in vitro 調節T細胞の機能分析:増殖と分化に焦点を当てる

サマリー

このプロトコルは、調節T細胞がエフェクターT細胞の増殖および分化に与える影響を調査するための in vitro 共培養戦略を提供します。

要約

調節T(Treg)細胞は免疫恒常性の維持に重要な役割を果たします。Treg細胞の機能異常は、自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、感染症、がんなど様々な疾患に関連しています。Treg細胞の操作は、自己免疫疾患、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、アレルギー疾患などの炎症性疾患の治療法として考えられています。従来の in vitro Treg細胞抑制アッセイは、主にTreg細胞がエフェクターT(Teff)細胞増殖に与える抑制効果を評価します。しかし、増殖に加えて、T細胞の分化は免疫機能を果たすためにも重要です。したがって、本プロトコルは、Treg細胞がTeff細胞の増殖および分化に与える影響を調査するための修正 されたin vitro Treg細胞抑制アッセイを提供します。このプロトコルでは、まずマウスTreg細胞およびナイーブT細胞の調製を導入し、その後、Treg細胞がTeff細胞(Th1およびTh17細胞を含む)の増殖と分化に与える調節効果を研究するための共培養戦略、最後に共培養後のフローサイトメトリーの染色戦略を提示します。この Treg細胞のin vitro 機能解析は、T細胞の増殖および分極に対するT細胞の影響を調査するために利用できます。

概要

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺調節T(Treg)細胞は免疫恒常性の重要な媒介因子です^。Treg細胞は過剰な免疫反応を抑制し自己免疫耐性を維持し、免疫反応が正常な組織や臓器を損傷するのを防ぎます^。Treg細胞の操作は、自己免疫疾患、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主疾患、アレルギー疾患などの炎症性疾患の治療における潜在的な治療戦略と考えられ^{ています。}一方で、Treg細胞の機能を阻害することは抗腫瘍免疫を活性化する効果的な戦略と考えられています ^6,7。臨床研究では、自己免疫疾患、固形臓器移植、移植片対宿^{主疾患に対する}採用型調節性T細胞療法または低用量IL-2治療が調査されています^8,9,10。さらに、キメラ抗原受容体(CAR)-Treg細胞やT細胞受容体(TCR)-Treg細胞を含む遺伝子操作Treg細胞の研究も注目を集めています^11,12。

これまでのところ、Treg細胞療法は定期的な臨床治療として広く確立されていません。Treg細胞療法の臨床応用を支援するためには、その機能の体系的な研究と評価が重要です。in vitroで調節T細胞の機能を評価する一般的な戦略は、in vitro Treg抑制アッセイ¹³であり、これはエフェクターT細胞(Teff)細胞増殖におけるTreg細胞の抑制機能を検出できます。しかし、標準 的なin vitro のTreg抑制アッセイはTeff細胞の分化を評価していません。エフェクターT細胞の増殖と分化を同時に評価できれば、調節T細胞の機能に関するより多くの情報が得られる。

ここでは、修正 されたin vitro Treg細胞抑制アッセイ「in vitro functional analysis of Treg細胞」(図1)を提示します。このプロトコルは、Treg細胞がTeff細胞の増殖および分化に与える影響を調査するための in vitro 共培養戦略を提供します。

プロトコル

すべてのマウス実験は四川大学華西病院動物倫理委員会の承認を受けています(承認番号20250814006、20211212A)。この実験で使用されたすべてのマウスはC57BL/6遺伝子背景に基づいていました。

1. 解の準備

1. 蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを準備します:0.5%牛血清アルブミン(BSA)を含む1×PBS。
2. 磁気活性化細胞選別(MACS)バッファーを準備します:1×PBSを0.5%BSAと2 mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む。
3. 細胞培養培地を準備します:RPMI 1640培地(胎児用牛血清(FBS)、ピルビン酸ナトリウム1m、L-グルタミン2m、HEPES10m、βメルカプトエタノール55μM、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mLを含む。

2. C57BL/6マウスリンパ球の製剤

1. 生後6〜8週間のC57BL/6マウス(オスまたはメス)の脾臓および末梢リンパ節(LN)を無菌条件下で取り、50mLの遠心分離機チューブに5mLのFACSバッファーを入れます。
   注意:脾臓およびLNの解離は標準手順に従って行うべきです。
2. 70μmの細胞ストレーナーを50mLの遠心分離機管に置き、脾臓とLNをストレーナーに置き、5mLのシリンジピストンで組織を1分間優しく粉砕します。挽く際は、FACSバッファーでストレーナーを3回洗い流します。すべての組織を完全にすりつぶし、細胞を遠心分離機のチューブにすすいでください。挽いた後は、こしを外します。
3. 遠心分離機で4°C、350 g × 7分間。
4. 上澄液を取り出し、細胞ペレットを赤血球溶解バッファー3 mLに再懸濁し、室温で3〜5分間そのままにします。
5. すぐにFACSバッファーを遠心分離機管に15〜20 mLの容量で加えて溶解を終え、遠心分離機で4°C、350 × g で7分間遠心分離します。
6. 上清液を取り出し、FACSバッファー10mLを加え、細胞ペレットを優しく再懸浮させます。
7. 細胞懸濁液10μLを取り、トリパンブルー染色法で生きたリンパ球の総数を数えます。
   注:これらの細胞はCD45.2⁺ リンパ球です。

3. CD45.1マウスリンパ球の調製

1. 生後6〜8週間のCD45.1マウス(オスまたはメス)の脾臓とLNを無菌状態で取り、50mLの遠心分離機チューブに5mLのFACSバッファーを入れます。
2. 上記の手順に従ってCD45.1マウスのリンパ球を製製します。
   注:これらの細胞はCD45.1⁺ リンパ球です。

4. CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ ナイーブT細胞の製剤

注:このプロセス全体はMACS用のCD4⁺CD62L⁺ T細胞分離キットを使用します。MACSバッファーは4°Cで予冷されており、すべての遠心分離条件は4°C、350 × g で7分間行われます。

1. C57BL/6マウスから細胞懸濁液を採取し、遠心分離機で上清液を廃棄し、1×10〜⁸個の初期細胞ごとに遠心分離機チューブに400μLのMACSバッファーと100μLの^CD4+T細胞ビオチン抗体カクテルを加えます。優しく混ぜて、4°Cで暗闇で5分間孵化します。
2. ステップ4.1から10〜⁸ 個の初期細胞ごとに遠心分離機チューブに300μLのMACSバッファーと200μL×抗ビオチンマイクロビーズを追加します。優しく混ぜ、4°Cで暗闇で10分間孵化します。
3. MACSバッファー10mLを加え、遠心分離機で上澄液を捨てます。細胞ペレットを2 mLのMACSバッファーに再懸浮させます。
4. LS列を適切なMACSソーティング磁気分離器に置きます。カラムをすすぎるために3 mLのMACSバッファーを使用します。次の工程に進む前に、カラム内のバッファーが完全に排水されるまで待ちましょう。
   注:LSカラムの最大セルロード容量は2 ×^{10 9} セルで、正セルと負セルの両方を含め、最大捕獲できる正セルの数は1 ×^{10 8}です。通常、ここではマウス1本でLS列が1つだけで済みます。
5. ステップ4.3のセルサスペンションをLSカラムに負荷をかけます。細胞懸濁液が完全にカラムに流れ込んだら、3mLのMACSバッファーを使ってカラムを洗浄します。すべての流れる液体を新しい15mL遠心分離機チューブに集めます。
   注:これらは全CD4⁺CD25^– T細胞数です。
6. ステップ4.5で得られた全CD4⁺CD25^– T細胞を遠心分離し、上清液を廃棄して細胞ペレットを入手します。
7. 細胞ペレットに1×10〜⁸ 個の初期細胞ごとに800μLのMACSバッファーと200μLのCD62Lマイクロビーズを加えます。優しく混ぜ、4°Cで暗闇で10分間孵化します。
8. 遠心分離チューブに10mLのMACSバッファーを加え、遠心分離機で上清液を廃棄し、細胞ペレットを500μLのMACSバッファーに再懸浮させます。
9. MSカラムを適切なMACSソーティング磁気セパレーターに置き、1 mLのMACSバッファーでカラムを洗浄します。
10. セルサスペンションをMSカラムに載せます。懸濁液が完全にカラムに流れ込んだら、1mLのMACSバッファーを使ってカラムを2回洗浄します。
11. 磁気分離器からMSカラムを取り出し、新しい15 mL遠心分離機チューブに置きます。カラムにMACSバッファー1mLを加え、すぐにプランジャーを強く押し、磁気ビーズで標識された細胞を洗出します。
12. 細胞数を数え、遠心分離機で上清液を捨て、適切な培養液に細胞を再懸浮させ、チューブを氷の上に保管します。
    注:これらの細胞はCD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ナイーブT細胞です。通常、約8×10⁶から1 × 10^{7 CD4+}CD25^–CD62L⁺のナイーブT細胞は1匹のマウスから精製可能です。末梢リンパ節の導入は収量を増やすことができます。
13. 分離細胞の純度を測定する:5個×10個の分離されたCD4⁺CD62L⁺T細胞を1.5mL遠心分離管内の抗体溶液50μLに再懸濁します。
    注意:抗体溶液には、抗マウスCD4 PerCP-Cy5.5抗体、抗マウスCD62L FITC抗体、抗マウスCD25 PE抗体をFACSバッファーに1:100の比率で添加して準備します。
14. 暗闇で4°Cで20分間の培養後、細胞を洗浄するためにFACSバッファー1mLを加えます。細胞を遠心分離し、上清液を除去し、200μLのFACSバッファーに再懸濁させます。
15. フローサイトメトリーでサンプルの純度を検出します。
    注:フローサイトメーター解析の詳細については、機器の取扱説明書または先に報告されたプロトコル¹⁴を参照してください。単離T細胞サンプルでは、CD4⁺CD25^–CD62L⁺ の純度は95%以上であるべきです(図2)。

5. CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg富集細胞および抗原提示細胞富集非CD4⁺ 細胞の調製

注:このプロセス全体はMACS用にCD4⁺CD25⁺ Regulatory T細胞分離キットを使用し、キット内の指示は抗原提示細胞(APC)リッチの非CD4⁺ 細胞と^CD4+CD25⁺ Tregリッチ細胞を同時に取得できるよう最適化されています。MACSバッファーは4°Cで予冷されており、すべての遠心分離条件は4°C、350 × g で7分間行われます。

1. CD45.1マウスから細胞懸濁液を遠心分離機で採取し、上清液を廃棄し、10×8^個の初期細胞ごとに400μLの予冷MACSバッファーと100μLのCD4⁺CD25⁺ 調節T細胞ビオチン抗体カクテル100μLを加えます。優しく混ぜ、4°Cで暗闇で10分間孵化します。
2. 洗浄せずに、ステップ5.1から1.1^{の初期細胞} 1×1あたり、380μLの予冷MACSバッファー、200μLの抗ビオチンマイクロビーズ、20μLのCD25-PE抗体を遠心分離管に直接添加します。優しく混ぜて、4°Cで暗闇で15分間孵化します。
3. 遠心分離機チューブに10mLのMACSバッファーを加え、遠心分離機で上清液を廃棄し、細胞ペレットを1×10〜⁸ 個の初期細胞ごとに500μLのMACSバッファーに再懸浮させます。
4. LDカラムを適切なMACSソーティング磁気セパレーターに置き、2 mLのMACSバッファーでカラムをすいでいます。次の工程に進む前に、カラム内のバッファーが完全に排水されるまで待ちましょう。
5. ステップ5.3のセルサスペンションをゆっくりとLDカラムに負荷をかけます。細胞懸濁液が完全にカラムに流れ込んだら、2mLのMACSバッファーでカラムを2回洗浄します。すべての流れる液体を新しい15mL遠心分離機チューブに集めます。
6. LDカラムを磁気分離器から取り外し、新しい15 mL遠心分離機チューブに置きます。LDカラムに3mLのMACSバッファーを加え、すぐにプランジャーを強く押し込んでマイクロビーズ標識された非CD4⁺ 細胞を排出します。細胞数を数え、遠心分離機で、適切な細胞培養培地に再懸浮して1 ×^{10 7} cells/mLの細胞濃度にし、チューブを氷の上に置いたままにします。
   注:これらの非^CD4+ 細胞は主にマクロファージ、樹状細胞、B細胞などのAPCで構成されています。このプロトコルでは、これらの細胞はAPCリッチされた非CD4⁺ フラクションとして用いられます。
7. ステップ5.5で採取した全CD4⁺ T細胞を遠心分離し、上清液を廃棄して細胞ペレットを入手します。
8. 細胞ペレットに1×10〜⁸ 細胞ごとに900μLのMACSバッファーと100μLの抗PEマイクロビーズを加えます。優しく混ぜて、4°Cで暗闇で15分間孵化します。
9. MSカラムを適切なMACSソーティング磁気分離器に置き、500μLの予冷MACSバッファーでカラムを洗い流します。次の工程に進む前に、カラム内のバッファーが完全に排水されるまで待ちましょう。
10. ステップ5.8のセルサスペンションをゆっくりとMSカラムに負荷をかけます。細胞懸濁液が完全にカラムに流れ込んだら、1 mLのMACSバッファーでカラムを2回洗浄します。流れる液体を新しい15 mL遠心分離機チューブに集めます。
    注:この時点で流動液中の細胞はCD4⁺CD25^– T細胞です。
11. MSカラムを磁気分離器から切り離し、新しい15 mL遠心分離機チューブの上に置きます。カラムに1mLのMACSバッファーを加え、すぐにプランジャーを押し込んで磁気ビーズで標識されたCD4⁺CD25⁺ Tregリッチ細胞を回収します。
12. 細胞数を数えた後、遠心分離して懸濁液を除去します。ペレットを十分な培養培地に再懸浮させ、最終濃度を2 ×^{10 6} mLにし、チューブを氷の上に置いたままにします。
    注:これらの細胞はCD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg豊か細胞です。通常、1匹のマウスから約8×10⁵ から10 × 10⁶ CD4⁺CD25⁺ 細胞を精製できます。末梢リンパ節の導入は収量を増やすことができます。
13. 分離されたCD4⁺CD25⁺ Treg富む細胞の純度を決定します:それぞれ5個×10個の分離されたCD4⁺CD25⁺ Treg富む細胞と5個×10個⁴個のAPCリッチ非^CD4+細胞を取り、50μLの抗体溶液に再懸濁します。
    注意:抗体溶液は、抗マウスCD4 PerCP-Cy5.5抗体および抗マウスCD25 PE抗体をFACSバッファーに1:100の比率で添加して準備してください。ここで同じ抗マウスCD25 PE抗体を用いて、CD4⁺CD25⁺細胞が十分に標識されており、非CD4⁺画画にCD4⁺CD25⁺ T細胞が存在しないことを確認します。Treg細胞をより厳密に同定するために、抗マウス用のFoxp3 PB抗体を用いた細胞内染色も可能です。
14. 暗所で4°Cで20分間の培養後、細胞を洗浄するためにFACSバッファー2mLを加えます。細胞を遠心分離し、上清液を除去し、200μLのFACSバッファーに再懸濁させます。
15. フローサイトメトリーでサンプルの純度を検出します。
    注:CD4⁺CD25⁺ 細胞の頻度は、Treg濃縮細胞集団の純度が実験要件を満たすために95%≥されるべきです(図2)。APC濃縮画として用いられる非CD4⁺ 細胞は、CD4⁺ T細胞を5%以下含めてはなりません(図2)。

6. 細胞増殖染料によるナイーブ^CD4+ T細胞の標識

注意:すべての遠心分離条件は4°C、350 g 、7分間の温度×です。PBSバッファーは使用前に室温に事前平衡されています。ラベリング工程は染料の焼入れを防ぐため、光保護の下で行われます。

1. 素朴なCD4⁺ T細胞懸浮液を取り、遠心分離機で上清液を廃棄し、細胞ペレットを得ます。
2. 細胞増殖染料eFluor 450をPBSで希釈し、室温で20μMの濃度を得る。
3. 10個^×7 個細胞に0.5mLのPBSを加えます。チューブを約45°傾けたまま、ピペットで50回上下にピペットして細胞を優しく再懸垂させます。
4. 細胞懸濁液に同量の細胞増殖染料溶液を素早く加え、最終的な細胞増殖染料濃度を10μMにします。チューブを約45°傾けたまま、ピペットで上下に50回ずつ混合し、細胞と増殖染料が完全に接触するようにします。
5. 光の照射を避けるために、すぐに遠心分離機のチューブをアルミホイルで包みます。室温で20分間培養します。細胞の集まりを防ぐために、5分ごとに優しく渦を巻いてください。
6. 遠心分離機管に予冷培養培地10mLを加え、優しく渦を巻いて染色を終え、遠心分離機で上清液を捨てます。
7. 細胞ペレットに5mLの冷却された培養培地を加え、遠心分離機で上清液を捨てて細胞を洗浄します。
8. 再び5mLの予冷培養培地を細胞ペレットに加え、細胞を再懸濁させます。
9. 細胞数を数え、遠心分離機で上清液を廃棄し、適切な培養液に再懸浮させて細胞濃度を2 ×^{10 6} mLにし、チューブを氷の上に置いてください。

7. Treg細胞の in vitro 機能解析の確立

1. 細胞培養に必要なサンプル数を計算し、2.5 μg/mLの抗マウスCD3抗体または所定誘導サイトカインを含む適切な量の培養培地を準備し、準備済みのCD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ ナイーブT細胞、CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg豊富細胞、APCリッチ非CD4⁺ 細胞を優しくボルテックスします。
   注意:応答T(Tresp)細胞としては、CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ ナイーブT細胞を使用してください。この例実験は、Treg細胞がTh1およびTh17細胞の分化および増殖に与える影響を研究しています。したがって、細胞培養用のサンプルは合計4種類あり、Treg豊富細胞の有無がいかも含めてTh1またはTh17誘導条件下で培養したTresp細胞です。
2. 48ウェルプレートに100μLのCD45.2⁺CD4⁺ ナイーブT細胞(1ウェルあたり2個×^10個5 細胞)を加えます。
3. 48ウェルプレートに100μLのCD45.1⁺ APCリッチ非CD4⁺ 細胞(1ウェルあたり10^{× 6} 細胞)を加えます。
4. 実験ウェルにCD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Tregリッチ細胞100 μL×(1ウェルあたり10^μ5 細胞)を加え、対照ウェルには100 μLの細胞培養培地を加えます。実験サンプル中のTreg濃縮細胞:Tresp比は1:1です。
   注意:TregセルとTrespセルの比率は必要に応じて設定可能で、複数の比率パネルを設計することも可能です。共培養ではTresp細胞の数が固定され、Treg細胞の数は必要に応じて変更可能です。通常、実験サンプルにおけるTregとTrespの比率は1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、0:1などです。さらに、各実験条件は三重に準備することでランダムな実験誤差を最小限に抑えることができます。ここでは明確化のために、過去の研究経験^15,16に基づき、1:1の比率を例として用いています。
5. 各ウェルに2.5 μg/mL抗マウスCD3抗体を含む細胞培養培地100 μLを加えます。
   注:抗マウスCD3抗体の最終濃度は0.5 μg/mLです。実験サンプルに加え、抗マウスCD3抗体を含まないブランク対照サンプルを設置します。このサンプルに抗マウスCD3抗体を含まないT細胞培養培地100μLを加え、非増殖T細胞の蛍光強度、すなわちピーク0の強度を測定します。これにより、増殖分布の正確な校正が可能になります。
6. 各ウェルに指定されたサイトカインを含む細胞培養培地100μLを加え、最終体積500μLにします。
   注:本実験では、組換えマウスIL-12 p70を最終濃度10 ng/mLで用い、組換えヒトTGF-β1を最終濃度2 ng/mL、組換えマウスIL-6を50 ng/mLで誘導します。
7. 残りの空井戸にPBS(500 μL/ウェル)を加え、プレートの湿度を維持しエッジ効果を軽減します。
8. 48ウェルのプレートを5%_CO2 インキュベーター、37°Cで3日間培養します。
   注:この共培養システムでは、可溶性抗マウスCD3抗体がT細胞活性化のための一次T細胞受容体(TCR)シグナルを提供し、APCリッチ型非CD4⁺ 細胞はT細胞を完全に活性化するための共刺激シグナルを提供します。TCRおよび共刺激シグナルは、プレート被覆された抗マウスCD3抗体および可溶性抗マウスCD28抗体によっても誘発されます。研究者は必要に応じて刺激方法を選択できます。

8. Treg細胞の in vitro 機能分析

注意:すべての遠心分離条件は4°C、350 g 、7分間の × gです。

1. 培養細胞を優しくピペットで再懸濁させ、懸濁液を1.5 mLの遠心分離機管に移します。細胞を遠心分離して上清液を取り除きます。
2. 各チューブに500 μLの細胞培養培地(5 ng/mL PMA、1 μg/mL イオノマイシン、1:1,000 希釈したゴルジプラグタンパク質輸送阻害剤)を加え、優しくボルテックスして細胞を再懸浮させ、37°Cの5%_CO2 インキュベーターで3時間培養します。
3. 遠心分離機で上清液を捨て、各サンプルにゾンビイエロー染料1回と1:100希釈した抗マウスCD16/32抗体を含むPBS50μLを加え、ボルテックスを放出して室温暗闇で15分間インキュベーションして死んだ細胞を標識し、Fc受容体を遮断します。
4. 遠心分離機で上清液を捨て、表面抗体カクテル50μLを加え、ボルテックスを使い、4°Cの暗闇で20分間培養します。
   注意:表面抗体カクテルを準備するために、FACSバッファーに抗CD4 PerCP-Cy5.5抗体、抗CD45.1 FITC抗体、抗CD45.2 APC-eFluor 780抗体を1:200の比率で添加してください。
5. 各遠心分離チューブ、遠心分離機に1mLのFACSバッファーを加え、上清液を廃棄します。
6. 各遠心分離機チューブに300μLの固定・透過液を加え、渦巻き、暗闇で4°Cで20分間培養します。
7. 各遠心分離機チューブに1× mLの透過化/洗浄バッファー1mlを加え、遠心分離機に入れて上清液を廃棄します。この洗浄工程を一度繰り返し、残留固定剤を完全に除去します。
8. 50μLのサイトカイン抗体カクテルを加え、ボルテックスを使い、4°Cの暗闇で40分間インキュベークします。
   注意:サイトカイン抗体カクテルを準備するために、パールム/ウォッシュバッファーに抗IFN-γ PE抗体および抗IL-17A PE-Cy7抗体を1:100の比率で添加してください。
9. 各サンプルを1 mLのパーム/ウォッシュバッファーで洗浄し、細胞を遠心分離して上清液を除去します。ペレットを300μLのFACSバッファーに再懸浮させます。
10. フローサイトメトリーによるTresp細胞の増殖と分化を測定します。以下のゲート戦略(図3)を用います。まず、リンパ球集団を全細胞の中にゲートし、細胞の残骸や不純物を除外します。次に、散乱信号に基づいてリンパ球間の単一細胞集団をゲート化すること;第三に、単一細胞間の生きた細胞集団をゲート化すること;第四に、生細胞間のCD4⁺ T細胞集団のゲート化;第五に、CD45.1⁺Treg豊富細胞群とCD45.2⁺ Teff細胞群をCD4⁺T細胞群間でゲート化すること;第六に、ゲートCD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺Th1細胞、CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺Th17細胞、そしてCD45.2+T細胞の非増殖CD45.2⁺CD4⁺ T細胞です。
11. フローサイトメトリーデータの取得を行い、フローサイトメトリーデータを解析します。
    1. 細胞増殖染料eFluor 450を標識した培養T細胞を細胞増殖染料の単一染色対照として使用します。細胞増殖染料で標識されていない培養T細胞で、ゾンビイエロー染料の単一染色対照を準備します。他の単一染色対照群には、使用した蛍光分子ごとに補償ビーズを用意します。
    2. 細胞増殖染料eFluor 450で標識し、抗マウスCD3抗体を使わず培養したT細胞を用いて、非増殖細胞のゲートを定義します。
    3. 培養T細胞を細胞増殖染料で標識し、ゾンビイエロー染料で染色し、すべての細胞表面抗体、および抗マウスIFN-γ PE抗体および抗マウスIL-17A PE-Cy7抗体のアイソタイプ対照を用いて、IFN-γ⁺CD4⁺ およびIL-17A⁺CD4⁺ T細胞のゲートを特定します。

結果

代表的な実験では、ナイーブT細胞をTresp細胞として用いて、Treg富む細胞がTh1およびTh17細胞の増殖と分化に与える影響を調査しました。この実験では、Tresp細胞は抗マウスCD3およびAPCリッチの非CD4⁺ 細胞によって活性化され、その後IL-12 p70誘導下でTh1細胞、またはTGF-β1およびIL-6誘導下でTh17細胞へ分化しました。これら2つの誘導条件下で、Treg豊富細胞を1:1の比率で添加した後のTresp細胞の増殖および分化の変化が研究されました。

CD45.2⁺CD4⁺ Tresp細胞をCD45.1⁺CD4⁺ Tregリッチ細胞と共培養したところ、Th1およびTh17誘導条件下で非増殖Tresp細胞の頻度が有意に増加した(図4A,B)。これはTreg豊富細胞の存在下でTresp細胞の増殖が抑制されたことを示しています。さらに、Treg豊か細胞との共培養...

ディスカッション

本研究では、Th1誘導条件下での共培養結果は、Treg細胞がTh1細胞の増殖と分化を抑制できるという以前の報告と一致しています^17,18。また、Treg濃縮細胞はTh17誘導条件下でTresp細胞の増殖を阻害しました。しかし、ここで用いられたTh17分極条件下では、Treg豊富細胞が存在するIL-17A⁺トレスプ細胞の頻度が増加し、これはTreg細胞がTh17細胞の分化を阻害するという従来の報告とは異なり^ます19,20。これらのデータは、Treg細胞がTresp細胞に与える効果が誘導条件や解析される読み取り値によって異なる可能性があることを示唆しています。このアッセイは、遺伝子操作または機能改変されたTreg細胞の機能を研究するためのin vitroモデルを提供できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL遠心管	Thermo Fisher Scientific	3457IW	または同等品
12.5 μL フィルター付きピペットチップ	Thermo Fisher Scientific	94420043	または同等品
1250 μL フィルター付きピペットチップ	Thermo Fisher Scientific	94420813	または同等品
15 mL 円錐形遠心管	Thermo Fisher Scientific	339650	または同等品
200 μL フィルター付きピペットチップ	Thermo Fisher Scientific	94420318	または同等品
48ウェルプレート	Corning Incorporated	3548	または同等品
5 mL シリンジピストン	Shifeng Medical	SB2-061(A)	または同等品
50 mL 円錐形遠心管	Thermo Fisher Scientific	339652	または同等品
50 μL フィルター付きピペットチップ	Thermo Fisher Scientific	94420258	または同等品
70 μm セルストレーナー	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	または同等品
抗マウスCD28抗体	BioXcell	BE0015-1	または同等品
抗マウスCD3抗体	BioXcell	BE0001-1	または同等品
抗マウスFoxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	または同等品
抗マウスIFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	または同等品
抗マウスIL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	または同等品
Beckman CytoFLEX S フローサイトメーター	Beckman Coulter	N/A	免疫細胞サンプルのフローサイトメトリデータ取得用
ウシ血清アルブミン (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	または同等品
C57BL/6マウス	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	一次リンパ球およびT細胞サブセットの分離用
CD25モノクローナル抗体 (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	または同等品
CD4+CD25+ 調節性T細胞分離キット, マウス	Miltenyi Biotec	130-091-041	細胞分離用
CD4+CD62L+ T細胞分離キット, マウス	Miltenyi Biotec	130-106-643	細胞分離用
CD45.1マウス	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	一次リンパ球およびT細胞サブセットの分離用
CD45.1モノクローナル抗体 (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	または同等品
CD45.2モノクローナル抗体 (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	または同等品
CD62L (L-Selectin) モノクローナル抗体 (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	または同等品
Cytofix/Cytoperm固定/透過化ソリューションキット	BD Biosciences	554714	または同等品
eBioscience細胞増殖染色eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	または同等品
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	または同等品
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	A5669701	または同等品
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	フローサイトメトリデータ分析用ソフトウェア
ゴルジプラグタンパク質輸送阻害剤	BD Biosciences	555029	または同等品
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	または同等品
ヒトTGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	または同等品
イオノマイシンカルシウム塩	Millipore Sigma	I3909	または同等品
LDカラム	Miltenyi Biotec	130-042-901	細胞分離用
L-グルタミン (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	または同等品
LSカラム	Miltenyi Biotec	130-042-401	細胞分離用
MACSマルチスタンド	Miltenyi Biotec	130-042-303	細胞分離用
MSカラム	Miltenyi Biotec	130-042-201	細胞分離用
OctoMACSセパレーター	Miltenyi Biotec	130-042-109	細胞分離用
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	または同等品
PEラットIgG1, κアイソタイプCtrl抗体	BioLegend	400408	または同等品
PE/Cyanine7ラットIgG2a kappaアイソタイプコントロール抗体	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	または同等品
ペニシリン-ストレプトマイシン	Thermo Fisher Scientific	15140122	または同等品
PMA	Millipore Sigma	P8139	または同等品
精製抗マウスCD16/32抗体	BioLegend	101302	または同等品
QuadroMACSセパレーター	Miltenyi Biotec	130-090-976	細胞分離用
組換えマウスIL-12 p70	PEPROTECH	210-12	または同等品
組換えマウスIL-6	R&D Systems	406-ML	または同等品
赤血球溶解バッファー (ACK溶解バッファー)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	または同等品
RPMI 1640培地	Thermo Fisher Scientific	11875093	または同等品
ナトリウムピルビン酸 (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070	または同等品
トライパンブルー溶液, 0.4%