方法論記事

げっ歯類の新生児から一次分離した中脳ドーパミン細胞培養

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DOI：

10.3791/820

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2008年11月5日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Tufts University

この記事について

サマリー

一次解離中脳のドーパミン細胞の培養は、ドーパミン神経細胞のシナプス前の特性の調査を可能にする。彼らはリアルタイムドーパミン放出の動力学とタンパク質/ mRNAのドーパミンエキソサイトーシスの調節因子のレベルを監視するために使用することができます。ここで、我々は、齧歯類の新生児からこれらの培養物を生成する方法を示します。

要約

ドーパミン神経細胞の初代細胞培養を作成する機能は、他の脳内から全身の入力から分離におけるドーパミン神経細胞のシナプス前特性の検討が可能になります。私たちの研究室では、我々は炭素繊維のアンペロメトリーだけでなく、定量的PCRおよび免疫細胞化学を用いてドーパミン関連遺伝子やタンパク質の発現レベルを使用してドーパミン放出の動態を評価するためにこれらのニューロンを使用してください。我々は齧歯類の新生児からこれらの培養物を生成する方法このビデオでは、私たちはあなたを示しています。

プロセスは、皮質神経膠星状膠細胞のプレーティング、グリア基板による神経細胞培養培地のコンディショニング、新生児の脳の解剖、消化、抽出およびドーパミンニューロンのメッキとの神経栄養因子の添加を含むいくつかのステップが含まれます。細胞の生存を確認してください。

このような調製に適したアプリケーションは、電気生理学、免疫細胞化学、定量PCR、ビデオ顕微鏡（すなわち、細胞膜とリアルタイムの小胞融合の）、細胞生存アッセイおよびその他の毒性の画面が含まれています。

プロトコル

文化に先行する準備

注 ：彼らは増殖し、皿の底をカバーする時間を持てるように**グリア細胞は、事前に播種する必要があります。非定型または実験的な遺伝的背景を持つマウスの場合、遺伝子型の面でグリアとニューロン培養に一致することを確認してください。

注 ：** 1-7日解剖する前に、新鮮な神経細胞の培地を調製し、2ミリリットルと料理のグリア培地を交換する。

注 ：**解剖前日に、以下の項目は、一晩、UV光の下で残しておく必要があります。

  • 4解剖プレート
  • マイクロマグネチックスターラーバー2解離バイアル
  • 2バイアルキャップ（2小さな穴の上で突き）
  • スライドリング（および70％EtOH中コートを）広げ - ボックスも開いたままに
  • （10 -200μlの）黄色のピペットチップの少なくとも2フルボックス
  • 青色の1箱（100 -1000μl）ピペットチップ

文化の日

注 ：*一晩UVために省略されて何も触れないように忘れないでください！

フードの下で無菌環境を維持することが非常に重要です。

1）設定：

注 ：**はさておきパパインソリューションを作るためにすべての凍結成分を設定します。

  1. 70％EtOHで清潔なピンセット。滅菌黄色のピペットチップを使用して各先端をカバーする。そのボックス内の滅菌スライドリングを配置するために使用します。
  2. ホットプレート：
    1. 500〜600ミリリットルのdH 2 Oと大きな磁気攪拌棒に満ちた千ミリリットルビーカーにボンネットの下mini-magnetic/hotプレートを置きます。
    2. ちょうど水面上にビーカーに発泡スチロールのディスクを置きます。
    3. 発泡スチロールのディスクの小さな穴に温度計をスライドさせて。わずかに2を超えるように（34 ° Cの温度のため）と撹拌子をダイヤルは〜5月6日であるべき熱のダイヤルが必要です。
  3. PBS：
    1. 滅菌PBSを準備して（無菌維持するために、必ず4〜6ミリリットルで15滅菌15ミリリットルチューブを埋める
      手法）。
    2. フードの隣に氷上でチューブと株式のボトルを置きます。
  4. Carbogen：
    1. 半分に5ミリリットルstripetteを打破し、ゴム栓を介してプッシュ、stripetteの先端がストッパの広い方の端を突き出しているので。
    2. 400〜500ミリリットルのdH 2 O（stripetteの切れ口がのdH 2 Oにあるべき）と500ミリリットルフラスコに栓を置きます。
    3. フラスコの側面開口部にチューブを接続します。
    4. 黄色のピペットチップオフ先端をカットし、チューブの端（外向きにカット面を持つ）にこれを接続します。

      5ミリリットルstripetteの先端にcarbogenタンクを接続してください。

  5. パパインsol'nを準備します。
    1. *慎重な無菌操作を使用してください。
    2. 滅菌50ミリリットルチューブに混ぜる。
  6. 解離バイアルにフィルタパパインsol'n：
    1. 25ミリリットルstripette（OR場所20ミリリットル、プランジャシリンジの先端に新しい0.2μmのシリンジフィルターを介してSteriflipろ過ユニットと解離のバイアルへの転送を使用して、
      プランジ​​ャーを外し、シリンジへのパパインのsol'nのすべてを転送するstripette（25mL）を使用してください。
    2. ）解離バイアルにフィルタリングする。
    3. 、バイアルにキャップをキャップに穴を通して滅菌注射器を挿入し、シリンジのベースに滅菌0.2μmのシリンジフィルターを取り付けます。
    4. フィルタとパラフィルムこの内の場所にcarbogenを接続します。発泡スチロールディスク/ホルダーにバイアルを置きます。

      *マイクロマグネチックスターラーバーが動いている必要があります。
      *ガスはバイアル瓶にそれを作ることにしなければなりません。
      *温度は34で安定しなければなりません℃に

  7. 解剖の準備：
    1. ボンネットの下に解剖顕微鏡を持参してください。
    2. 、アルミ箔上のすべての解剖器具をレイアウトする70％エタノールでスプレー、過剰を取り除き、乾燥するためにボンネットの下におきます。
  8. 神経細胞培地を準備します。
    1. インキュベーター内で新鮮な神経培地の30ミリリットルのまま。
  9. アルミ箔の1大規模な二乗と12の小さな正方形をレイアウト。アルミ箔で断頭のはさみを残す。氷水で小さな発泡スチロールの箱を記入し、フードのすべての外側を残す。
  10. プレップ麻酔（0.075ミリリットルケタミンおよび0.075ミリリットルxzylazine）。
  11. 100枚のために少なくとも12仔（P0 - P2）を得る。マウスの場合、全体のゴミのための遺伝子型の一致があることを確認してください。遺伝子型が不明な場合は、別々の皿の上にそれぞれの子犬からプレートの細胞は、マウスの数字の正確な記録を保持し、それらを一致させる細胞培養皿でとグリア基質の遺伝的背景は、細胞培養にわたって均一であることを確認してください。

2）解剖

  1. 腹腔内注射による最初の動物を麻酔。動物は鎮静を示し、テイル - フリック試験に応答しないときは、30秒（低体温になるまで）のために氷に置きます。一つの小さなアルミ箔の正方形、デキャップをすすぐitationのはさみ、および70％EtOHでヘッド。
  2. 頭部がボンネットの下にアルミ箔の正方形と動きの上に物を落とさないように、首を切る。ゆっくりと氷冷PBSの15ミリリットルチューブに脳を取り除く。次の脳を除去しながら戻ってチューブを氷上に置きます。
  3. 氷上で3頭があるまで、これらの最初の手順を繰り返します。顕微鏡下の最初の解剖皿に全3脳とPBSを注ぐ。脳の適切なセクション（VTA）を取り外し、パパインsol'nにセグメントを配置する、転送ピペットを使用してください。第一のセグメントが入って行く時にタイマーを起動します。
  4. すべての脳をパパインで消化されるまで、前の3つの手順を繰り返します。消化のための平均時間は2時間にする必要があります。第一セグメントは、最後のものが入って行く時で約1時間にされているだろう

    違いを分割してみてください。

  5. *消化時：
    1. 槽内の温度が34であることを確認して℃である
    2. セグメントは、最初は、撹拌棒にくっついかもしれませんが、時間が経つにつれて広がるはず。そうでない場合は、バイアルの底部をタップします。

3）粉砕：

  1. 転送ピペットを用いて、滅菌15ミリリットルチューブ（過剰パパインsol'nを回避しようと）するために脳のセグメントを転送し、インキュベーターから温めておいたグリア培地の2ミリリットルでそれらを3回洗浄。チューブ内のグリアメディアを入れて後は、セグメントがセグメントを乱すことなく解決してから、慎重に、できるだけ多くのsol'nとして削除することができます。汚染を避けるために、ピペットを変えて下さい！

    **削除されるsol'nを保存しないでください。

  2. 新鮮な転送のピペットを使用すると、グリアメディアの2ミリリットルでtriturationsを始める。 25回ひいて粉にする（空気の泡にさせることを避けるため）と解離していないセグメントが解決するまでチューブを3分間放置します。下部のセグメントに影響を与えることなく、可能な限り多くのsol'nを削除し、KEEPに転送ピペットを使用してください。新しい（滅菌）15メートルのチューブに上清をしてください。
  3. 完全に解離するまで1000μlピペットおよび200μlのピペットを使用して、前の手順を繰り返します。
  4. トランスファーピペットで10回ひいて粉にする、または細胞が完全にsol'nに再懸濁されるまで。

4）めっきセル

  1. 各皿の内側のガラスだけでなく、可能な限りに中心として、鉗子の各先端部を覆う滅菌黄色のピペットチップを使用して、慎重にスライドリングをドロップします。
  2. 血球計算盤とカウントに細胞溶液の10μlを置く。 （ジャンクの質量を除く）。
  3. 10セルの数を掛けます。これにより、細胞/μlの数です。この番号で1,000,000-1,500,000を（または所望の密度）で割ります。これは、料理ごとに追加するμLの数です。
  4. あなたが適切なμL/皿を追加すると中央ウェル各皿の上のリングをスライドさせてピペットチップを使用してください。プレートそれらやさしくEVERY料理のためのヒントを切り替える。
  5. 100μlの（希薄化後の）各皿のスライドのリングの内側にGDNF sol'nを追加。
  6. この時点では、インキュベーターにトレイを置き、低温室での神経細胞培地をもたらす。
  7. 細胞は一晩沈殿することができます。
  8. 次の日：削除リング（どの料理用鉗子先端をカバーする新しい滅菌ピペットチップを使用して）

5）有糸分裂の阻害：次の日

  1. 1.8ミリリットル滅菌MEMに200μlのFDUの株式を追加することにより、1000X株式の1:10のFDUのアリコートを希釈する。
  2. 各皿の外側リングに20μlの希釈FDU sol'nを追加。多くの場合、ピペットチップを変更してください。カバーやインキュベーターに戻す。

    *次の7-10日のため、できるだけ少ない料理サイレント。感染したお料理をチェックし、感染の最初の兆候で、感染したすべての料理を取り外します。培養は、3週間以内にテストするための準備が整いました。

MEDIA /ソリューション

神経ミディアム

（200mLのために）

**ベスト洗浄/粉砕のための使用前に一晩フラスコからグリア細胞を条件なら

成分 量は ノート
BSA 5パーセント 0.5グラムフラクションV
MEM液 94.0ミリリットルシグマ
DMEM液体 80.0ミリリットルシグマ
F - 12液体 20.0ミリリットルシグマ
ブドウ糖45％液 1.50ミリリットルシグマソリューション
グルタミン200mmの 0.5ミリリットル小分けシグマソリューション
Diporzioコンク。 2.0ミリリットルシグマソリューション
カタラーゼ液 0.1ミリリットル
0.5Mキヌレン酸 200μlの 1NのNaOHで
HCL 5N 50μlの
  1. 250メートルの成分を（BSAが最後になる）組み合わせリットルペットボトル。
  2. フィルタ、ラベル、および冷蔵。

キヌレン酸
 （FW = 189.2）
0.5M = 94.6mg/ml
200μlの滅菌のアリコートに756.8mgKA/8ml 1N NaOHおよびピペット：8ミリリットルの在庫を確認



DiPorzioメディア

A）DiPorzioコンク。株式：

が必要 組み合わせる Alliquot
添加 溶剤 チューブ 量は ミリリットル ML /チューブ コンク。 量は ＃Aliq。
インスリン 20mMのHCL（1） プラスチック 250mgのボトル 10 1 25mg/ml 25mgを 10
トランスフェリンハンクの 500mgのボトル 5 1 100mg/ml 100mgの 5
SOD ハンクの 70mgボトル 14 1 5mg/ml 5mgの 14
プトレッシンハンクの 50mgの 3 0.12 20mg/ml 2.4mg 21
のNa 2 SEO 3 ハンクの 0.104mg 10 0.5 10μg/ml 5.2μg 20
T3 10mMのNaOHを 2mgを 10 0.1 0.20mg/ml 0mg 100
プロゲステロン 100パーセントエタノールガラス 12.5mg 10 0.05 1.25mg/ml ピペットを使用してください
コルチゾール 100パーセントエタノールガラス 20mgを 10 0.02 2.00mg / mlのピペットを使用してください

  1. 20mMの塩酸=41.5μlコンク。 HCl/25ml。
  2. 1mg/mlの在庫を確認し、10ミリリットルに104μl加える。



B）DiPorzioメディアストック：

添加 量（ml） 量（ml）X2 最終濃度。 μg/ mlの 最終濃度。モル濃度
プロゲステロン 0.05 0.1 0.06 200nmの
コルチゾール 0.02 0.04 0.04 125nM
ハンクスBSS 6.21 12.42
インスリン 1 2 25
のNa 2 SEO 3 0.5 1 0.01 30nmの
T3 0.1 0.2 0.02 30nmの
SOD 1 2 5
プトレッシン 0.12 0.24 2.4 15nM
トランスフェリン 1 2 100
  1. プロゲステロンとコルチゾールを追加するには、15ミリリットルpolyproylene滅菌チューブを使用してください。エタノールの蒸発を高速化するために吸引器のピペットと真空を使用してください：（エタノール液を吸引しないように非常に注意しながらチューブに半分と場所半分の方法で分解5ミリリットルstripetteを使用してキムワイプで所定の位置にしっかりピペットを保持し、先端をもたらす。ダウンチューブの側面にある500μLのマークへ。
  2. 彼らは上記のチャートに表示される順序で、その後のアリコートを追加。
  3. sol'nの曇りを作るインスリンの添加後、pHを中和するために1N NaOHを20μlのを追加します。 Sol'nは、黄色からピンクとすぐに明らかにするために行く必要があります。また、トランスフェリンの添加後、直ちにpHを中和し、沈殿物の形成を防止するために、1N NaOHを20μlの追加。
  4. 5アリコート（つのバッチ）に血清学的ピペットおよび除算に10ミリリットルを描く。
  5. ストア@ -20℃
  6. 一度に2バッチを行うことがある。

解離メディア

A.パパイン（1バイアル用）：

**右側の解剖前にメッキの一日を準備する。

成分 金額</強い> （注）最終濃度。
システイン水 7.8mL 1mmのシステイン
パパインの瓶のために（*190μlを変化
44.0mg/ml） 		20ユニット/ mlの（400台合計
sol'nの20ミリリットルの価値のための）
H＆Bコンク。 2mLの
Carbogen 95パーセントO2 + 5％CO2
塩酸5N 10μlの
0.5パーセントフェノールレッド 20μlの 0.001パーセント
0.5M Kynurenate 10μlの （1NのNaOHで）0.5

  1. 最初のシステインの水にパパインを追加。
  2. H＆B濃、kynurenate、塩酸、およびフェノールレッドを追加。
  3. 解離バイアルにフィルタ（のようなセットアップの方向で説明されている）とcarbogenに接続します。


B. H＆Bコンセントレート（5倍の100ミリリットル）：

成分 MW Powder/50ml H 2 O コンク。 （M） 組み合わせる（ml）を 最終濃度。 （MM）
NaClの 58.44 11.699グラム 4 14.5 116
塩化カリウム 74.56 3.728グラム 1 2.7 5.4
NaHCO 3の 84.01 4.2グラム 1 13 26
のNaH 2 PO 4 · H 2 O 137.99 6.90グラム 1 1 2
MgSO 4を 120.38 6.019グラム 1 0.5 1
EDTA（ED2 - SS）
292 シグマ5％（作る
5g/100ml株） 		0.134 0.3722 0.5
グルコース 180 シグマ45パーセント 2.5 5 25
TC H 2 O 62.93
  1. ストック溶液からの金額を組み合わせる。
  2. 4ミリリットルのアリコートに分ける。
  3. パパインを追加した後、システインの水に一定量を追加。

C.システイン水（1Xの157.5ミリリットル）：

成分 MW コンポーネント
粉体（MG） 		H 2 O（ml）を 株式濃（MM） 組み合わせる（ml）を 最終濃度。 （MM）
CaCl 2の 147.2 736 10 500 0.6 1.9mmの
システイン 121.7 （1.5） 24 20mMの（0.02M） 10 1.27
（0.88）
TCの水 146.9
  1. 4℃で0.5M塩化カルシウムの在庫sol'n ° Cを作成してください
  2. システインの使い方の一例のsol'nを作成し、他の成分と結合し
  3. 4で15.75ミリリットルと店舗の10のアリコートに分ける° C


GDNFの準備

  1. 一定分量の準備：
    1. 滅菌脱イオン水の2.4mLで5μgGDNFの滅菌、凍結乾燥ペレットを溶解する。このGDNF sol'n =2.08μg/mLの濃度。
    2. 滅菌cryovialsに76.9μlのアリコートに2.08μg/mLGDNF sol'nを配布する。バイアルあたりこの= 160ng。
    3. -20℃で保存
  2. 文化に加えて：
    1. 毎8皿1アリコートを解凍。
    2. 723.1μl神経メディア/アリコートを添加することにより一定量を希釈する。これは160ng/800μlGDNFのsol'nを行います。
    3. mL当たり10ng GDNFの最終濃度は各シャーレの培地の液2mlにこのsol'n 100μLを加える。


FDU準備
FDU - sol'n 1000X在庫：

成分 量は （注）最終濃度。
ウリジン 247 mgの 16.5 mg / mlの
5 - FDU（5 - fluorodeoxyuridine） 100 mgの（ボトル） 6.7 mg / mlの
TCの水 15ミリリットル

  1. 16.5 mg / mlのウリジン15mlの余りを行います。
  2. 6.7 mg / mlのsol'n FDUを作るためにFDU 100mgのボトルに15ミリリットルウリジンsol'nを追加。
  3. -20℃で200μlのアリコートと凍結に分ける

使用するために希釈する。

  1. 非神経細胞の増殖を抑制する。 1.8ミリリットルのMEMに200μlの株式を追加することにより、1000X株式1:10に希釈する。
  2. 各皿の外側リングに20μlの希釈したFDUを追加。多くの場合、ピペットチップを変更してください。カバーやインキュベーターに戻す。

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ディスカッション

方法は、全身または in vivoアプローチでそうでなければ利用できない、中央ドーパミン神経細胞の形態学的および神経化学的特徴の高分解能を可能にするここで説明する。

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謝辞

作業はDK065872（ENP）、生物医学研究における優秀スミスファミリー財団賞（ENP）、F31 DA023760（BMG、ENP）とP30 NS047243（神経科学研究のためのタフツセンター）によってサポートされていました。

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材料

材料は、プロトコルのテキストに含まれています。

参考文献

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

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PCR GDNF FDU

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