研究記事

イコニタムペンデュラムのバイオアクティブ成分が、PI3K/Akt経路調節を通じてラットの関節リウマチ関連炎症を弱める

DOI：

10.3791/70473

⸱

2026年4月21日

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1School of Pharmacy, Qinghai MinZu University, 2Qinghai Modern Plateau Biomedical Industry Institute, 3Qinghai Institute of Tibetan Medicine, 4Qinghai Provincial Key Laboratory of Plant Resource Chemistry on the Tibetan Plateau

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ネットワーク薬理学と分子ドッキングを用いて、 A. pendulum から抗リウマチ性関節炎(RA)成分が同定されました。 in vivo 研究では、ジテルペンアルカロイド、特にスミルノチンAがPI3K/Akt経路を通じてラットのRA症状を緩和することが示されました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

伝統中国医学や様々な民族医療において、 ウサ ギリの根は経絡の浚渫、リウマチの軽減、血行促進、関節痛の緩和に用いられています。その結果、この薬用植物は異なる民族医療システムで捻挫やリウマチ疾患の治療として高く評価されています。本研究は、以前に分離された6つのA . pendulum 化合物がin vitro および in vivo の両方のアプローチを用いてリウマチ性関節炎(RA)関連炎症を改善させるメカニズムを調査しました。ネットワーク薬理学、分子ドッキング、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(q-PCR)、ウェスタンブロット(WB)などの技術を組み合わせて用いられました。結果は、6つの化合物の一つであるスミルノチンAがPI3K/Aktシグナル伝達経路を標的とし炎症反応を抑制することでRA症状を緩和することが示されました。これらの発見は、伝統的なA . pendulum を用いたRA治療の基盤とメカニズムを理解するための科学的基盤を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

関節リウマチ(RA)は、滑膜炎症、滑膜の過形成、免疫細胞の浸潤、浸潤性パンヌス組織の形成、そしてそれに伴う関節破壊を特徴とする慢性自己免疫疾患です。世界的な有病率は0.5%から1%であり、RAは公衆衛生に大きな負担をもたらし、患者の生活の質に深刻な影響を与えます。従来の治療法(メトトレキサート(MTX)、グルココルチコイド、ジャヌスキナーゼ(JAK)阻害薬、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)などは、副作用や患者反応の変動により制限されることが多く、新規治療の必要性を強調しています。

天然産物、特にアルカロイドは、多標的メカニズムとRA管理における良好な安全性プロファイルで注目を集めています。ベルベリン、シノメニン、マトリンなどのアルカロイドは、ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)、核因子カッパB(NF-κB)、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ/タンパク質キナーゼB(PI3K/Akt)、ヤヌスキナーゼ/シグナル伝達物質・転写活性化因子(JAK/STAT)などの主要な炎症経路を調節し、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン(IL)-1β、IL-6などのサイトカインをダウンレギュレーションし、治療的可能性を示します。10。

チベット医学では、RAはブラムブ(湿潤性関節痛)と分類され、三体液のバランスの乱れと関節に未熟な黄色い水が蓄積することに起因します(図1)。 Aconitum pendulum N. Buschは、湿気を排出し、血行を促進し、痛みを和らげるために伝統的に用いられるハーブです13,14。このハーブを含む50以上の古典チベット製剤が記録されており、臨床使用の歴史は300年以上にわたり15,16。しかし、その生物活性成分やメカニズムは依然として十分に解明されていません。

ここではネットワーク薬理学と分子ドッキングを組み合わせ、 Aconitum pendulum N. Buschの抗RA成分およびその潜在的な標的および経路を予測します。これらの予測はその後、実験的に検証されます(図2参照)。この統合的アプローチは、RA治療における Aconitum pendulum N. Buschの物質的基盤と機構的基盤を明らかにし、将来の医薬品開発の基盤を提供することを目指しています。

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プロトコル

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湖北省疾病予防管理センター(湖北省予防医学院)(中国武漢)から提供された50匹の特異的無病原体(SPF)オスのスプラグ・ドーリーラット(体重180〜200g)が提供されました。動物免許証明書番号SCXK(JB) 2023-0005)。動物を対象としたすべての実験手順は、米国国立衛生研究所(NIH)の実験動物ケア・利用ガイド(第8版、2011年)に厳密に従って実施されました。この研究プロトコルは天津根寧生物技術有限公司の実験動物倫理委員会によって審査・承認されました(承認番号:GENINK-20250074)。本研究で使用される主要な試薬および装置は付随する 材料表に記載されています。

細胞培養
ヒトリウマチ性関節炎(RA)細胞株MH7Aは、10%(v/v)胎児用牛血清(FBS)を補足したDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培地で培養し、5% CO₂17を含む加湿インキュベーターで37°Cで維持しました。

動物と治療法
動物は標準的な特定病原体フリー(SPF)施設で個別換気ケージ(IVC)システムを備えた厳格に管理された環境条件で飼育されました。温度は21.0〜25.0°C、相対湿度は40〜70%、12時間の光周期、完全な空気更新は1時間に15回行われていました。7日間の順応期間の後、ラットは無作為に6つの実験グループに分けられ、予期せぬ事態に備えて追加のラットが予備として確保されました。急性炎症性補助薬(AA)モデルは、右後足18に100μLの完全フロイント助剤(CFA;10 mg·mL-1)を皮下注射することで誘導されました。実験群は以下の通りに設計されました:ブランク対照群、AAモデル群、陽性対照群(メトトレキサート、0.9 mg·kg-1)19、およびIC₅₀値に基づく低(0.962 mg·kg-1)、中(1.923 mg·kg-1)、高用量(3.846 mg·kg-1)レベルの3つのスミルノチンA治療群。

病害および化合物標的の予測
当研究グループによる予備的活性スクリーニングに基づき、好ましい生物活性を示す6つの化合物が調査対象として選ばれました:5つのジテルペノイドアルカロイド(図3)、ベンゾイラコニン(1)、14-ベンゾイル-8-O-メチルコニン(2)、(−)-(A-b)-14α-ベンゾイルオキシ-N-エチル-13β、15α-ジヒドロキシ-1α、6α、8β、16β、18-ペンタメトキシアコニタン(3)、スミルノチンA(4)、アコニチン(5)、およびクマリン誘導体であるスコポレチン(6)20.これらの化合物の簡略分子入力行入力システム(SMILES)表記は、PubChemデータベース(https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/)から取得するか、ChemDraw 18.0で生成されました。これらの表記はその後、SwissTargetPredictionデータベース(https://swisstargetprediction.ch/)にインポートされ、種は「Homo sapiens」として指定されました。潜在的な標的は確率値>0の遺伝子を選択して特定し、対応する標的名およびUniProt IDを収集しました。

PPIネットワーク
重なり合う標的遺伝子は、STRINGデータベース(https://string-db.org/)23を用いてタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークによって解析されました。得られたTSV形式のデータは、さらなる可視化と解析のためにCytoscape 3.9.1にインポートされました。ネットワークのトポロジーパラメータは、内蔵の Network Analyzer プラグインを使って計算されました。可視化されたネットワークでは、ノードのサイズと色の強度が次数値にマッピングされ、エッジの太さはターゲット間の相互作用の強さを反映していました。コアターゲットが特定され、その関連度24に基づいて順位付けされました。

遺伝子オントロジー(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)経路強化解析
共通ターゲットは、GoおよびKEGG経路濃縮解析のためにMetascapeデータベース(https://metascape.org)に提出されました。機能的結果はWeiShengXinバイオインフォマティクスプラットフォーム(https://www.bioinformatics.com.cn)を用いて可視化されました。

「薬物有効成分-疾患標的-経路」のネットワーク構築
能動成分および対応する標的を体系的にスクリーニングし、その後機能豊化解析を行って主要なシグナル伝達経路および関連標的を特定しました。これらの要素はCytoscape 3.9.1を用いて統合され、「薬物–有効成分–疾患–標的–経路」ネットワークを構築しました。その後、ネットワークアナライザーツールを用いてトポロジー解析を行い、次数や中間性などの主要パラメータに基づいてノードをランク付けし、ネットワーク内の中心要素を特定しました。

主要化合物のコアターゲットへの分子ドッキング
ESR1(9BQE)、PTGS2(5F19)、EGFR(2XKN)、GSK3B(5HLN)、SRC(5MTJ)、ERBB2(8U8X)を含むコアターゲットタンパク質の三次元構造は、RCSBタンパク質データベース(http://www.rcsb.org/ 年、2025年5月7日アクセス)から取得されました。化合物構造はChemDraw(バージョン18.0)で構築され、その後統合されたChem3Dモジュールを用いて三次元SDF形式に変換されました。分子ドッキング結果はPyMOLで可視化され、結合親和性は相互作用エネルギー(kcal·mol-1)に基づいて評価されました。

細胞生存率アッセイ
対数成長段階のMH7A細胞は、1ウェルあたり5個×10個3 セルの密度で96ウェルのプレートにシードされました。80%の合流に達すると、まず細胞はリポ多糖(LPS)(1 μg·mL-1)で6時間処理され、その後スミルノチンAの異なる濃度(5、25、50、75、100 μg·mL-1)にさらされました。各処理群は4段階で設置され、37°Cで5% CO₂の下で24時間インキュベートされました。インキュベーション後、各ウェルに100μLの10% CCK8溶液を加え、その後37°Cで2時間の追加インキュベーションを行いました。450 nmでの吸収はマイクロプレートリーダーを用いて測定されました。

MH7A細胞におけるELISAアッセイ
上清液は2000 × g 、4°Cで20分間遠心分離で採取されました。 IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10などの炎症性サイトカインのレベルは、製造元の指示に従い対応するELISAキットを用いて上清液中に定量化されました。

足趾の腫れ度測定
右後足の腫れ程度は、モデリング後3日ごとに足の容積を測定することで評価されました。ラットごとに2回測定し、平均化しました。炎症反応は、ベースラインに対する足の容積の増加率として定量化されました。

figure-protocol-1

オルガン指数測定
すべてのラットは最終投与から24時間後に麻酔され、安楽死されました。国際獣医コミュニティに認められた人道的な方法が採用されています。まず、高濃度(5%)のイソフルランを用いて動物を深く麻酔します。意識と反射をすべて失うと胸を開け、心臓を切ることで、動物は痛みもなく感覚なく死にます。脾臓と胸腺はすぐに切除され、体重測定されました。生理食塩水で洗浄した後、組織表面の余分な水分をフィルターペーパーで吸い取り、臓器の湿った重量を27.28を記録しました。

figure-protocol-2

ヘマトキシリンとエオシン(HE)
肉球組織サンプルの完全性を保つため、各ラットの右足首関節の遠位部全体を収集・保存しました。切片には腫れた足の組織が使用されました。採取手順は以下の通りです:右足首関節の約1cm上にある組織を完全に剥離し、毛を除去し、骨幹を近位端で切断しました。試料は直ちに10%パラホルムアルデヒド溶液に固定されました。固定後、組織は15%EDTA脱脱灰化溶液に浸されました。脱石灰は3日ごとにモニタリングされ、必要に応じて溶液を補充して組織が柔らかくなり脱石化完了を示すまで続けました。その後、組織は段階的なエタノール系列(4時間75%、2時間85%、1.5時間90%、1時間95%、0.5時間100%エタノール2回交換)で脱水されました。切片は脱硫、エタノールによる再水和、ヘマトキシリンで10分間染色、水道水で洗浄、塩酸・エタノールで10秒分化、水道水で洗浄、青みを合わせて再度すすぎ、85%エタノールに5分間浸し、エオシンで5分間補色、水道水で3秒間すすぎ、脱水、クリアし、観察のためにマウントしました。

ラット血清のELISAアッセイ
血液サンプルは2000 × g で4°Cで20分間遠心分離し、得られた上澄液をサイトカイン分析のために採取しました。IL-1β、IL-6、TNF-αの濃度は、製造元のプロトコルに厳密に従い、市販のELISAキットを用いて測定されました。cvxpt32ソフトウェアを用いて標準曲線を作成し、各サイトカインの発現レベルを吸収度の補間で対応する標準曲線方程式に算出しました。最終的なタンパク質濃度は実際の実験測定から計算されました。

定量ポリメラーゼ連鎖反応解析(qPCR)
TRIzol試薬を用いて滑膜細胞から全RNAを分離し、クロロホルム添加30によって相分離が達成されました。その後、市販の逆転写キットが用いられ、製造元の指示に従い、分離されたRNAからcDNAを合成しました。qRT-PCRはSYBRプレミックス試薬を用いて実施されました。グリセラルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)を内因性参照遺伝子として使用し、相対的な遺伝子発現レベルは2-ΔΔCt 法を用いて算出しました。以下のプライマー配列が使用されました:GAPDH前方:ACAGCAACAGGGTGGTGGAC、およびGAPDH逆方向:TTTGAGGGTGCAGCGAACTT;IL-17A前方:CTGATGCTGTGTGTGTGTACTGA、IL-17Aリバース:TGGAACGGTTGAGGTAGTCTga;TRAF6前方:ACATTTCCCTCTTTGTCCACAC、およびTRAF6リバース:TTAGCATCCATGACCTCTCTTCGT;IL-10 前方:CTGCAGGACTTTAAGGGTTACTT、および IL-10 後方:CTTGCTTTTTTATTCTCACAGGGGA;IL-1β 順方向:CCTGTGTGATGAAGACGGC、逆方向 IL-1β 方向:TATGTCCCGACCATTGCTGT;IL-6 前進:GTTGCCTTTTGGGAGGACTGATG、IL-6 リバース:TACTGGTCTGTGTGTGTGTGGGGGT。

タンパク質抽出とウェスタンブロッティング
滑膜組織はホスファターゼ/プロテアーゼ阻害剤補充放射免疫沈殿法(RIPA)バッファーで溶解され、タンパク質濃度はビシンコニン酸(BCA)アッセイキットで測定されました。ウェスタンブロッティングでは、同量のタンパク質を含む溶解液をナトリウムドデデシル硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に照射し、その後ポリビニリデンフッ化物(PVDF)膜に移しました。Trisバッファーリング生理食塩水0.1%トゥイーン(TBST)で5%脱脂乳を25°Cで2時間ブロッキングした後、膜は4°Cで一次抗体とともに一晩培養されました(GAPDH 1:50000;P-PI3K 1:1000;PI3K 1:1000;P-AKT 1:3000;AKT 1:6000)。TBSTによる徹底的な洗浄後、膜はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体(Anti-Mouse IgG 1:10000;抗ウサギIgG 1:1000)を室温で2時間投与しました。さらに一連のTBST洗浄の後、強化化学発光(ECL)基質を用いてタンパク質バンドを可視化しました。バンド強度はImageJソフトウェアで定量化され、負荷制御としてGAPDHに正規化されました。

統計解析
すべてのデータはGraphpad Prism 9.5ソフトウェアで解析され、平均標準偏差±±表示されています。適切な場合、一方向ANOVAを用いて統計比較を行いました。p値が0.05未満であれば統計的に有意とされました。対照群と比較して:*p < 0.05、**p < 0.01、p < 0.001、p < 0.0001;モデル/LPSグループと比較して、#p < 0.05、##p < 0.01、###p < 0.001、####p < 0.0001。

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結果

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A. pendulum 誘導体が抗RA標的に与える影響
6つの化合物の3D構造はSDF形式で取得され、SMILES数値はターゲット予測のためにSwissTargetPredictionデータベースにアップロードされました。確率が0を超えるターゲットは保持され、結果はCSVファイルとしてエクスポートされました。重複を除去した後、合計97の化合物関連標的が特定されました。

リウマチ性関節炎(RA)に関連する疾患標的はGeneCards、OMIM、TTDデータベースから収集され、それぞれ3520、5、3の標的が得られました。重複を統合・削除した後、RA関連の目標が3,257点獲得されました。化合物標的と病原標的の交差点をベン図を用いて可視化し、79の重なり合う標的が明らかになりました(図4A)。

これらの共通標的はSTRINGデータベースにインポート...

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ディスカッション

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本統合研究は、 Aconitum pendulum N. Busch産のC19-ジテルペノイドアルカロイドであるスミルノチンAの抗リウマチ関節炎活性に関する新たな機構的知見を提供します。本研究結果は、スミルノチンAがPI3K/Aktシグナル伝達経路の標的的阻害を通じてRA炎症を緩和し、これまでに報告されたジテルペノイドアルカロイドとは異なるメカニズムを示していることを示しました。

ネットワーク薬理学的予測と分子ドッキング検証の組み合わせにより、EGFRおよびPTGS2が主ターゲットとして同定され、それぞれ-9.5 kcal·mol⁻1という卓越した結合親和性を示しました。ネットワーク薬理学解析によると、スミルノチンAの抗RA効果はEGFRおよびPTGS2の調節を伴い、PI3K/Aktシグナル伝達の抑制につながる可能性があります。これらの予測と過去の報告に基づき、この効果はNrf2経路とは独立して発生すると仮定されています。この提案されたメカニズムはジ...

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開示事項

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著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する財政的利害関係や個人的な関係は既知のものではないと述べています。

謝辞

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この研究は青海科学技術部自然科学基金青少年プロジェクト(番号2022-ZJ-950Q)および中国国家自然科学基金(NSFC)(番号82460845)から資金援助を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AceQ qPCR SYBR グリーンマスターミックスヴァイジームQ111
AKT(60 kDa)モノクローナルマウス抗体武漢三英バイオテクノロジー60203-2-Ig
BCAタンパク質アッセイキット広州解北思バイオテクノロジーG3522
BSA標準広州解北思バイオテクノロジーG8532
MH7A細胞の完全培地上海富衡バイオテクノロジーFH-MH7A
IL-10用のELISAキットランタンシュオ・バイオテクノロジーED-13626
IL-17A用のELISAキットランタンシュオ・バイオテクノロジーED-10344
IL-1&β用ELISAキット;ランタンシュオ・バイオテクノロジーED-10351
IL-6用のELISAキットランタンシュオ・バイオテクノロジーED-10377
TNF-およびα用ELISAキット;ランタンシュオ・バイオテクノロジーED-11776
蛍光定量PCRシステム応用バイオシステムVII-7
GAPDHモノクローナルマウス抗体武漢三英バイオテクノロジー60004-1-Ig
高速冷蔵遠心分離機湖南克誠計器設備HI-16KR
HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCRヴァイジームR223
HRP標識ヤギ抗マウス二次抗体武漢三英バイオテクノロジーSA00001-1
HRP標識ヤギ抗ウサギ二次抗体ビヨタイム・バイオテクノロジーA0208
ヒト関節リウマチ線維芽細胞様滑膜球系MH7AQisai Biotechnology(奇サイ・バイオテクノロジー)QS-H075
マイクロプレートリーダーバイオテックMQX200
顕微鏡ライカフレクサカムC1
マルチモードマイクロプレートリーダー分子デバイスFlexStation 3
P-AKT(60 kDa)多クローナルウサギ抗体武漢三英バイオテクノロジー28731-1-AP
パラフィンミクロトームライカRM 2016
PCRアンプ応用バイオシステムプロフレックス
リン酸塩緩衝塩水(1×PBS)Qisai Biotechnology(奇サイ・バイオテクノロジー)QS-S001
PI3K(85 kDa)ポリクローナルウサギ抗体親和性AF6241
P-PI3K(85 kDa)多クローナルウサギ抗体親和性AF3242
スミルノチンA当研究所によって分離・同定されましたC39H49NO11
ティッシュ・デドレーター武漢君傑電子JT-12J
組織埋め込み装置武漢君傑電子JB-L6
組織拡幅・焼成機武漢君傑電子JK-6
トリゾールアンビオン15596-026
トリプシン細胞消化液(0.25%トリプシン、nbsp;EDTA含有、フェノール赤なし)Qisai Biotechnology(奇サイ・バイオテクノロジー)QS-S401

参考文献

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