インターロックパルサタイル注入技術と顕微外科的血管修復を用いた脳転移のための高精度前臨床マウスモデルの工学

サマリー

本研究は、インターロックパルサタイル注射および顕微外科的修復を用いた腫瘍細胞への一時的な頸動脈内注射 による 脳転移の高精度マウスモデルを確立します。脳血流を維持し、総頸動脈の閉塞を防ぎ、腫瘍転移率の向上と死亡率の低減を伴う優れた前臨床モデルを提供します。

要約

脳転移は依然として壊滅的な臨床問題です。脳転移研究における大きな課題は、転移過程を正確に再現する高品質なモデルが不足していることであり、それによってがん細胞がどのように脳内で定着するかについてのメカニズム的洞察を可能にしています。従来の頸動脈内注射による脳転移モデルでは、総頸動脈の永久結紮(CCA)が必要になることが多く、これは脳血行動態を変化させ、血脳関門(BBB)の完全性を損なう。このプロトコルは、脳転移の高精度マウスモデルを構築するための洗練された手法を提示します。中核的な革新は、腫瘍細胞送達のためのインターロックパルサタイル注入(IPI)技術と、穿刺部位での顕微外科的動脈再建によるCCAの生理的血流回復に関するものです。従来のCCA結紮モデルと比較して、IPI–顕微外科修復アプローチは周術期死亡率を有意に減少させ(2.86%対25.71%)、脳転移の定着率を増加させました(94.12%対65.38%)。IPI技術は、頸動脈内注射時の細胞逆流を最小限に抑えるために、タンデムシリンジ構成を採用しています。腫瘍細胞注入後、CCAは立体顕微鏡下で顕微外科用縫合を用いて綿密に修復され、永久閉塞を防ぎます。これにより、腫瘍細胞侵入時の脳血行動態とBBBの完全性が維持されつつ、手術成功率を大幅に向上し死亡率を低減します。転移性頭蓋内病変は、連続的な生物発光画像診断および組織病理学によって検証されます。この手法は、脳転移の病態生理を研究し、前臨床的治療評価を行う上で優れたプラットフォームを提供し、転移過程を再現します。

概要

脳転移は成人における最も一般的な悪性脳腫瘍のタイプであり、原発性脳腫瘍の約10倍の頻度で発生します^1。全身性がん患者の10%〜20%が進行期に脳転移を発症すると推定されており、これは死亡の主な原因の一つです^1,2。原発がん治療において大きな進歩があったにもかかわらず、脳転移患者の予後は依然として芳しくありません。脳転移患者の1年生存率は20%未満です³。なぜ、どのように一部のがんが脳に転移するのか、そのメカニズムは依然として不明です。治療上の課題は、脳転移の独特な生物学的特徴、特にBBBの存在、独特の脳免疫微小環境、そして神経膠細胞との複雑な腫瘍細胞の相互作用によってさらに複雑化^{しています。}

脳転移に関する薬理力学的研究と病因学の研究は、人間の疾患過程を正確に再現する精密な前臨床動物モデルに大きく依存しています。現在の脳転移の動物モデルは広く使われていますが、主に頭蓋内定位植え込み、静脈内または尾静脈注射、心内注射、または頸動脈注射6,7,8,9,10に基づいています。しかし、これらのモデルは人間の疾患進行を不完全に反映しており、生理的フロー条件下で腫瘍細胞が完全なBBBを横断するなどの重要なステップを捉えきれないことが多い¹¹。静脈内および心内注射は脳特異的腫瘍形成効率を低くし、広範な頭蓋外転移を引き起こし、重大な脳転移が始まる前に動物の早期死亡を引き起こすこともあります¹²。従来の頸動脈内注射法は頭蓋内腫瘍の形成率を上げますが、CCAの永久結紮が必要です。脳血行動態を変化させることで、この結紮は同側の脳領域に虚血を誘発し、腫瘍細胞の送達に必要な生理的血流パターンを損なう可能性があり、その結果、腫瘍細胞の空間分布や脳内のコロニッチなニッチに影響を与えます(^13,14)。

脳転移の病態生理をより忠実に模倣できる高品質な動物モデルが非常に重要です¹⁵。理想的な脳転移モデルは、腫瘍細胞が脳血管にホーミングすること、血液脳関門(BBB)を越えた漏出、脳微小環境との動的相互作用を含む全転移カスケードを再現すべきです¹⁶。高いモデル忠実度は、メカニズム的研究と治療評価の両方において極めて重要です^。しかし、既存の頸動脈内注射モデルは、特に正常な脳血流の維持や循環腫瘍細胞の自然な分布といった重要な生理的条件を完全に再現していません。

既存の脳転移の前臨床モデルの限界を克服するため、IPI技術と顕微外科的動脈修復を基に、転移カスケードをより正確に再現する高精度動物モデルが開発されました。この方法は腫瘍細胞注射後の一時的な動脈閉塞を含み、その後動脈穿刺部位を細かく修復して同側CCAへの生理的血流を回復させます。このアプローチはモデルの一貫性と成功率を高めるだけでなく、何よりも脳の自然な血行動態を維持することでBBBを維持できます。脳血流の妨げを最小限に抑えることで、修正された頸動脈内注射モデルは、脳転移の自然な定着過程をより正確に再現する高精度なプラットフォームを提供し、脳転移のメカニズムの調査や治療法の評価に優れたツールを提供します。

プロトコル

すべての動物実験は中国科学院生物物理研究所の動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました(承認番号:SYXK2021124)。あらかじめ定められたエンドポイントに達した動物は、中国科学院生物物理学研究所の動物管理・利用委員会(IACUC)および動物安楽死に関するAVMAガイドライン(2020^年)に従って安楽死されました。

1. 単一セル懸濁液の準備

1. 完全なRPMI-1640培地にB16F10および4T1細胞を培養し、胎児用牛血清(FBS)10%とペニシリン・ストレプトマイシン1%を補足しました。
2. 細胞は5%のCO₂を含んだ加湿インキュベーターで37°Cに保ちます。
3. 手術前日にルシフェラーゼ発現を確認し、マイコプラズマ汚染の有無を確認します。
4. 手術当日、細胞が80%の合流度に達したら、まずリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、その後トリプシン化(0.25%)を37°Cで3分未満洗浄します。
5. 細胞に10%FBS含有のRPMI-1640培地を加え、0.25%のトリプシンを消滅します。
6. セルを300 ×g で3分間遠心分離します。残留血清を除去するためにPBSで細胞を2回洗浄し、その後ヘモサイトメーターで数えます。
7. トリパンブルー除外アッセイを用いて、注射中に細胞の生存率が90%〜95%のままであることを確認しましょう。
8. PBS中に細胞を2×〜10⁶ mLで再懸浮させます。注射まで細胞を冷蔵保存してください。
   注:ルシフェラーゼ標識されたB16F10および4T1細胞が使用可能です。B16F10が代表例として紹介されています。

2. マウスの準備および周術期準備

1. 7〜8週齢のオスのC57BL/6マウスを使います。
2. 低体温症を防ぐために、手術プレートの下に温熱パッドを敷きましょう。手術の30分前に温熱パッドをつけてください。
3. すべての手術器具、手術用プレート、ハウジングケージはオートクレーブで滅菌してください。立体顕微鏡と手術台を75%エタノールで消毒してください。
4. オートクレーブで滅菌できないその他の品目は、紫外線照射と75%エタノールで消毒する必要があります(図1A)。
5. 麻酔前にマウスの体重を測り、術前体重を基準として記録してください。
6. 遠心分離機チューブにトリブロモエタノール10gを加え、その後三次アミルアルコール10mLを加えます。チューブを振ってトリブロモエタノールが完全に溶けるまで続けます。
   注:トリブロモエタノールは死亡を含む有害な副作用を引き起こす可能性があります。麻酔深度を注意深く監視してください。
7. 溶液を0.22μmフィルターでろ過し、100%純正溶液を準備します。
8. 100%の純正溶液を0.9%のNaCl生理食塩水または希釈剤で薄め、2.5%の作動液(1:40希釈)にします。新たに調製された各作動液の有効性はマウスでの麻酔効果を試験する必要があります。
9. マウスには、0.2 mL/10 g体重で2.5%トリブロモエタノールを腹膜内注射(ip.)で麻酔します。必要に応じて、元の麻酔量の3分の1に増量して麻酔を延長します(図1B)。
   注意:麻酔薬の投与量は体重に応じて調整し、呼吸を継続的にモニタリングしてください。
10. 軽い刺激(例:つま先をつまむ)を加え、運動反応がないことを観察して、マウスが完全に麻酔状態にあることを確認してください。
11. 麻酔後に首の部分の毛を剃り、つま先の切り傷をつけます。
12. 目の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗りましょう。
13. マウスを手術用プレートに置き、4本の四肢と上切歯を粘着テープで固定します(図1C)。
14. 呼吸数とつまみ反射を評価して麻酔深度をモニタリングし、マウスが痛みがなく動かずにいられるようにします。
15. 動物は無作為に実験グループに割り当てられ、画像解析はグループ割り当てを盲検された研究者によって実施されました。

3. IPI技術の標準的な外科手術および顕微鏡修復

1. 首部をポビドンヨウ素溶液で消毒し、皮膚を完全に乾燥させてから進行します(図1D)。
2. マウスを無菌手術用ドレープで無菌的にドレープし、首部分のみを露出させます(図1E)。
3. 組織を引っ込めるために細かい鉗子を用い、無菌外科用ハサミを用いて約0.8〜1cmの頸椎中央切開を行います(図2A)。
4. 右頸動脈鞘を露出させるために、細かい角度の鉗子を使って浅い筋膜およびその下の筋肉を鈍的に剥離します(図2B1、 図2C1)。
5. 右外頸動脈(ECA)を頸動脈鞘から分離し、右外頸動脈を結紮して細胞が外頭蓋枝に漏れるのを防ぎます(図2B2、 図2C2)。
6. 右CCAを頸動脈鞘内で慎重に隔離し、血管の外側および下側にある迷走神経を保存します(図2C1)。
7. ゴム手袋の小さな切れ端と生理食塩水で湿らせた綿球を、隔離された右のCCAの下に枕として置き、血管を持ち上げて安定させます。
   注:CCAを高くすることで血管が安定し、正確な穿刺と注入が可能になります。(図2B4、図2C4)
8. 綿球の遠位と近位のCCAに開いたループの開いた結び目を2つ結び、その後近位結び目を結びます(図2B3、図2C3)。
9. 遠位の緩んだ結び目の近くに微小血管クリップを装着し、CCAの血流を一時的に遮断します(図2B4、図2C4)。
10. がん細胞の移植
    1. インターロックパンク
       1. 右CCAの高くなった部分を32Gの針で、ベベルを上に向けて刺します。
       2. 刺し傷を保ちながら最初の注射器を抜きましょう。
       3. がん細胞の懸濁液を渦混合し、100μLをマイクロリットル注射器に吸い込み、気泡が吸い込まれないようにします。
       4. マイクロリットル注射器の針先をステップ3.10.1.1で作成した穿刺部位に挿入し、注射を開始しずに安定して保持して細胞送達前に安定した位置を確保します(図2B5、図2C5、 補足図1)。
          注意:刺し穴には32Gのシリンジ、注射にはマイクロリットルのシリンジを使用して、安定した位置とコントロールされた投与を確保してください。 補足図1は 2本の注射器のパラメータを示しています。32G注射器の外径は0.22mm、マイクロリットル注射器針は0.26mmで、安全な挿入と制御された注射を容易にしています。
    2. パルサタイル注入(図2C5)
       1. ステップ3.9で装着した微小血管クリップを取り外します。
       2. マイクロリットル注射器を通じて腫瘍細胞懸濁液をICAに注入し始めます。
       3. 持続的な圧力ではなく、パルサタイル注入運動でサスペンションを注入し、注射器プランジャーを小さなパルスで優しく前進させます。
       4. 懸吊を投与する基準のいずれかを用いてください:心臓周期基準(8心周期ごとに約1μLの細胞懸濁を、遠位内頸動脈の脈動逆行性血流に導かれて注入);または、注入速度基準(60 μL/minを超えないように)~1 μL/sを注入します。
       5. 注射中に血管を監視してください。懸濁液が腔内を通過する際に赤い血管が一時的に透明になり、穿刺部位の周囲に目に見える漏出が見られないことが成功した投与を示します。
       6. 注射が終わったら、マイクロリットルの注射器を慎重に引き抜いてください。
       7. 直ちに遠位結び目を制御的に締めて血管を密閉し、逆流を最小限に抑えてください(図2B6、 図2C6)。
          注:パルサタイル注射は過剰灌流を減らし、頭蓋内圧上昇のリスクを最小限に抑えます。
11. 顕微外科的修復(図2B6、 図2C6)
    1. 10-0ナイロンの顕微外科縫合糸を用いて穿刺部位を防水的に閉じ、針の入口と出口を欠損縁のすぐ隣に配置することで血管漏れを最小限に抑え、腔内開通を保ちます。
    2. 顕微外科用縫合針を血管壁の穴に高倍率で通し、一時的に縫合糸を外したままにします。
    3. 手術部位をヘパリン化生理食塩水で洗浄してください。
    4. 縫合糸は2〜3つの四角い結び目で固定します。
    5. 縫合糸の自由端を約1〜2mmに切り詰め、緩みを防ぎつつ異物の負担を最小限に抑えます。
       注:IPI技術および顕微外科的修復の標準的な手術手順は 補足ビデオ1に記載されています。

4. CCAの血流回復

1. 近位の結び目を徐々に緩めていきましょう。
2. 内腔を洗浄して、潜在的な微小な血塊を取り除きます。過剰出血がないか観察するために、手術室に乾いた綿球を置いてください。
3. 穿刺部位からの活動的な流出が確認されなかったら、慎重に遠位結び目を緩めて頸動脈血流を回復させます(図2B7、図2C7)。

5. 修理成功確認

1. 脈動の回復
   1. CCAで強い脈動が確認され、再灌流が成功していることを示します。
2. 開通性と血管の完全性を確認する
   1. 修復部位を点検し、狭窄がなく、内腔が開通し、近位血管部分と連続しているかを確認しましょう。

6. 傷口灌漑と閉鎖

1. 手術部位を 非ヘパリン化の生理食塩水 で十分に洗浄し、ゴミや血栓を除去します。
2. 皮膚切開部は連続縫合で閉じ ます。
   注意:手術フィールドを湿らせ、すべての操作は組織損傷を最小限に抑えるために優しく行ってください。

7. 術後ケア

1. 輸液サポート:手術直後、周術期の体液損失を補うため、0.5〜1 mLの温かい無菌生理食塩水を皮下投与します。
2. 感染予防:手術期間が40分を超える場合は、エンロフロキサシン(5 mg/kg、1日1回)を3日連続で投与します。処置が40分未満の場合は抗生物質は不要です。
3. 栄養と水分補給:術後少なくとも1週間はハイドロゲルまたは柔らかい食品を提供し、十分な水分補給と栄養を確保しましょう。
4. 日々のモニタリング:毎日の健康診断を行い、円を描く行動、神経障害、創傷感染、体重減少の観察を行います。
5. 術後経過の予想:最初の48時間で、マウスは活動の低下、軽度の毛毛の勃起、術前基準値の最大15%までの体重減少が見られることがあり、その後徐々に回復します。
6. 鎮痛:メロキシカム(5 mg/kg、皮下投与)を1日1回、2〜3日間投与し、痛みを和らげ回復を促進します。

8. 動物モデル確立の成功に対する評価基準

1. 体重管理
   1. マウスの体重を毎日測り、体重を記録しましょう。
2. 臨床評価
   1. 姿勢や円を描く行動など、毎日臨床症状を評価してください。
3. 生物発光イメージング
   1. 画像機器とコンピューターの電源スイッチをオンにしてください。
   2. 生物発光イメージング解析ソフトウェア(バージョン4.7.2)を起動し、「初期化」をクリックして生物発光イメージングシステムを初期化します。
   3. 初期化中、イメージングシステムの制御パネルの温度状態ランプが赤色に表示されます。温度状態ランプが緑色に変わった後にのみ画像処理を行います。
   4. 麻酔中の誤嚥を防ぐため、画像検査の6時間前からマウスに食事と水を与えないようにしてください。
   5. 撮影基質は10 mg/mLの濃度で準備し、検査中は光から保護されます。10 μL/g体重で注入量を計算します。
   6. 画像検査のためにマウスを拘束してください。左下腹部の注射部位を75%の医療用アルコールで洗浄してください。
   7. 注射部位の腹壁を優しく刺激し、針が腸に入るリスクを最小限に抑えます。
   8. 腹壁を貫通した後、血液がないことを確認するために優しく吸引し、その後ゆっくりと 生体内 イメージング基板を注入します。
   9. 基質注入後4分30秒後に、マウスを麻酔誘導チャンバーに移します。
   10. 3%イソフルランで麻酔を誘導します。右回りやつまみ反射が失われたら、維持のためにイソフルラン濃度を2%に減らします。
   11. 麻酔をかけたマウスをイメージングチャンバーに入れ、鼻のコーンが口と鼻を完全に覆うようにします。イメージングチャンバーの扉をしっかり閉めろ。
   12. イメージングシステムのコントロールパネルで「Luminescent」をイメージングモードとして選択してください。露光時間を手動で60秒に設定してください。「写真」「オーバーレイ」「アラインメントグリッド」を選択してください。
   13. 3匹のマウスを撮影するために視野角をDに設定してください。撮影の高さを1.5cmに調整してください。励起フィルターは「ブロック」、排出フィルターは「オープン」を選択してください。
   14. 基質注入から10分後に「取得」をクリックして画像を撮影します。
   15. 画像取得後、ツールパレットに移動して「ROIツール」を選択します。「サークル」ツールを使って関心地域(ROI)を区画し、「ROIを測定」をクリックすると定量データが得られます。
4. 組織学的解析
   1. 実験的エンドポイントで脳組織を採取し、組織学的解析を行います。
   2. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色による転移性病変の特定と確認。

9. 人道的な終点

1. 動物福祉と倫理基準の遵守を確保するために、即時安楽死の基準としてあらかじめ定められた人道的評価点が設定されています。
2. マウスは二酸化炭素(CO₂)吸入によって安楽死させられ、その後、死亡を確認するための二次的な物理的手段として子宮頸部脱臼が行われます。
3. 以下のいずれかの条件が発生した場合は、直ちに安楽死を行うべきです。
   1. 神経学的欠乏
      1. 運動障害:運動失調(不安定な歩行、揺れ)、円回り、麻痺、片麻痺、または震え。
      2. 行動や意識の変化:無気力、呆然、昏睡。
      3. 頭蓋内圧上昇の兆候:異常な姿勢(例:苦痛を示す前かがみ)や頭部の傾斜。
      4. けいれん:全身性または局所性けいれん。
   2. 体重と生理機能の変化
      1. 体重が20%を超える、または腫瘍の負担や重度の衰弱により自立して食事や水分ができない場合。
      2. 呼吸困難(あえぎ声やパンティング)や尿失禁。
   3. 腫瘍の状態
      1. 腫瘍関連潰瘍、感染、壊死が検出された場合は直ちに実験を終了してください。
   4. 最大耐受腫瘍負荷
      1. マウスは週に2回、発光画像検査を受けます。
      2. 頭蓋内腫瘍の信号が指数関数的な成長段階(例:2回の連続画像検査で倍増)に入ると、神経学的モニタリングは1日2回に増やされます。
      3. 安楽死は、発動失調や発作の発症直後に、発光信号の値に関係なく即座に実施されました。

結果

生物発光イメージングと定量解析
標準化された手術プロトコルに従い、最適化された脳転移マウスモデルは術後の連続 生体内 画像検査で安定した頭蓋内生物発光信号を示しました。頸動脈内接種後4週間にわたる連続 体内 生物発光画像(図3A)および定量解析(図3B)により、転移性B16F10細胞が脳微小環境内で増殖することが示されました。術後の体重モニタリングでは、腫瘍を持つマウスがPBS対照群と比較して進行性の体重減少を示しました(図3C)。Kaplan–Meierの生存解析では、B16F10注射群の生存率がさらに低下していることが示されました(図3D)。

脳サンプルの大まかな形態学的検査

ディスカッション

脳転移を正確に再現する堅牢な前臨床モデルは、病態生理学的メカニズムの解明と治療効果の評価に不可欠です。従来の頸動脈内注射モデルでは総頸動脈の結紮(CCA)が必要であり、これは脳血流を非生理的に変化させ、同側虚血性損傷を引き起こし、血脳関門(BBB^)を破壊^{する可能性があります。}このモデルには3つの大きな制限があります。単一注射に伴う腫瘍細胞逆流による腫瘍形成率の低下;連続注射による高い術中死亡率;頸動脈結紮による転移過程の不正確な再現。これらの制約に対処するため、本研究は最適化された頸動脈内注射技術と顕微外科的動脈修復を組み合わせることで、高忠実度で再現性の高い脳転移モデルを確立し、生理的な脳血行動態とBBBの完全性を維持します。

従来のモデルでは、単一注射器によ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10-0 マイクロサージカル縫合針	Lingqiao	2650798	共通頸動脈穿刺部位の修復用マイクロサージカル縫合
100 µL マイクロリットルスライス	Bolige Tools	100UL	インターロック脈動注入中の腫瘍細胞送達用マイクロリットルスライス
100 µL ピペット	Eppendorf	3123-000250	手術部位の生理食塩水灌流用ピペット
32G 1 mL インスリンスライシ	Kindly	YY0497	初期動脈穿刺部位作成用インスリンスライシ
4-0 シルク縫合糸	Ethicon	W501	皮膚切開閉鎖用縫合材
4T1 乳癌細胞株	中国科学院生物物理研究所 盛電 実験室より入手	CRL-2539	頸動脈内脳転移モデリング用腫瘍細胞株
75% エタノール	Annjet	Q/371402AAJ008	注入部位清浄用消毒剤
7–8週齢のC57BL/6Jオスマウス	Charles River Laboratories	1.10011E+17	B16F10 脳転移モデル実験用実験動物
8週齢のBALB/cメスマウス	Charles River Laboratories	1.10011E+17	4T1 脳転移モデル実験用実験動物
角度付きチップ鋏	Kewo Tools	—	組織解離と血管操作用マイクロサージカル鋏
B16F10 メラノーマ細胞株	中国科学院生物物理研究所 盛電 実験室より入手	CRL-6475	頸動脈内脳転移モデリング用メラノーマ細胞株
生体発光イメージング解析ソフトウェア	Living Image (バージョン4.7.2)	—	生体発光イメージングデータ解析用ソフトウェア
DMEM	Xigong Bio Tech	M1805	腫瘍細胞維持用細胞培養培地
エンロフロキサシン（抗生物質）	MCE	HY-B0502	術後感染予防用抗生物質
エオシンY溶液	Beyotime	E301879	エオシン染色用組織染色試薬
眼軟膏	白雲山	H44023089	麻酔中の目の保護用眼科軟膏
胎児牛血清（FBS）	Pan Sera Tech	ST30-3302	細胞培養培地用血清サプリメント
GraphPad Prism	バージョン4.7.2	—	生存曲線と定量データ解析用統計解析ソフトウェア
ヘマトキシリン溶液	Beyotime	C0105S	ヘマトキシリン染色用組織染色試薬
イソフルラン	H.F.Q. Biotechnology	101357015	イメージング手順中の吸入麻酔薬
IVIS Spectrum 生体発光イメージングシステム	Lumina Series III	—	生体発光イメージング用イメージングシステム
メロキサカム（鎮痛剤）	齊魯動物保健	150252467	術後鎮痛用非ステロイド性抗炎症薬
マイクロサージカルはさみ	Kewo Tools	—	組織解離用マイクロサージカルはさみ
ミニ血管クリップ	Zheyong Tools	200521	共通頸動脈の一時的閉塞用マイクロ血管クリップ
針保持器	江鑫ツール	1420 20Cr13	マイクロサージカル縫合を扱う外科器具
パラホルムアルデヒド（4%）	中聖万達科技	20240411	組織学的分析前の脳組織保存用固定剤
ペニシリン	Gibco	1758-9324	細胞培養用抗生物質
ポビドンヨード溶液	四環牌	Q/PGSHW0009	外科的皮膚消毒用消毒液
RPMI-1640培地	Xigong Bio Tech	12-115F	腫瘍細胞増殖用細胞培養培地
Scilogexミキサー	Scilogex	MX-S	腫瘍細胞懸濁液を均質化するボルテックスミキサー
蒸気インジケータテープ	3M-Comply	1322-24MM	オートクレーブ消毒された外科器具用滅菌インジケータ
ステレオ顕微鏡	オリンパス	SZ61	マイクロサージカル手順中の可視化用顕微鏡
Zeiss Stemi 508 ステレオ顕微鏡	Zeiss	Stemi 508	高倍率手術可視化用ステレオ顕微鏡
滅菌生理食塩水（0.9%）	科隆	25M14D07	手術部位の湿潤を維持する滅菌灌流液
ストレプトマイシン	Gibco	1758-9319	細胞培養用抗生物質
手術用ドレープ	大方	001-2016	手術部位を分離する滅菌ドレープ
手術用手袋	Ansell Medi-grip	210-64005	手術中に使用する滅菌手袋
トリブロモエタノール	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	外科手順用注射麻酔薬
超音波ドップラー	Mindray S7 SCI	—	頸動脈血流評価用高解像度超音波システム