001、時間×サンプル相互作用P<0.0001、遺伝子型因子P<0.0001、標本因子P=0.1098;ECARは、ANOVA時間因子P<0.0001、時間×サンプル相互作用P=0.7507、標本因子P=0.2154、遺伝子型因子P<0.0001。データはLekkosら, 2025年8号から改変され、SEMの平均±として示されています。この図の拡大版を見るにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、Seahorse XFe24アナライザーとミトストレステストを用いて、体外ゼブラフィッシュの脳室のOCRおよびECARを解析するプロトコルを詳しく説明します。心筋細胞代謝は心臓再生に重要な役割を果たします 21,22,23,24。しかし、再生中のゼブラフィッシュ心臓の代謝表現型の検証は困難であり、論文6,7からはしばしば不足しています。ゼブラフィッシュの心臓は小さいため、NMR分光法や質量分析などの技術は、十分な信号8,12,13を得るために複数の心室をプール化する必要があります。これに対し、ここで説明する方法は複数の個別の心室からOCRおよびECAR測定を取得できるため、統計的検出力を高めます。

メタボロミクスなどの古典的な代謝プロファイリング手法は、採取時点の組織の代謝プロファイルのスナップショットを提供します。ミトストレステストを通じて、心室がさまざまな代謝課題にどのように適応しているか、特に最大呼吸能力など、他の方法では明らかになりにくいリアルタイムのリアルタイムデータを収集できました。ゼブラフィッシュ脳室の生表現型化を実現するために、9,10,11の心臓灌流が試みられています。これは、低スループットの方法でカニュレーションを実現するために、複雑でカスタマイズされた機器と高度な技術者を必要とします。アナライザーは市販の機器を用いて、高スループット(一度に20個の心室)の表現型解析を行うより簡単な代替手段を提供します。私たちの知る限り、本論文で述べた手法をクラーク型電極など他のライブオキシメトリー技術と直接比較した例はありません。

重要なのは、私たちが説明する手法が研究課題に応じて適応可能である点です。このアッセイは以前に全ゼブラフィッシュ胚の特性評価に用いられてきました25,26。ここで述べるミトストレステストに加え、ミト燃料フレックステストはヒト心臓スライスの代謝燃料利用を評価するために最適化されています。さらに、細胞エネルギー表現型検査は再生中のAstyanax mexicanus心臓の糖分解能力を特徴づけるために応用されています。このプロトコルは心臓オルガノイドなど他の3D構造にも利用され、損傷のないゼブラフィッシュ心臓における代謝経路の遺伝的乱れの検証にも有用になると予想しています。

この技術には一定の限界があることを認識しています。技術的な課題としては、分離時に心臓を室温のDMEM培地で扱い、ゼブラフィッシュ19の最適温度である28°Cに維持していませんでした。水温を18°Cまで下げると、シチュでゼブラフィッシュの心臓の機能に大きな影響を与えることがあります。しかし、室温への短期曝露が孤立した心室の生理学に大きな影響を与えるとは予想していません。なぜなら、心室は急速に28°Cの分析装置に戻るからです。私たちの手では、心房の解離時に心室の大部分が目に見えて停止し、ペースメーカー刺激がなかったことが収縮しなかった原因を示しました。さらに、隔離期間中は培地に酸素が供給されておらず、軽度の低酸素状態を引き起こす可能性があり、最初の測定前に分析装置で混合すると正常な酸素レベルに回復します。

心臓の温度に関するもう一つの実用的な考慮点として、分析装置でヒーターが停止されることで温度が37°Cから28〜29°Cに低下することもあります。 分析装置は加熱器の出力を望ましい温度まで下げることを許可しません。それでも、分析装置が稼働している間、トレイ内の温度は室温より6〜7°C高くなっています。この温度範囲はゼブラフィッシュの最適な飼育温度19と一致します。

このアッセイはバルクのゼブラフィッシュ脳室で行われます。したがって、OCRやECARで観察される変化に対する個々の細胞タイプの寄与を区別することは不可能です。これは、免疫細胞の 大量流入が心筋細胞のOCR変化を覆い隠す可能性のある初期再生時点の代謝率を調べる上で重要な意味を持つ可能性があります。さらに、心室腔内に残った残留血液は代謝指標に影響を与える可能性があります。ヘパリン7 の存在下で心臓出血を許すことで、心臓内の血球凝固の影響をさらに軽減する可能性があります。さらに、心室内側細胞に向かう阻害剤の拡散を促進するために、サポニンを用いた透過化ステップを試みました。サポニン透過により、アッセイ全体でOCRが持続的に低下し、心室が呼吸不全に陥りました。これらの制限は、単離心筋細胞の分離、培養、解析によって回避可能ですが、この方法は細胞32 の長時間培養を必要とし、再生環境には最適とは限りません。

損傷した組織は、使用される正規化方法に影響を与える可能性があります。本研究では、BCAアッセイを用いてμgタンパク質/mL単位でOCRを正規化します。BCAアッセイはコラーゲンタンパク質のヒドロキシプロリンおよびプロリンが豊富な組成のため強く反応しませんが、他の細胞なし創傷成分の存在が正規化に影響を与える可能性があります。将来の研究では、脳室内の生細胞を正確に反映するために総DNA33 を使用することが検討される可能性があります。

さらに、オリゴマイシン依存性V15複合体の阻害によるOCRの減少が予想されていたものを再現できませんでした。一部の研究では、オリゴマイシン処理による単離心筋細胞のOCR低下が示されていますが、ここでのデータは、最近の孤立成マウス心筋細胞に関する研究で報告された反応の欠如と似ています。使用しているオリゴマイシン濃度は前述の研究で報告されたものよりも有意に高いため、最終濃度を50μM以上に上げても効果があるかどうかは不明です。

最後に、酸素消費は主に呼吸に依存しますが、細胞外酸性化は解糖によって生成される乳酸だけでなく、二酸化炭素から炭酸への変換によっても駆動されます。グルコース栄養の筋芽細胞では、細胞外酸性化の3分の1がベースライン条件の二酸化炭素によるものであると報告されています。したがって、シーホース分析器によるECAR測定値の解釈には注意が必要です。呼吸による酸性化の割合の補正が行われていない場合は38。

開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

この手法の開発において、Nick Howe(Agilent Technologies)とThomas Nicol(オックスフォード大学)の支援と批判的な議論に感謝しています。オックスフォード大学生物医学サービスユニットのレベル1動物施設およびオックスフォード大学の発生再生医学研究所のスタッフの皆様に感謝の意を表します。ゼブラフィッシュの管理と移送にあたります。この研究は、医療研究評議会(MR/W006731/1からKLへ)、キング・ファイサル専門病院・研究センター(RAへのポスドクフェローシップ)、ウェルカム機関戦略支援基金(204826/Z/16/ZからJSOMへ)、英国心臓財団IBSRF(FS//58/33072からLCH)、欧州研究評議会(ERC)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラム(715895)の支援を受けています。 CAVEHEART、ERC-2016-STGからMTMMへ)、英国心臓財団プロジェクト助成金(PG/15/111/31939およびPG/23/11189からMTMMへ)を得ており、MTMMはオックスフォード大学BHFオックスフォード研究卓越センター(RE/24/130024)およびBHF再生医学センター(RM/13/3/30159)からの支援を認めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5mlエッペンドルフチューブ スターラブS1615-5550
96井戸プレート サーモフィッシャーAB-0800
アンチマイシンAケムクルーズ sc-202467A
DMEM媒体アジレント1035755-100
DMSOシグマ・オルドリッチ D2650-100mL
ドライアイス 
エタノールスペルコ1.00983.2500
細胞外フラックスアッセイキット アジレント103518-100パックにはユーティリティプレート、ハイドロブースター、センサーカートリッジ、蓋(アイレットプレートに付属)が含まれています。
FCCPシグマ・オルドリッチ C2920
グルコースアジレント103577-100
グルタミンアジレント103579-100
インキュベーター
アイレット捕獲マイクロプレートアジレント101122-100パックには25グリッドが含まれています
Isletキャプチャ画面インスターツールアジレント101135-100
顕微解剖鉗子Ideal-Tek31317605-Sサイズ(心室と動脈球および心房を隔離するために2倍必要)
マイクロディスセプションはさみFST15009-08
MS-222シグマ・オルドリッチ E10521
オリゴマイシンMP 151786
ペストルモトールホモジェナイザー VWR431-0100
乳棒VWR431-0094
ペトリ皿 35mmグライナー・バイオ・ワン627102
ペトリ皿 92mmスターシュテット82.1473
ピアースBCAアッセイキットサーモ・サイエンティフィック23227
ピアースプロテアーゼおよびリン酸過激剤阻害剤ミニタブレット、EDTAフリーサーモ・サイエンティフィックA32961
ピルビン酸アジレント103578-100
RIPA溶解バッファーサンタ・クルスSC-364162
ロテノンMP 02150154-CF
シーホース・アナリティクス アジレント・インターフェーズアジレントhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
シーホースXFe24アナライザーアジレントhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
シーラーサーモ・サイエンティフィックAB-0558
スペクトロスター・ナノMG LABTECH GmbH601-0298
スポンジ魚の腹側が上に収まるくらい長く深い切開をします
Wave(バージョン 2.6.1.56)アジレントhttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XFキャリブラント アジレント100840-000

参考文献

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