この実験的なアプローチのための完全なテキストのプロトコルでは、利用可能です<a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">細胞生物学におけるカレントプロトコール。</a>

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トランスポートのための凍結、融解、およびパッケージング細胞

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

培養哺乳動物細胞は、細胞生物学の研究で​​広く使用されています。それは構造、機能、行動、及び培養中の細胞の生物学を維持できるようにするために特別なスキルの数が必要です。このビデオでは、細胞とどのように凍結ストックを回復するために凍結保存するために必要な基本的なスキルを説明します。

培養哺乳動物細胞は、細胞生物学の研究で​​広く使用されています。このビデオでは、細胞とどのように凍結ストックを回復するために凍結保存するために必要な基本的なスキルを説明します。

培養哺乳類細胞は、細胞生物学の研究で幅広く利用されています。細胞を維持するためには、多くの専門的な技術が必要です。

細胞培養は、幅広い研究および診断アプリケーションで利用されています。細胞の保存、細胞老化の回避、汚染リスクの低減、および遺伝的ドリフトの影響を最小限に抑えるために、将来の研究に向けて細胞株を保存することが望ましい場合があります。細胞株は、長期保存のために凍結保存することが可能です。このビデオでは、単層および浮遊状態で培養した細胞の凍結保存方法と、再び増殖させるための融解方法について解説します。こんにちは。私はイーストテネシーにあるMolecular Pathology Laboratories NetworkのDr.LANの研究室にいるRickyです。今日は、長期保存のための細胞の凍結方法と、液体窒素からの融解方法について説明します。ヒト接着細胞を凍結させるには、まずパッケージングの際と同様に、細胞をプレートから剥離させます。凍結保存には、対数増殖期にある細胞を使用するのが最適であることに留意してください。細胞が剥離し、血清または血清含有培地を加えてトリプシン反応を停止させた後、細胞懸濁液を滅菌遠心チューブに移し、2 mL加えます。同一ソースの同一サブカルチャーから得られた3皿以上の血清含有完全培地細胞を、1本のチューブにまとめることができます。室温で300～350 Gで5分間、細胞を遠心分離します。遠心後、上清を除去し、ペレットを4 °Cの10 mLで再懸濁します。完全培地に同量の4°Cの凍結保存液を加え、細胞を十分に混合した後、チューブを氷上に置いて細胞数をカウントします。ヘモサイトメーターを用い、ほぼコンフルエントになった25 cm²flaskから細胞を凍結させる場合は、凍結保存液で懸濁液をさらに希釈し、最終的な細胞濃度を100万個/mLまたは1000万個/mLに調整します。約3 mLの凍結保存液で再懸濁し、細胞懸濁液を1 mLずつラベル付きの2 mLクライオバイアルに分注します。バイアルのキャップをしっかりと締めてください。バイアルを-80°Cフリーザーに1時間から一晩置いてから、液体窒素保存フリーザーに移します。浮遊培養細胞の凍結保存は、単層培養細胞の凍結保存と原理的に同様です。主な違いは、浮遊培養では最初にトリプシン処理を行う必要がないことです。細胞懸濁液を遠心チューブに移し、室温で300～350 Gで10分間遠心分離します。次に、上清を除去し、ペレットを4 °Cの凍結保存培地を用いて1 mLあたり100万～1,000万個の密度で再懸濁します。次に、細胞懸濁液を1 mLずつクライオバイアルに移し、凍結させます。単層培養で行った方法と同様に、前章で説明した手順に従って凍結バイアルを融解し、回復させます。まず、液体窒素フリーザーから細胞バイアルを取り出し、直ちに37 °Cのウォーターバスに入れます。培地が融解するまでバイアルを絶えず撹拌します。通常、これには60秒未満かかります。融解後、開封する前にバイアルの上部を70% ethanolで拭き取ります。その後、融解した細胞懸濁液を、2 mLの温めた完全培地と20% fetal bovine serumを含む滅菌遠心チューブに移し、遠心分離を行います。室温にて 150 to 200 Gs で 10 分間遠心分離します。この工程により、遠心分離後の残留 DMSO が除去されます。上清を捨て、細胞ペレットを 1 mL 程度の少量の完全培地（20% FBS 含有）で緩やかに再懸濁させます。これを、適切な量の培地が入った適切にラベル付けされた培養プレートに移します。一般的に、5 to 20 mL の培地に対して 1 mL の細胞懸濁液が必要となります。次に、細胞を37°Cのインキュベーターに入れ、24時間培養します。5〜7日後、あるいは培地中のpH指示薬の色が変化した時点で、細胞がプレートに接着していることを確認し、培地を交換してください。細胞株が再構築されるまで、培養物は20% FBSを含む培地で維持してください。回収率が極めて低い場合、元の培養物のうち一部のサブポピュレーションのみが増殖している可能性があります。モザイク状であることが知られている細胞株を扱う際は、特に注意してください。培養物を輸送する必要がある場合、単層培養と浮遊培養のどちらでも容易に行うことができます。25 cmの組織培養フラスコ内で、細胞を単層でほぼコンフルエントになるまで、または懸濁状態で目的の密度まで増殖させます。単層培養の場合、まず培地を除去し、次にフラスコに新鮮な培地を満たします。輸送中にフラスコが反転した場合に細胞が乾燥するのを防ぐため、フラスコに培地を完全に満たすことが不可欠です。懸濁培養の場合、新鮮な培地を加えてフラスコを満たします。キャップを締め、パラフィルムで固定します。その後、液漏れを防ぐために、漏出防止仕様のプラスチック袋またはその他の漏出防止容器にフラスコを密封します。フラスコが破損した場合に備え、一次容器は二次断熱容器に入れられ、輸送中の極端な温度変化から保護されます。パッケージの外側には生物学的危険物ラベルを貼付します。通常、培養物は当日夜間配送または翌日配送の宅配便で輸送されます。以上で、接着細胞および浮遊細胞の両方におけるヒト細胞培養の凍結および融解方法について解説しました。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。

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Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  培養哺乳動物細胞は、細胞生物学の研究で​​広く使用されています。このビデオでは、細胞とどのように凍結ストックを回復するために凍結保存するために必要な基本的なスキルを説明します。

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