溶液NMRを用いた生体分子凝縮の特性評価

サマリー

ここでは、NMR手法、REstricted DIFfusion of INvisible speciE(REDIFINE)、およびSEmi固体磁化移送によるCONdensate DEtectioN(CONDENSE-MT)に関するプロトコルを紹介します。これらは二相条件下での生体分子凝縮物のラベルなしの定量的特性解析を可能にし、分子分配、交換動態、凝縮水の水和、液滴構造を沈降や標識なしで明らかにします。

要約

液体-液体相分離(LLPS)によって生成される生体分子凝縮液は、細胞内環境を組織し、多様な生化学的プロセスを調節します。重要性があるにもかかわらず、コンデンセート組成、交換動学、内部組織の探査は依然として困難であり、特に外部タグなしではなおさらです。核磁気共鳴(NMR)分光法は、これらのメソスケールアセンブリをラベルなしで独自の窓口として提供し、分子運動と環境の異質性の両方を捉えることができます。2つの補完的なNMR手法により、凝縮液の二相状態内での包括的な特徴付けが可能です。NMRで観測可能なほど動的な凝縮液に対しては、拡散交換法(REstricted Diffusion of INvisible speciE、略称REDIFINE)は、化学交換との拡散コントラストを利用して、凝縮相と希薄相に分割された分子の割合を定量し、液滴の大きさや界面透過性を決定し、相境界を越えた分子交換率を抽出します。NMRで見えないより剛性の高い凝縮液に対しては、水検出半固体磁化移転法(CONdensate DEtectioN by SEmi-solidization Magnetization Transfer、略してCONDENSE-MT)が、凝縮した生体分子と希薄相溶媒間の緩和コントラストとプロトン交換を利用して、凝縮水がバルク水陽子に投影される様子を監視し、相対分配、分子タンブル速度、水和力学、結合水含有量へのアクセスを提供します。これらの手法を組み合わせることで、蛍光や検出タグを用いず、ほぼ原生の二相条件下での凝縮液の構造と動態を多次元かつ定量的に示すことができます。これらの統合により、生体分子相分離の研究におけるNMRツールボックスが拡充され、凝縮液の物理化学的性質とその生物学的機能および病理的異常調節を結びつける基盤が確立されます。

概要

細胞は生化学反応を区画化することで、その卓越した空間的・時間的組織化を実現しています。^1,2,3。膜結合された小器官に加え、多くの重要な細胞過程は、タンパク質と核酸の液体・液体相分離(LLPS)によって形成される膜のない区画内で起こ^{っています。}これらの動的集合体はしばしば生体分子凝縮体と呼ばれ、核小体、応力顆粒、核スペックル、処理体などを含み、RNA代謝、転写調節、シグナル伝達などに重要な役割を果たし^ます。環境の手がかりに応じて成分を形成、溶解、交換する能力により、細胞は脂質膜に依存せずに生化学活動を組織する多様なメカニズムを提供します。

生体分子凝縮体の大きなサブセットは、内在的に無秩序な領域(IDR)とRNA結合ドメイン(RBD)を含むRNA結合タンパク質(RBP^)から発生します^7,8。これらのタンパク質は単独で、またはRNAと複合して位相分離し、多様な材料特性や生物学的機能を持つ凝縮体を生じさせます。例えば、SARS-CoV-2のヌクレオカプシドタンパク質(N)はRNA依存性の生体分子凝縮体9を形成し、ウイルスゲノムのパッケージングと組み立て^に関与し、一方でポリピリミジン路結合タンパク質1(PTBP1)は遺伝子サイレンシングに寄与する核凝縮体を形成^します。さらに、FUSやDDX4のようなタンパク質は、その無秩序な領域によって駆動されるLLPSを受け、RNA代謝やストレス顆粒形成に影響を与えます^11,12。これらのプロセスの調節障害は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)や前頭側頭型認知症などの神経変性疾患と関連しており、異常な相転移が凝集や機能喪失を引き起こすことがあります¹³。

縮合はタンパク質やタンパク質–RNA複合体に限定されません。RNA単独でもLLPSが起こり得る。特に複数の神経変性疾患に関連する反復増殖配列の文脈では(^14,15)。ハンチントン病のCAGや筋強直性ジストロフィーのCUGのようなトリヌクレオチドおよびヘキサヌクレオチドの繰り返し拡張は、in vitroおよび細胞内で液滴状凝縮を形成することがあります¹⁴。RNA縮合の物理的基盤と、それがタンパク質およびタンパク質-RNA駆動の凝縮体とどのように異なるかを理解することは、繰り返し増殖疾患の分子メカニズムを解明する上で極めて重要です。

生物学的意義にもかかわらず、生体分子凝縮液の定量的かつラベルなしの特性評価は依然として困難な課題です¹⁶。従来の蛍光顕微鏡および分光法は外部ラベルに依存しており、これが生体分子の構造、動力学、相振る舞いを乱すことがあります(^17,18)。さらに、一部の凝縮液は分子運動が制限され、線形が広いためNMRでは不可視化し、従来のNMR手法でアクセス可能な情報が制限されます。したがって、凝縮液を二相的かつネイティブに似た状態で直接、ラベル付けせずに探査できる実験的戦略が緊急に求められています。液滴相境界が交換過程や凝縮液成熟において重要な役割を果たすことから、同じくらい重要なのは、一定のサンプル体積内で生体分子液滴を安定化させることであり、これにより高密度相の沈降を防ぐことです。これは細胞骨格を模倣するアガロース水素ゲルを用いて容易に実現できます。

最近のNMRベースの手法の開発がそのような解決策を提供しています。REDIFINE(REstricted Diffusion of INvisible speciE)アプローチ¹⁹ は、拡散NMRと化学交換解析を組み合わせ、タンパク質およびタンパク質-RNA凝縮体における分子分配、交換速度論、液滴サイズを定量化します。補完的に、CONDENSE-MT(SEmi固体磁化移送による凝縮物分解)技術²⁰ は、水磁化移転を通じてNMRで見えない凝縮液を検出し、特定の条件下での凝縮物質の量を定量化し、凝縮液内の水和動態や分子転移速度をさらに明らかにします。これらの手法を組み合わせることで、平衡二相条件下で、タンパク質単独、タンパク質-RNA、RNA単独縮合体など多様な凝縮体タイプをラベルフリーで非侵襲的に調査することが可能になります。NMRのツールボックスを拡張することで、凝縮液の構造、動力学、そしてそれらが生物学的機能や疾患とどのように関連しているかを体系的かつ定量的に探求する扉を開きます。

プロトコル

1. サンプルの調製

1. バッファーの選択:生体分子が最も安定している試験済みバッファーを使用。
   注意:NMR信号は通常、低いpHでより強くなります。技術的要件として、すべてのNMRサンプル(最終v/v)に5% D₂Oをフィールドロックとして加えます。
2. 細胞骨格を模倣するアガロースハイドロゲルを培地として二相サンプルを安定化させます。同じバッファーで1.5%(w/v)アガロースストックを作るためにアガロース粉末を計量します。通常のアガロースを、内在的に無秩序なタンパク質(IDP)や高温に耐えられるRNAによって形成される生体分子凝縮液のより安価な代替として使用してください。折りたたみドメインを含むタンパク質を含む繊細な凝縮液の製備には低融点アガロースを使用しましょう¹⁹。
3. アガロースストックの準備:懸濁液を約80°Cまで10分間加熱し、混合またはボルテックスで完全に溶かします。
   注意:溶融アガロースは熱く燃えやすいです。耐熱手袋で扱う。
   注意:溶融アガロースは水浴で温かく保温(例:通常のアガロースは55°C、低融点アガロースは37°C)で液体のままにしてから生物サンプルと混合してください。
   溶融アガロースは^{数十分間温}かく保つ^{ことができます。}
4. 最終的な二相サンプルの準備:
   1. アガロースハイドロゲルで安定化した二相性サンプルを準備するには、タンパク質(および/またはRNA)ストックとそれぞれの温かいアガロースバッファーを1.5mlのマイクロ遠心分離機管内で混合します。
      注:最終的なタンパク質/RNA濃度は通常50〜500μMで、NMR検出に適しています。
   2. すぐに長いガラスピペットを使って3mmのNMRチューブに混合液を移します。移植後すぐにアガロースが固まるのを待ちましょう。
      注:アガロースを使わないと、二相性試料は時間とともに沈殿し、実験の時間スケールで試料が物理的に変化するため、NMRデータの取得と解析が複雑になります。
5. 目視検査を行う:試料を目で点検してください。相分離が起こると、試料は即座に濁った状態になり、そのままです。これは二相性サンプルがアガロースで安定化したことを示しています。
6. CONDENSE-MTを実施する場合は、生体分子の添加を省略して同じ手順で追加のアガロース参照サンプルを準備します。代わりにバッファを追加すれば、同じサンプル量が得られます。このサンプルは、凝縮液サンプルを準備し、すべてのデータを測定してから、アガロース基準サンプルが長時間培養されないことを確認する前に準備してください。

2. REDIFINE実験の記録

1. 1H ^{チャンネル}をロック、シム、マッチ、チューニングをいつも通り行います。一般的な手順で ^1Hの90°パルス長を校正してください。
2. 1次元水抑制スペクトルを記録します。理想的には強い生体分子シグナルが観測されます(補足図1A)。
   1. 信号がほとんどまたは全く見られない場合は、凝縮タンパク質/RNAはNMRで観測可能ではなく、凝縮相への分配が大きいと仮定します。この場合、REDIFINEは観察可能な生体分子シグナルに依存しているため、進行しないでください。
   2. この状況では、原則としてCONDENSE-MT実験は非常にうまく機能するはずなので、すぐにステップ4(CONDENSE-MT実験の記録)に進みましょう。
3. 従来の拡散順序分光法(DOSY)実験を読み込みます。これは、バイポーラ勾配を用いた従来の2次元刺激エコー手法(Brukerパルスシーケンス:stebpgp1s19)を使用します。詳細はBrukerのDOSYおよびDiffusionユーザーマニュアルを参照してください。
4. P0、P1、P27を校正された90°パルス長に設定します。経験則として、ノースは32スキャン、DSは16スキャン、TD1は16スキャン、TD2とSW2は調整して取得時間AQを80〜100msにします。d1を1.5秒に設定してください。
   注意:グラデーションは適切にキャリブレーションされているべきです。
5. 通常通り、磁場に応じてウォーターゲートd19遅延を最適化し、芳香族(約7 ppm)または脂肪族(約1 ppm)で最大の励起を得られます。d20を75msに設定してください。p30の選択はタンパク質やRNAのサイズによって異なります。タンパク質>20 kDaの場合は5 msを使い、より小さいタンパク質の場合は、経験則として3.5ミリ秒を使いましょう。
6. DOSY実験を「xau dosy 2 95 16 l y y」というコマンドで記録し、拡散勾配強度を16段階で線形に配列します。
   1. 理想的には、希薄位相から生じる信号の初期減衰を観察し、凝縮位相信号の減衰は停滞するべきです(図1A および 補足図1B)。
7. REDIFINEセット全体のデータを引き続き取得するには、先ほど実行した最初のパラメータをコピーして、新しいstebpgp1s19を9個作成してください。連続する実験では、d20拡散遅延を可変ステップで変化させ、100〜1000msの範囲(例:100、150、200、250、300、400、500、700、1,000ms)に広がります。
8. これらの実験はすべて「xau dosy 2 95 16 l y n」というコマンドで実行します。最後の「n」は受信機の利得が10実験を通じて保持されることを保証します。

3. REDIFINEデータセットの処理と結果の可視化

1. すべての実験(合計10件)を以下の方法で処理します。
   1. SSB 2のqsineをウィンドウ関数として設定し、qsinを使って5^番目の スライスを抽出します。fp、1次元をフェーズし、位相パラメータを2次元データセットに保存します。
   2. 次にxf2で2Dを処理し、ベースライン補正abs2を行い、split2Dでこれら16のスライスを抽出します(ポップアップウィンドウのさらなる入力:r – 16 – 11)。これにより、異なる勾配強度で取得した16のスペクトルを抽出し、同じデータセット内で11から26の1次元処理実験として保存できます。
   3. 残りの9つの実験でも同じことを繰り返します。時には、位相調整や基準補正が正しいかを確認するために、少なくとも最初の4〜5枚のスライスを確認することが非常に重要です。必要に応じて手動で修正してください。適切な位相と基準値が適切な数値化の前提条件です(図1B)。
2. 分析には提供されたMatlabコード LLPS_REDIFINE_fit を使用してください(補足図2A参照)。コード内で、実験に応じて「Delta」(拡散×d20)、「P.d」(総勾配時間2×p30)、exp(1,:)からexp(10,:)に、あなたが行った実験数の#に基づいて調整してください。次に、プローブの勾配強度(TopSpin実験フォルダの「difflist」ファイルからアクセス可能)に従ってP.gを設定します。
3. データの場所に基づいて「フォルダ」と「パス」を調整してください。コードを40行目まで実行してください。これにより1次元のスライスが得られます。ここから積分領域を選択します。これらは芳香族やアリファチックを含み、アミド類などの異なる分子基を考慮しないように、できるだけ狭い領域を選ぶべきです。
4. 積分境界は、変数「左」と「右」の点に入力します(補足図2A参照)。これは定量分析のためのデータを統合するためです(図1C)。サンプル、実行日、実験の詳細に基づいてマトリックス名を選びます。
5. コードを全部実行してください。「fit0」では、最適化関数が最小化を開始するために使用する開始パラメータを選択できます。デフォルト値から始め、収束が達成されない場合は、2番目のfit0値(凝縮相の集団)を0.1から1にステップで変化させます。
   注意:データセットには複数の局所最小値が存在する場合があり、よりグローバルな最小値に収束し始めるために開始パラメータを大幅に変える必要があります。
6. 満足のいくフィッティングが得られた場合、フィッティング値は図内に記載され(図1D および 補足図2B)、変数「fit」でアクセスできます。さらにこれらのパラメータを統計プロットとしてプロットし、より明確に可視化します。

4. CONDENSE-MT実験の記録

注:実験の目的は、陽子交換²⁰を通じて溶媒水信号上の凝縮水を観測することで間接的に検出することです。CONDENSE-MT実験では、指紋MTプロファイルを取得して解析します(図2A)²⁰。

1. お気に入りの1次元水抑制スペクトラムを録音してください。信号が非常に少ない場合、CONDENSE-MT実験は非常にうまく機能する可能性が高いです。
2. 定量的なCONDENSE-MT分析には、水のR1比率の事前測定が必要です。T1反逆回復によって_R1のレートを算出します。提供されたパルスシーケンス、Brukerパラメータセット、vdリストをそれぞれのフォルダにコピーしてください。パラメータセット「T1_inversion_recovery」を読み込み、NMR分光計のパワーと周波数(「edprosol」に従って)を調整します。
   1. 1Hの90度パルス(p1)をキャリブレーションし、NSを2、DSを0、d1を20秒、SWを10 ppm、TD2を16k、TD1を24(調整済みのVDリストの長さの範囲)に設定します。放射線減衰効果を避けるために、Zに沿った弱い勾配(GPZ0 = 0.1%)を有効にします。
3. CONDENSE-MT実験について、
   1. 提供されたBrukerのパラメータセット、シーケンス、周波数リストをBruker専用フォルダにコピーし、「CONDENSE-MT」というパラメータセットを読み込み、分光計に応じて周波数とパワーを調整します。
   2. P1は校正済みの90°パルス長に、P4は励起パルスとして1μsに設定し、放射減衰を避けます。NSを2、DSを16、d1を4秒、SW2を20 ppm、TD2を8k、TD1を周波数リストの長さ(通常46)に設定します。SPNAM10 Squa100.1000に設定し、その持続時間はp10から5秒にします。
   3. SP10の出力を見つけて100 Hzの照射を得てください(「pulse 100 Hz」コマンドでワットとdBの両方の出力を計算します)。照射パルスのSP10パワーを調整し、「zg」コマンドを使ってこの擬似2D実験を実行します。
      注:実験では、水とのオン共鳴から非常に遠いオフ共鳴(100000Hz)までの照射オフセットを網通する周波数リストを用いて、異なる照射オフセットでの水信号を検出します(図2B)。水積分のプロット(スペクトルの適切な位相配置を確保する; 図2C)照射オフセットに関しては 図2Aに示されるCONDENSE-MTプロファイルが得られます。
4. 7つの新しい実験を作成し、それぞれの実験で照射の出力を170Hzから1000Hzの範囲(すなわち170、250、330、500、650、780、1,000Hz)まで増やします。すべての実験では、前のポイントのコマンドを使いましょう。飽和度ごとに、オフセットリスト全体が取得されます(図2D)。
   注:コンデンスMTフィッティングには、アガロースのみのサンプル(生体分子凝縮物を含まない培地)で取得した参照データが必要です。サンプル準備とデータ取得の間に同じ時間間隔を確保し、アガロース参照サンプルの8実験データセットを取得してください。これは、アガロース基準と二相性サンプルの両方が同じ期間インキュベートされていることを確認するためです。

5. CONDENSE-MTデータセットの処理と結果の可視化

1. すべてのCONDENSE-MT実験(合計8件、 補足図3A)を以下の方法で処理します。
   1. SSB 2のqsineをウィンドウ関数として設定し、qsinを使って46^番目の スライスを抽出します。fp、1Dで水ピークを位相化し、位相パラメータを2Dデータセットに保存し、xf2で2D処理、そしてsplit2Dでこれら46スライスを抽出します(ポップアップウィンドウのさらなる入力:r – 46 – 11)。
      注:これにより、異なる照射オフセットで取得した46の1Dスペクトルを抽出し、同じデータセット内の11から56の1D処理実験として保存されます(補足図3A、1000 Hz CONDENSE-MT実験用)。
   2. 残りの7つの実験についても同じことを繰り返します。各実験から複数のスライスを確認し、位相と基準が正しいか確認します(図2C)。必要なら手動で修正してください。適切な位相と基準値が適切な定量化の前提条件です!
2. アガロース参照サンプルと逆転回復実験で取得したデータに対して同じ手順を繰り返し、位相調整のために24番目のスライスを抽出し、split2D(r – 24 – 11)を使用します。
3. 提供されたMatlabコードを使って取得したデータを適合させます。スクリプトの具体的な指示に従ってください。
4. まずアガロース参照サンプルのフィッティング解析を行い、凝縮物がない場合の背景パラメータを得ます。 read_CONDENSE_MT_data コードはまず処理済みNMRデータを読み取り、split2Dコマンドによって生成される1次元スライスに水共鳴信号を積分します(補足図3B参照)。
5. 統合の境界線は個別に設定し、Matlabで1次元スペクトルの参照をプロットし、積分境界を評価します(補足図3C参照)。このコードはさらにデータを正規化し、照射オフセットとパワーの関数としての水の正規化された積分をCONDENSE-MTモデル²⁰に適合させます。 read_CONDENSE_MT_data は正規化された積分を変数 integral_water_real_allに保存し、その後のフィッティングに使用されます。
6. CONDENSE-MTデータを適合させる前に、アガロースまたは凝縮水が存在する水の_R1 緩和率を決定してください。
   注:水逆転回復実験のフィッティングは 、CONDENSE-MT_full Matlabスクリプトの最初のセクション(またはアガロース参照データの場合は CONDENSE_MT_referenceMTpool スクリプト)内で行うことができます。実験のファイル名と経路、実験IDを入力して 、Inversion_Recovery Matlab スクリプトを実行することができます(補足図4A、セクション1)。必要に応じて、このスクリプトで1次元スライスの数や積分境界を調整できます。後者はTopSpinで使用される処理パラメータに依存します。このセクションでは、R1の水の流量を決定し、それをCONDENSE-MTデータのフィッティングに必要な P.R1w 変数に保存します。
7. アガロースデータについては、正規化された積分をそのまま使い、 CONDENSE_MT_referenceMTpool スクリプト( function_1MT 関数を呼び出す)を用いてフィッティングに行います。
8. 凝縮液の定量化には、アガロースのフィットパラメータを入力として、凝縮サンプル上で取得したデータのグローバルフィッティングを行います(補足図4A参照)。これにより、アガロースメッシュの物理的特性を適合の定数値として固定し、凝縮液がアガロースメッシュに埋め込まれた追加の効果を定量化することが可能になります(図2E)。
9. 凝縮液の定量化は CONDENSE-MT_full スクリプトで行い、 function_2MT Matlab関数を呼び出します。計算最適化の初期パラメータはfit0(補足図4B)で与えられます。適合のパラメータ不確実性は分散共分散行列を導出するヤコビ行列を用いて計算されます(補足図4B)。
10. 実験データからのモデル予測の残差偏差に似たフィット偏差によってフィットの質を評価します。さらなる品質管理のために、適合度を実験データと組み合わせてプロットしてください(補足図4C)。

結果

ここで説明するLLPS REDIFINEプロトコルは、FUS N端末ドメイン(NTD)に適用されました。FUS NTDは微分子濃度^19,21の常温条件下で容易に位相分離します。この特定のサンプルは、200μM濃度で、pH7.5の200mM KClを含む30 mM HEPESバッファーで、0.5%の通常のアガロースを含んで準備されました。位相分離後も、FUS NTD信号は凝縮位相で観測可能です(図1A,B)。これにより、LLPS REDIFINEの研究に最適な候補となります。すなわち、ほとんどのLLPSに敏感なタンパク質は、凝縮相でも通常観察可能な長く本質的に無秩序な領域を含みます。しかし、より構造化されたタンパク質ではそうではありません。

REDIFINEフィット(図1Dおよび図3A,B)により、このFUS NTDサンプルに複数の独自のパラメータが明らかになりました。具体的には、希釈相および凝縮相における拡散係数(D_dil および D_cond)、凝縮相におけるタンパク質の集団(ν_cond)、平均液滴サイズR、および間期透過率pを決定しました。液滴の大きさと透過率は、凝縮相から希薄相への間相交換速度kd₌3p/Rを定義し、交換ダイナ^{ミクスに関する情報}を得ることを可能にします。

これらの結果は異なる方法で可視化できます(図3B)。スパイダープロットを用いて、異なる条件やサンプル間で結果を比較できます。一方で、REDIFINEパラメータをモデル内で図示的に表現することで、最も効果的に可視化できます。REDIFINEは、1つのサンプルだけでわずか数時間でラベルフリーの結果をすべて提供します。

FUS NTDのNMR信号は凝縮相でも検出可能なため(図3C)、緩和コントラストの欠如によりCONDENSE-MTは適用されない可能性が高いです。CONDENSE-MTデータセットをFUS NTDに記録し、アガロース参照サンプルとFUS NTDの二相サンプル間でMTプロファイルに違いは認められませんでした(図3C)。これにより、CONDENSE-MT手法はこの特定のFUS NTDサンプルには適用できません。

しかし、CONDENSE-MTは繰り返し拡張RNA凝縮物の動的な特徴付けを提供します(図3C,D)²⁰。CONDENSE-MTは、従来のNMRでは信号が観測できないにもかかわらず、凝縮相におけるRNAを一意に特徴付ける複数のパラメータを提供できることに注意してください(図3D)。得られたパラメータは、凝縮水とバルク水(k_凝縮水H2Oおよび_{kH2O、凝縮水})間のプロトン交換速度、凝縮水のT₂緩和速度(T_2、凝縮水)、そして縮合時の生体分子の動的停止の程度を反映したT 2緩和率(T_2,水)です).この最後のパラメータは、バルク、希釈水、そしてゆっくりと凝縮した水のタンブル速度の線形の組み合わせです。_R2,水の値が高いほど凝縮水中の水の濃度が増え、全体の見かけ水_R2レートが²⁰に上昇します(図2Eおよび図3D)。

データとコードの利用可能性

LLPS REDIFINEの生データおよび処理コードはZenodoリポジトリで利用可能です:https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787。CONDENSE-MTの生データおよび処理コードはZenodoリポジトリ https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697 に保存されています。処理にはMATLABが必要です。また、本記事(補足コーディングファイル)にも含まれています。

図1:REDIFINEのワークフロー。(A) 拡散測定により、凝縮試料において複雑な二相拡散崩壊曲線が得られます。その結果得られる崩壊には、凝縮相および希釈相における種の拡散係数、個体群、液滴サイズ、間相交換率を表す非畳み込みパラメータが含まれます。(B)これらの孤立したパラメータを復号するには、勾配強度だけでなく拡散遅延も変化させて擬似3Dデータセットを記録する必要があります。これらの測定から得られるすべてのスライスが適切にフェーズされ、基準補正されることが定量化に絶対に必要です。(C) 測定および処理されたデータの品質を確認した後、これらの1次元スライスはMATLABコードに入力され、解析と最終プロットが行われます。(D) その後、非線形計画解法器によってデータフィッティングを行う。フィッティングおよび得られるパラメータは、二相FUS NTDサンプルの図示です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:CONDENSE-MTワークフロー(A) 水共鳴で観察された独自のCONDENSE-MTプロファイルは、凝縮した生体分子と水の存在による広がりを示しています。(B)放射線のずれごとに水が観測されます。(C) 定量化のためには、すべてのスペクトルが正しく位相処理されていることが不可欠です。(D) 異なる照射オフセットで水共鳴を獲得した後、実験を異なる照射出力で繰り返します。これにより、照射オフセットと照射出力(E)の両方の関数としての相対水信号のデータセットが得られます。その後、非線形計画ソルバーによってデータがフィッティングされます。フィッティングおよび得られるパラメータは、バイフェーズ31xCAG RNAサンプルの図示です。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:REDIFINEおよびCONDENSEのMT結果の提示。 (A) サンプルや条件間での比較分析のためのREDIFINEパラメータのスパイダープロット表現。(B) REDIFINE由来のパラメータを示す回路図モデル(拡散係数、液滴半径、分割、間相交換率など)。(C) 500 Hz照射下のアガロース基準および二相FUS NTDの比較。
(D) 31xCAGリピート拡張RNA凝縮体のCONDENSE-MT解析で、コンデンセートに関連する磁化伝達効果のパラメータ抽出と可視化。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:REDIFINEのセットアップ。 (A) FUS N末端ドメインは二相凝縮試料の準備時に依然として観察可能です。強いアミド/アミノおよび芳香族陽子シグナルが観察されます。(B) 拡散DOSY実験で観察されたシグナル崩壊は、希薄相タンパク質集団の崩壊が速く、凝縮相ではタンパク質の崩壊が遅いことを示しています。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:REDIFINE処理。 (A) REDIFINEフィッティングに使用されるMatlabコードで、特定の入力が必要なパラメータをハイライトしています。インセットは積分領域の選び方を示しています。(B) フィッティング関数の最小化とその結果。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:CONDENSE-MTセットアップ。 (A) CONDENSE-MT分析に必要なNMR実験の概要。水逆転回収実験(実験番号5)および異なる照射出力でのCONDENSE-MT実験(実験番号11-18)を含む。(B)、(C) CONDENSE-MTデータセットの水1次元スペクトルの読み取りと積分のためのMatlabスクリプトの概要。CONDENSE-MTの実験はmainからmain8として示されます。統合境界は water_left と water_rightとして入力されます。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図4:CONDENSE-MT処理。 (A) CONDENSE-MTフィッティングスクリプトの最初のセクション(水反転回復フィッティング(セクション1)および事前に決定されたアガロース背景パラメータの入力を含む。(B) CONDENSE-MTデータセットのフィッティングおよびパラメータ不確実性の決定。フィットの開始パラメータはfit0内で設定可能です。(C) CONDENSE-MTフィッティング結果のプロット断面。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補助コーディングファイル:REDIFINEおよびCONDENSE-MT解析用のMATLABスクリプト。BRUKERトップスピンコードは、REDIFINE 拡散データセットおよびCONDENSE-MT磁化-転送データセットの処理・フィッティングに使用されるMATLABスクリプトを設定するためのコードです。これにはデータ統合、緩和解析、グローバルモデルフィッティングルーチンが含まれます。スクリプトを実行するにはMATLABが必要です。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、二相性生体分子凝縮体のラベルフリーNMR特性評価に関する詳細なプロトコルを提示しました。これには、LLPS REDIFINEという2つの新興手法と、補完的でありながら直交する実験であるCONDENSE-MTが含まれます。一般的に適用可能ですが、LLPS REDIFINEは生体分子検出に依存しており、適切な分析のために相分離時に観測可能な信号が必要です。これによりREDIFINEの適用範囲は制限されることがありますが、大多数の凝縮液には、通常NMRで観察可能な本質的に無秩序な領域を持つタンパク質が含まれています。特に、タンパク質:RNAおよびRNA単独凝縮体において、凝縮相における生体分子の信号は相分離時に検出限界を超えて広がります。凝縮相への分配係数が高い場合、従来のNMRではほとんど信号が観測されません。CONDENSE-MTは、希釈相と凝縮相の分子種間の緩和度の大きな差に依存する水観察技術として、この検出限界を回避しています。

REDIFINEとCONDENSE-MTの両方を成功させるには、適切な試料準備が鍵となります。したがって、アガロースを混合物に移す前に完全に溶けていることを確認し、移送中に気泡が広範囲に発生しないようにし、最初にガラス壁に付着しやすい二相混合液でNMRチューブを確実に満たす十分な材料を確保することが重要です。CONDENSE-MTでは、アガロースバックグラウンドが別途定量されるため、一定の体積を再現可能に移すことが極めて重要です。生体分子の凝縮相と希薄相間の分配が非常に歪んだり、相間交換が非常に遅いまたは速い場合、REDIFINEやCONDENSE-MT効果は存在しないか、弱すぎて信頼できる定量化が困難になることがあります。これはこれらの技術の重要な限界の一つに似ています。しかし、そのような場合には温度の上昇や下げが役立つことがあります。なぜなら、温度は分子の分配や化学交換速度を強力に調節する要因だからです。データセットが取得されると、初期または前回の適合パラメータを入力値として計算最適化を繰り返し行うことで、最適なフィッティング結果が得られることが多いです。

強いREDIFINEおよびCONDENSE-MT効果をもたらす系では、これらの実験は他のラベルフリー手法では達成が難しい分子分配、交換速度、分子動力学に関するラベルフリーの洞察を提供します。さらに、NMRベースの手法は一般的に非侵襲的であり、サンプルを複数回分析したり長期間保管したりできるため、凝縮液の特性を時間経過で監視することが可能です。これは、長期間にわたる補完的な手法で研究が困難な病的凝縮液成熟の文脈で特に重要です。

膜のない細胞小器官は一般的に複雑な構造を持つ多成分アセンブリであるため、この技術の将来的応用には、ますます高度化する多成分凝縮液モデルシステムの検出と特性評価、さらに細胞内NMRによる細胞内解析が含まれます。しかし、これにはREDIFINEやCONDENSE-MTをこのような複雑なシステムに適応させる必要があり、その実現に向けての取り組みが進行中です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
700 MHz アバンス NEO NMR分光計	ブルーカー・バイオスピン	https://www.bruker.com/en.html	データは700MHzのNMR分光器で取得されます。
トップスピン	ブリュークル・バイオスピン	https://www.bruker.com/en.html	データはこのソフトウェアで処理されます。
FUS NTDタンパク質		該当なし	このタンパク質は当研究所で発現・精製されています
31xCAG RNA		該当なし	RNAは私たちの研究室で生成・精製されています
MATLAB	マスワークス	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	データはこのソフトウェアを使って処理・可視化されます。